Методология анатомических исследований стебля овса посевного для целей селекции

Овес посевной является ценной пищевой и кормовой культурой [1, 2, 3]. Его зерно характеризуется высоким содержанием крахмала, белка и незаменимых аминокислот. При совместном посеве овса с зернобобовыми культурами получают питательную кормовую зеленую массу. В связи с этим селекции овса уделяется большое внимание в Беларуси и за рубежом [1, 4]. Традиционно при подборе родительских пар и отборе высокопродуктивных растений учитывают габитус растений, морфологию цветка и соцветия, индивидуальную продуктивность и качество зерна, а также устойчивость к комплексу неблагоприятных биотических и абиотических факторов. Вместе с тем неиспользованным резервом информации для проведения отборов является учет признаков анатомического строения стебля. Поэтому целью наших исследований явилась разработка методологии анатомического анализа стебля овса для нужд селекции. Задачами данной работы было выявление общих закономерностей анатомического строения стебля короткостебельных сортообразцов овса посевного и обоснование методов гистолого-анатомических исследований стебля для совершенствования селекции на продуктивность и устойчивость к полеганию.

Взаимосвязь структуры и функций является одним из основных теоретических положений, обеспечивающих понимание эволюции и индивидуальной продуктивности растений. Этой проблеме и ее прикладным аспектам посвящены многочисленные научные работы, связанные с анатомией и гистологией культурных растений из семейства мятликовые. В первую очередь это работы по структурной ботанике [5], систематике [6], физиологии [7] и селекции мятликовых [8]. Наиболее полные анатомические исследования стебля проведены у рода пшеница. В частности выявлены закономерности изменчивости анатомии стебля у видов полиплоидного ряда пшеницы [5]. Эволюцию анатомии стебля в процессе селекции исследовал В. В. Пыльнев [9, 10]. Наследование признаков анатомического строения при внутривидовой гибридизации изучали А. Ф. Мережко и О. Д. Градчанинова [11]. Анатомический метод для оценки исходного материала озимой мягкой пшеницы на продуктивность, морозостойкость и устойчивость к полеганию использовал К. Г. Тетерятченко [8]. Эти исследования показали, что анатомические параметры междоузлий контролируются генетически и могут быть использованы для идентификации генотипов. Анатомия стебля овса изучена фрагментарно и нуждается в детализации в первую очередь количественных признаков.

Объектами исследований служили гистолого-анатомические признаки короткостебельных образцов овса: AV 17/3/10, Bandiccot, СI 8448, Coky, Flamingskurz, От — 207, Pennline, STH 815,76Q:28, 76Q:225, (Вандроўнiк Ч 76Q:225) Ч Вандроўнiк, (Белорусский голозерный Ч 76Q:225) Ч Белорусский голозерный. В качестве контроля были использованы среднерослые голозерный сорт Вандроўнiк и пленчатый сорт Запавет, включенные в Госреестр Республики Беларусь.

Растения выращивались на опытном поле лаборатории овса РУП «НПЦ НАН Беларуси по земледелию». Почва опытного участка дерново-подзолистая, легкосуглинистая, развивающаяся на средних супесях, подстилаемых с глубины 0,7 м суглинистой мореной. Агрохимическая характеристика пахотного горизонта: содержание общего гумуса по Тюрину — 1,9−2,2%, рН в КСl — 6,0−6,2, подвижного фосфора (по Кирсанову) — 225−239 и общего калия (по Масловой) — 200−236 мг/кг почвы. Предшественник — гречиха.

Для анатомических исследований было отобрано по пять растений каждого сортообразца в двухкратной повторности в начале фазы выметывания метелки. Общий объем выборки составил 140 растений. Для анатомических исследований использовали стебли главных побегов. Фиксацию материала в течение 24 часов проводили в уксусном алкоголе (3 части 96-процентного этилового спирта + 1 часть ледяной уксусной кислоты) [12]. Затем зафиксированный материал переводили в 70-процентный этиловый спирт и хранили при +4 ?С в холодильнике.

