Заключение. 
Фотодинамическая терапия в лечении перитонита

Несмотря на использование широкого арсенала высокотехнологических методов диагностики, появление новых мощных антибиотиков, интенсивную послеоперационную терапию, распространенность острых перитонитов остается высокой, не имея тенденции к снижению [Ахтамов Ж.А. и соавт., 2005; Бондарев Р. В. и соавт., 2008; Гельфанд Б. Р. и соавт., 2000; Гостищев В. К. и соавт., 2002; Карабаев Х. К. и соавт., 2005; Савельев В. С. и соавт., 2010; Федоров В. Д. и соавт., 2000]. Одним из составных и наиболее важных элементов комплексного лечения распространенного перитонита является устранение причины развития перитонита и эффективная санация брюшной полости. Установлено, что успешный результат лечения разлитого гнойного перитонита лишь на 20% зависит от эффективности антибактериальной терапии и на 80% от хирургической тактики с адекватной санацией брюшной полости [Савельев В.С. и соавт., 2006; Шуркалин Б. К., и соавт., 2003]. Предложенные методики интраоперационной санации брюшной полости не всегда позволяют полностью удалить патогенную микрофлору, из-за технических сложностей вызванных деструктивным процессом или анатомическими особенностями. Некоторые методы трудоемки и затратны. Поэтому дискуссия о способах послеоперационной санации брюшной полости продолжается до сих пор, и направлена на поиск более простых и эффективных методов санации брюшной полости.

В последние десятилетия во многие разделы клинической медицины внедряются лазерные технологии Одним из перспективным методов в наше время является фотодинамическая терапия, успешно применяемая в лечении онкологических заболеваний, и более позднее применение данной методики в лечении воспалительных процессов разной этиологии [Странадко Е.Ф. и соавт., 2010; Толстых П. И., и соавт., 2001; Цыб А. Ф. и соавт., 2009; Dougherty T.J. et al., 1998; Henderson B.W. et al., 1992; Muschter R. et al., 2003]. Одним из преимуществ метода ФДТ является бактерицидное действие локального характера [Костюченко К.В., 2003; Лихачева Е. В. и соавт., 2007].

Вышеуказанное позволяет, с нашей точки зрения изучить возможность применения метода ФДТ для санации брюшины в лечении распространенного перитонита в эксперименте, а так же изучить его антибактериальные свойства и воздействие на синдром эндогенной интоксикации при экспериментальном перитоните.

В работе были использованы 189 крыс-самцов линии Wistar, массой тела 200−250 г. Для создания модели острого распространенного калового перитонита нами применена модифицированная методика с использованием профильтрованной 10% каловой взвеси в дозе 0,5 мл на 100 г. После введения каловой взвеси в брюшную полость подопытным крысам, у животных на 3 сутки развивалась клиническая картина острого перитонита, выражающаяся в вялости и малоподвижности животных, вздутии живота, отказе от пищи и отсутствии стула.

На 3 сутки животных во всех группах на фоне картины разлитого перитонита подвергались оперативному вмешательству в условиях общей внутривенной анестезии (тиопентал-натрия: 5−7 мг, 2% р-ра на 100 г. массы тела). Животным проводили лапаротомию и санацию брюшной полости. До операции в опытных группах животным внутривенно вводили фотосенсибилизатор «Фотодитазин» в дозе 0,8 мг/кг, до оперативного вмешательства. В качестве фотосенсибилизатора мы применяли препарат «Фотодитазин» — производное хлорина Е-6 (производства фирмы «Вета Гранд», Россия). В качестве источника света для проведения сеанса ФДТ был использован лазер «АТКУС-2» (Санкт-Петербург, Россия) с выходной мощностью от 1 до 2 Вт длиной волны 660±0,03 нм, в непрерывном режиме красного оптического диапазона с плотность энергии от 20 до 25 Дж/см².

Исследование включало три этапа:

Первым этапом работы было изучение накопления фотосенсибилизатора «Фотодитазина» в брюшине 64 крыс. Все животные были разделены на 8 групп, из которых две были контрольными, а шесть основными. Каждая группа содержала по восемь особей: Первые 6 (основных) групп представлены крысами с распространенным серозно-фибринозным перитонитом, которым вводили фотосенсибилизатор. Эти группы различались по моменту проведения спектрографии: на 30, 60, 90, 120, 150 и 180 мин от момента введения фотосенсибилизатора (т.е. различались по времени распределения и накопления препарата в тканях).

7 контрольную группу составляли крысы, у которых на фоне моделированного распространенного перитонита, фотосенсибилизатор не был введен.

В 8 контрольную группу вошли интактные крысы без моделирования перитонита, у которых определялось накопление фотосенсибилизатора в здоровых тканях.

