Инфузории как тест-объекты

Аргументирование последнего утверждения начнем издалека — с описания биологических особенностей этих тест-организмов.

Инфузории — это одноклеточные эукариотические организмы, то есть у них есть ядро (а у многих видов инфузорий даже два ядра). Почти все клетки человека и других высших животных имеют ядра, а бактерии — прокариоты (безъядерные). Инфузории были одним из любимых объектов биологов еще лет сто назад, но и сейчас они остаются в центре внимания. Совсем недавно расшифровали геном инфузорий из рода Tetrahymena (рис. 2), состоящий из 27 тысяч генов. Кстати, геном человека содержит примерно столько же генов — 25 тысяч.

Рисунок 2 — Инфузория Tetrahymena thermophila, геном которой полностью расшифрован.

Эти одноклеточные — в основном свободноживущие организмы, которые в воде и почве поедают бактерии и водоросли. Они — необходимое звено в трансформации органики, их вклад в биологический круговорот веществ не менее важен, чем у бактерий. Живут инфузории практически везде: в пресных и соленых водах, почве, и число их видов, по разным источникам от 7 до 10 тысяч.

Характерная особенность инфузорий — относительно быстрая изменчивость, которая позволяет им адаптироваться к самым разным условиям. Инфузории живут и в тундровых озерах, и в тропиках, и даже в горячих источниках с температурой до 50 °C. Они приспосабливаются и к разному минеральному и органическому составу среды, а также к присутствию растворенных газов. Например, Paramecium caudatum может жить как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Эту высокую адаптивную способность обеспечивает колоссальное количество генов, большинство которых в повседневной жизни инфузориям не нужны, но включаются, когда условия меняются.

По мере того как простейшие адаптируются к условиям среды, перестраиваются все их жизненные функции, изменяются скорость движения, темп размножения и способность поглощать пищу, а также форма и размеры тела. Но если среда не меняется, то свойства инфузорий остаются стабильными, это и позволяет использовать их как тесты. Конечно, это относится только к инфузориям, культивируемым в лабораторных условиях.

В биотестах на инфузориях проще всего фиксировать изменение подвижности, гибель и скорость размножения. Например, можно смотреть изменение подвижности за 15−30 мин; гибель отдельных клеток за 1−4 часа; снижение скорости размножения за 1−3 суток; гибель популяции за 4−30 суток. Зачем так много параметров? Дело в том, что наблюдать за изменением подвижности недостаточно для оценки токсичности. Поскольку на движение у простейших расходуется всего 1% энергии общего обмена, то подвижность только незначительно отражает те изменения, которые происходят при отравлении токсичными агентами. Гибель отдельных клеток — достаточно надежный показатель, но с его помощью невозможно выявить низкие концентрации токсикантов. Оценка скорости размножения — биотест с большей чувствительностью, по нему можно определять и небольшие концентрации вредных веществ. Если сочетать все тесты, то результат получается надежный.

В большинстве методик биотестирования просто подсчитывают клетки до начала и в конце опыта. Как правило, это делают визуально под микроскопом, что весьма утомительно. Естественно, такая технология не нашла широкого применения.

На кафедре биохимии МГУ Прикладной биотехнологии мы разработали прибор (рис. 3), в котором клетки подсчитывает специальная компьютерная программа. Такая автоматизация существенно облегчает биотестирование, тем более что прибор позволяет использовать два вида инфузорий — Tetrahymena pyriformis и Paramecium caudatum (их размеры 0,03 Ч 0,05 мм и 0,06 Ч 0,35 мм). Тест проводят в два этапа: Paramecium caudatum, также известную как инфузория-туфелька, используют для предварительного выбора концентраций, а по динамике роста тетрахимен судят о воздействии на клетку какого-то вещества или пищевого продукта.

Двухэтапный биотест (рис. 4 и 5) подсластителей показал, что если добавлять ацесульфам калия, цикламат натрия и сахарин в концентрации 2%, то уже через 20 минут инфузории-туфельки погибают.

Если уменьшить концентрацию вдвое, то все инфузории выживают во всех подсластителях. В 2%-ных растворах трех других подсластителей — глюкозы, сорбита и сукралозы выживают все инфузории в течение двух часов.

Рисунок 4 — Выживаемость инфузорий Purumecium cuudutum в 2%-ных растворах подсластителей.

На втором этапе биотестирования, с инфузориями Tetrahymena pyriformis, использовали 1%-ные растворы.

Оказалось, что самое плохое действие на тетрахимен оказывают ацесульфам калия и сахарин. Сукралоза и цикламат менее вредны, а сорбит вызывает даже больший прирост клеток, чем глюкоза. С учетом первого этапа, где цикламат действовал на клетку так же, как сахарин, этот подсластитель относим к группе добавок, негативно влияющих на клетки.

биотестирование пищевой инфузория.

Рисунок 5 — Рост инфузорий Tetrahymena pyriformis за 20 суток в средах с 1%-ным содержанием подсластителей. Контроль — среда с глюкозой.

Мы попробовали исследовать также натуральные пряности. Добавление экстрактов кардамона и перца душистого стимулирует рост культуры, а экстракт мускатного ореха инфузориям не очень понравился.

Что же с усилителями вкуса? Среди них самый опасный — глутамат натрия (рис. 6): во всех пробах с этой добавкой прирост культуры клеток значительно меньше, чем в контроле.

Рисунок 6 — Рост клеток Tetrahymena pyriformis в средах с добавлением усилителей вкуса.

Ранее мы говорили, что современный подход к определению безопасности пищи не позволяет точно узнать, насколько опасны смеси химических веществ. Поэтому мы предлагали инфузориям не только отдельные вещества, но и продукты (рис. 7).

Мы посмотрели, как растут тетрахимены на четырех видах мясных продуктов: колбаса вареная, буженина, ветчина варено-копченая и вареное мясо. Интересно, что буженина с таким же содержанием белка, как в вареном мясе, дала такой же маленький прирост клеток, как колбаса. Это говорит о том, что в ее состав входили пищевые добавки (скорее всего, консерванты), которые ингибируют рост и размножение клеток. В дополнение к результатам биотестирования мы посмотрели, как меняется активность пищеварительных ферментов пепсина и химотрипсина в присутствии этих мясных продуктов. Тут тоже оказалось, что активность ферментов при «переваривании» буженины меньше, чем в ветчине и вареном мясе. Получается, что качественная коптильная жидкость, которую добавляют в ветчину, да и традиционное копчение менее опасны, чем консерванты в буженине.

Рисунок 7 — Результаты биотеста на инфузориях мясных продуктов.

На инфузориях мы проверили консерванты, красители и загустители. Одновременно мы оценили активность пищеварительных ферментов в пробах, содержащих эти добавки. Результаты всех опытов хорошо соотносились друг с другом. Мы показали, что те добавки, которые вызывали уменьшение прироста культуры, как правило, действовали угнетающе на ферменты человека.

Конечно, одноклеточные тест-организмы имеют гораздо меньше ферментных систем, чем человек, и в целом устроены проще. Но без сомнения, инфузорию можно рассматривать как интегральный биологический датчик с определенными параметрами, подходящими для пищевых биотестов. Например, кислые пептидазы есть и у человека, и у инфузории. Это известно давно, а мы доказали, что различные пищевые добавки ингибируют и пепсин, и рост культуры. Системы, общие для инфузории и человека, как правило, дают схожие ответы на компоненты пищи, поэтому оценка с помощью инфузорий довольно достоверна. Выявить всю совокупность ферментных систем инфузорий, соответствующих системам человека в токсикологическом плане, — задача, которую мы сейчас решаем.