Препараты изготавливали из средних частей междоузлий, что позволило унифицировать исследования и получить сопоставимые результаты. Срезы толщиной 50−80 мкм выполнялись вручную лезвием безопасной бритвы. Более тонкие срезы окрашивались флороглюцином менее контрастно, а на более толстых срезах хуже просматривались элементы анатомического строения из-за наложения изображений разных слоев клеток. Применение флороглюцина позволило контрастировать на препаратах склеренхиму перициклического происхождения, ассимиляционную паренхиму и проводящие пучки.

Изучение гистологических и анатомических особенностей стебля овса проводили на временных препаратах с использованием компьютерного анализатора изображений, включающего оптический микроскоп Nikon Eclipse 50i, видеокамеру Nikon DS-Fi1, преобразователь сигналов Nikon digital sight и компьютер. Каждый линейный признак измерялся на каждом микропрепарате в пятикратном повторении. Для статистической обработки полученных результатов был использован дисперсионный анализ [13] в версии Microsoft Office Excel 2003.

1. Общие закономерности анатомического строения стебля овса посевного

Овес посевной (Avena sativa L.) относится к семейству мятликовые (Poaceae), классу однодольные (Liliopsida) [14]. Поэтому для него характерно первичное анатомическое строение стебля, в котором выделяют эпидерму, первичную кору и центральный цилиндр. Степень развития этих элементов у овса зависит от генотипа, места нахождения метамера в системе целостного растения и фазы его развития. Проведенные исследования выявили ряд особенностей анатомии стебля короткостебельных сортообразцов овса посевного.

Клетки эпидермы стебля овса располагаются однослойно, имеют разные размеры. Более крупные клетки располагаются около тяжей ассимиляционной паренхимы (хлоренхимы), здесь же находятся устьица. Для эпидермы стебля овса характерна высокая степень минерализации клеточных оболочек.

Первичная кора стебля редуцирована — колленхима и эндодерма отсутствуют, а хлоренхима развита слабо, поскольку у изученных образцов овса междоузлия были полностью закрыты листовыми влагалищами. На поперечных срезах междоузлий хлоренхима имеет вид отдельных небольших обособленных тяжей клеток, имеющих характерные размеры, форму и окраску. В узлах хлоренхима отсутствует. При обработке микропрепаратов раствором флороглюцина клетки хлоренхимы окрашиваются в темный цвет. Интенсивность окрашивания зависит от ряда факторов, в том числе от содержания хлоропластов в клетках и количества хлорофилла в них.

Ассимиляционная паренхима у овса лучше развита в верхнем, подметелочном, междоузлии, что свидетельствует о возможности участия его в продукционном процессе. У высокопродуктивного сорта Запавет в верхнем междоузлии было в среднем 42,6 тяжей хлоренхимы, у среднепродуктивных Flamingskurz и STH 815 — 37,0 и 29,3, а у карликового низкопродуктивного AV 17/3/10 — лишь 20,6 тяжей хлоренхимы. В первом надземном междоузлии небольшие тяжи хлоренхимы состоят из 1−3 рядов бесхлорофилльных клеток, расположенных под эпидермой тангентально поверхности стебля. Поэтому при отборе продуктивных образцов следует обращать внимание на развитие хлоренхимы только в верхнем междоузлии.

В пределах междоузлия максимальное развитие хлоренхимы отмечается в верхней части междоузлия с той стороны стебля, где смыкаются края листового влагалища прилегающего листа. По мере перемещения к нижней части междоузлия степень развития хлоренхимы существенно снижается: уменьшается число клеток в тяже хлоренхимы, а также содержание в них хлорофилла. У изученных образцов нередко проявлялся полиморфизм по степени развития хлоренхимы. Так, у сорта Запавет ширина тяжа хлоренхимы у разных растений варьировала в подметелочном междоузлии от 70 до 140 мкм.

Тяжи хлоренхимы располагаются в междоузлиях попарно. Между тяжами каждой пары проходит один небольшой закрытый сосудисто-волокнистый проводящий пучок. Эти пучки обеспечивают хлоренхиму водой с растворенными в ней веществами, а также осуществляют отток ассимилятов. Поэтому мы их условно обозначили как ПП пк, т. е. проводящие пучки, обслуживающие первичную кору. Число этих пучков у изученных образцов было стабильно разным: у сорта Запавет — 22,5, у 76Q: 225 — 15,0, у AV 17/3/10 — лишь 11,6.

В начале онтогенеза побега в результате морфогенетической деятельности конуса нарастания у овса формируется центральный цилиндр, исходно состоящий из перицикла, тяжей прокамбия и клеток паренхимы. В последующем из клеток перицикла развивается механическая ткань склеренхима, а из тяжей прокамбия образуются закрытые коллатеральные сосудисто-волокнистые проводящие пучки, поэтому стебель имеет пучковый тип строения. В междоузлиях основная ткань развита только в периферийной части стебля, а в центральной располагается полость — медуллярная лакуна. В узлах и непосредственно прилегающих к ним участках междоузлий стебель выполнен.

У овса вследствие слабого развития первичной коры клетки центрального цилиндра располагаются непосредственно под эпидермой, огибая участки хлоренхимы и ППпк. Периферическое, в том числе субэпидермальное, расположение склеренхимы обеспечивает высокую прочность стебля при наличии в междоузлиях медуллярной лакуны. Клетки склеренхимы имеют прозенхимную, т. е. удлиненную, форму и небольшой диаметр поперечного сечения — около 10 мкм. Клеточные оболочки у большинства образцов толстые, пропитанные лигнином. Поэтому при использовании флороглюцина они окрашиваются в красно-бурый цвет и хорошо идентифицируются на микропрепаратах. Исследования, выполненные на сортообразцах овса, показали, что степень развития склеренхимы зависит от генотипа растения и места проведения среза на стебле. Так, у сорта Запавет толщина слоя склеренхимы в подметелочном междоузлии составляла 64,5 мкм, у образца 76Q:225 — 96,1 мкм, у 76Q:28 — 77,0 мкм, а у AV 17/3/10 — 138,2 мкм. При этом степень полегания растений перед уборкой была соответственно равна 5, 1, 3 и 9 баллов. Слабая устойчивось к полеганию карликового образца AV 17/3/10 при наличии широкой полосы склеренхимы объясняется тем, что клетки склеренхимы имели тонкие целлюлозные оболочки, не инкрустированные лигнином.

Диаметр клеток склеренхимы постепенно увеличивается по мере удаления их от поверхности стебля. Во всех метамерах стебля овса склеренхима лучше развита в верхней части междоузлия. В базальной части междоузлия эта ткань состоит из меньшего числа рядов клеток, оболочки клеток более тонкие и менее лигнифицированные. Это структурно и функционально связано с наличием и деятельностью в базальной части междоузлий остаточных интеркалярных меристем. При этом снижение прочности нижней части междоузлия компенсируется наличием развитого основания листа и листового влагалища.

Важным структурным компонентом центрального цилиндра являются закрытые коллатеральные сосудисто-волокнистые проводящие пучки, которые имеют выход в структуру листа. Эти пучки располагаются в окружении клеток паренхимы, поэтому мы их обозначили как ПП пар. Число этих пучков тесно связано с продуктивностью растений. Например, у голозерного сорта Запавет (урожайность 505 г./м²) в верхнем междоузлии было 23,8 пучков, а у голозерного AV 17/3/10 (урожайность 65 г./м²) — лишь 10,8. В составе флоэмы этих пучков хорошо развиты ситовидные трубки с клетками-спутницами, однако отсутствует основная паренхима. Поэтому камбий, как вторичная образовательная ткань, не образуется и проводящие пучки в своем росте ограничены запасом исходных клеток прокамбия. Тангентальный диаметр флоэмы проводящего пучка ПП пар. в значительной мере зависит от генотипа образца и косвенно свидетельствует о возможностях оттока ассимилятов. Ксилема образована двумя сравнительно крупными сосудами метаксилемы, перпендикулярно линии размещения которых располагаются 2−3 спиральных сосуда протоксилемы меньшего диаметра. Целлюлозные утолщения стенок сосудов обоих типов пропитаны лигнином, поэтому после обработки флороглюцином они окрашиваются в интенсивный красно-бурый цвет и хорошо идентифицируются на препаратах.

Между сосудами метаксилемы находится мелкоклеточная склеренхима прокамбиального происхождения, которая стабилизирует расположение сосудов в проводящем пучке. Кроме того, в ксилеме, рядом с сосудами протоксилемы, имеются многочисленные тонкостенные клетки, которые могут выполнять роль трансфузионной ткани.

Проводящие пучки окружены клетками склеренхимной обкладки. С радиальных сторон ксилемы и флоэмы они расположены в 3−5 рядов, а с тангентальной — только 1−2 ряда. Это указывает на то, что радиальные части пучков подвергаются большим деформирующим нагрузкам на сжатие и растяжение в период вегетации растений, чем боковые стороны пучков. Развитие механической обкладки вокруг пучков повышает устойчивость растений к полеганию. В частности, у более устойчивых образцов Coky, Pennline, Bandiccot обкладка была развита лучше, чем у слабоустойчивых Запавет, CI 8448, STH 815 и тем более у полегающего образца AV 17/3/10.

2. Обоснование методологии анатомических исследований для целей селекции овса

Проведенные исследования показали, что в анатомическом строении стебля овса можно выделить около 40 численных и мерных количественных признаков, каждый из которых интересен для структурной ботаники. Однако с точки зрения применения этих признаков для целей селекции возникает ряд методологических вопросов:

• — В какой мере развитие анатомических признаков зависит от генотипа и возраста растений?
• — Зависит ли развитие признака от метамерной принадлежности изучаемого междоузлия?
• — На каких междоузлиях стебля предпочтительнее проводить исследования?
• — Какие анатомические признаки могут быть использованы в селекции овса на продуктивность и устойчивость к полеганию?

Для ответа на эти вопросы нами был проведен двухфакторный дисперсионный анализ значений изучаемых признаков всех междоузлий стеблей отобранных растений. Полученные результаты выявили существенность различий анатомо-гистологических признаков в зависимости от генотипа и метамерной принадлежности междоузлия (табл. 1).

Таблица 1. Результаты дисперсионного анализа гистолого-анатомических признаков стебля короткостебельных образцов овса посевного.

По всем изученным признакам фактические значения критерия Фишера (F _{фактич.}) оказались выше теоретически ожидаемых (F₀₅). Это свидетельствует об относительной стабильности анатомических признаков и возможности ограничения объема выборки растений для анатомического анализа, что целесообразно при проведении индивидуального отбора в практической селекции.

Для определения роли генотипа и метамерной принадлежности междоузлия в развитии анатомических признаков были рассчитаны коэффициенты детерминации (табл. 2).

овес селекция стебель репродуктивный Таблица 2. Влияние генотипа и междоузлия на развитие анатомических признаков короткостебельных образцов овса посевного.

Из приведенных данных следует, что степень развития разных анатомических признаков в разной мере зависит от сортовых особенностей растений. При проведении отбора по анатомическим признакам в первую очередь следует обращать внимание на толщину стенки соломины, развитие хлоренхимы, количество проводящих пучков и их тангентальный диаметр, развитие флоэмы и периферического кольца склеренхимы. Для большинства анатомических признаков выбор междоузлия для оценки генотипа имеет большое значение. Это особенно важно при оценке генотипов по толщине соломины, параметрам тяжей хлоренхимы, числу проводящих пучков ПП пар., а также по числу рядов клеток в периферическом кольце склеренхимы. Поэтому селекционный материал необходимо сравнивать между собой по признакам одного и того же междоузлия. Для этой цели лучше всего подходит верхнее (подметелочное) междоузлие. В проведенных опытах разница между образцами овса по анатомическим признакам этого междоузлия была статистически наиболее достоверной.

Выводы

• 1. Фиксацию растений для анатомических исследований следует проводить в хорошо идентифицируемую фазу развития, т. е. в начале фазы выметывания метелки. На более ранних этапах формирование тканей стебля еще не завершено, а после цветения отмечается активная лигнификация клеток паренхимы, что затрудняет изготовление качественных препаратов.
• 2. Для селекционной практики информационную ценность имеют параметры развития ассимиляционной паренхимы, склеренхимы перициклического происхождения и проводящей системы, которые могут быть использованы для идентификации генотипов и проведения отборов на продуктивность и устойчивость к полеганию. Оценку генотипов необходимо проводить по анатомическим признакам однотипных междоузлий. При отборе продуктивных генотипов следует обращать внимание на развитие хлоренхимы только в верхней части подметелочного междоузлия.
• 4. Наличие внутрипопуляционного полиморфизма по анатомическим признакам стебля, а также зависимость степени развития их от сортообразца является обоснованием возможности использования этих признаков при отборе высокопродуктивных, устойчивых к полеганию генотипов овса.
• 4. Анатомические признаки стебля являются лишь частью структур, обеспечивающих формирование индивидуальной продуктивности растений. Поэтому их следует учитывать в селекции в сочетании с морфологическими, физиологическими и биохимическими признаками.

• 1. Баталова, Г. А. Биология и генетика овса / Г. А. Баталова, Е. М. Лисицин, И. И. Русакова. — Киров: Зональный НИИСХ Северо-Востока, 2008. — 456 с.
• 2. Митрофанов, А. С. Овес / А. С. Митрофанов, К. С. Митрофанова. — Изд. 2-е, перераб. — М.: Колос, 1972. — 269 с.
• 3. Жуковский, П. М. Культурные растения и их сородичи: систематика, география, цитогенетика, иммунитет, экология, происхождение, использование / П М. Жуковский. — 3-е изд., перераб. и доп. — Л.: Колос, 1971. — С. 157 — 162.
• 4. Частная селекция полевых культур / Под ред. Г. В. Гуляева. — М.: Колос, 1975. — 464 с.
• 5. Лазаревич, С. В. Эволюция анатомического строения стебля пшеницы / С. В. Лазаревич. — Минск: БИТ «Хата», 1999. — 296 с.
• 6. Жизнь растений. В 6 т. Т.6. Цветковые растения / Под ред. А. Л. Тахтаджяна. — М.: Просвещение, 1982. — С. 341−378.
• 7. Patrick, M.N. Vascular control of photosynthate transfer from the flag leaf to the wheat / M.N. Patrick, I.F. Wardlaw // Aust. J. Plant Physiol. — 1984. — Vol. 11. — P. 235 — 241.
• 8. Тетерятченко, К. Г. Анатомический метод оценки исходного материала мягкой озимой пшеницы на продуктивность, морозостойкость и устойчивость к полеганию / К. Г. Тетерятченко // Науч.-техн. бюл. /ВИР им. Н. И. Вавилова. — 1984. Вып. 146. — С. 28−32.
• 9. Пыльнев, В. В. Изменение анатомического строения растений озимой пшеницы в результате селекции / В. В. Пыльнев, Б. Б. Батоев // Известия ТСХА. — М.: 1993. — Вып. 1. — С. 31−39.
• 10. Пыльнев, В. В. Закономерности эволюции озимой пшеницы в результате селекции: Автореф. дис. … д-ра биол. наук: 06.01.05/ В. В. Пыльнев. — Моск. с.-х. акад. им. К. А. Тимирязева. — М: 1998. — 35 с.
• 11. Мережко, А. Ф. Наследование длины соломины и анатомического строения стебля межсортовыми гибридами мягкой пшеницы/ А. Ф. Мережко, О. Д. Градчанинова // Бюллетень ВИР им. Н. И. Вавилова. — 1982. Вып. 122. — С. 18−22.
• 12. Паушева, З. П. Практикум по цитологии растений. — 4-е изд., перераб. и доп. / З. П. Паушева. — М.: Агропромиздат, 1988. — С. 61−66.
• 13. Доспехов, Б. А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). — 5-е изд., доп. и перераб. / Б. А. Доспехов. — М.:Агропромиздат, 1985. — С. 207 — 213.
• 14. Определитель высших растений Беларуси / Под ред. В. И. Парфенова. — Минск: Дизайн ПРО, 1999. — 472 с.