Изучение накопления «Фотодитазина» в брюшине проводили с помощью многоканального оптического волоконного спектроанализатора (ЛЭСА-01-Биоспек, Россия), с определением интенсивности флуоресценции по 12 точкам. Оценивали соотношение интенсивности флюоресценции лазерной линии (интенсивность излучения, диффузно отраженного от тканей).

Таким образом, была проведена работа по изучению накопления фотосенсибилизатора «Фотодитазина» в интактной брюшине, в париетальной брюшине при наличии острого калового перитонита. Оценены результаты ФДТ.

Во время операции (лапаротомии) макроскопический вид брюшины у крыс 7 контрольной группы и всех основных групп соответствовал картине острого гнойного распространенного перитонита, выражавшейся в наличии в брюшной полости воспалительного экссудата, отложении фибрина на париетальной и висцеральной брюшине, вздутии петель кишечника и выраженном инъецировании сосудов париетальной брюшины. После проводилась флуоресцентная спектрография и санация брюшной полости стерильным физиологическим раствором до удаления фибрина из брюшной полости. После завершения санации промывную жидкость эвакуировали из брюшной полости электроотсосом, проводилось облучение брюшины методом ФДТ, исключающим термическое повреждение тканей. Через 5 мин выполнялась повторная флуоресцентная спектрография. Брюшную стенку зашивали через все слои, животное маркировали и помещали в стандартные условия вивария.

Второй этап исследования включает в себя изучение эффективности лечения острого распространенного перитонита на 65 крысах, которые входили в основную и контрольную группу. Основная группа состояла из 43 крыс с санацией брюшной полости произведенной методом ФДТ. В контрольную группу входило 22 крысы санацию брюшины которым проводили наиболее распространенными в клинической практике способом — с промыванием брюшной полости 0,02% раствором хлоргексидина до «чистых» вод.

В послеоперационный период животным обеих групп проводили антибактериальную терапию: внутримышечные инъекции гентамицина из расчета 2 мг/кг массы.

Эффективность применения ФДТ при лечении острого распространенного перитонита оценивали по общему состоянию животных, клиническим проявлениям процесса и количеству летальных случаев обеих групп. Оценивали динамику изменения клинических и биохимических показателей крови животных. Проводили микробиологические исследования воспалительного экссудата из брюшной полости и морфологические исследования париетальной брюшины Третьим этапом выполненной работы было изучение антибактериальных свойств ФДТ при перитоните, при котором актуальное значение имеет определение числа КОЕ микроорганизмов в послеоперационном период. Данный фрагмент исследований был осуществлен на 60 крысах. Для более удобного подсчета микроорганизмов в экссудате, перитонит моделировали внутрибрюшинным введением монокультуры E. Coli (Штамп 25 922) в концентрации 10^8-10⁹ микробных тел в 1 мл суспензии из расcчета 0,01 мл заражающей дозы на 1 г массы животного. Для оценки результатов животных выводили из эксперимента передозировкой анестетика (тиопентал-натрия) на 1, 3, 5 и 7 сутки после оперативного вмешательства. Основная группа состояла из 36 крыс с санацией брюшной полости методом ФДТ, контрольная группа из 24 крыс с санацией брюшной полости 0,02% раствором хлоргексидина.

При изучении накопления фотосенсибилизатора «Фотодитазина» в обследованных нами группах животных были получены различные результаты. В контрольной группе (интактные крысы) зарегистрированные результаты демонстрируют колебания флуоресценции в пределах 0−10±5 Ед.ф., что отражает отсутствие признаков накопления фотосенсибилизатора в брюшине здоровых крыс.

Результаты флуоресцентно-спектрального исследования, полученные у крыс контрольной группы с экспериментальным каловым перитонитом, которым фотосенсибилизатор в организм не вводили, данные флуоресценции в пределах 400 ±50 Ед.ф., отражают истинный спектр флуоресценции бактерий.

Анализ полученных нами спектров флуоресценции по данным шести основным группам свидетельствует о равномерном накоплении фотодитазина в клетках воспаленной брюшины. При этом, максимальный пик накопления приходится на временной интервал 120 мин (3000±155. Ед.ф.) и 150 мин (3200±150 Ед.ф.) при умеренным снижении спектра в последующие часы.

Таким образом, результаты спектрографии свидетельствуют о том, что оптимально эффективный момент для оперативного лечения и лазерного воздействия на брюшину при остром распространенном перитоните у экспериментальных животных развивается через 2−2,5 ч, после введения фотосенсибилизатора.

После определения времени максимального накопления фотосенсибилизатора, мы производили облучение брюшины крысы лазерным излучением длиной волны 660±0,03 нм, в непрерывном режиме с выходной мощностью 2 Вт (плотностью энергии 20 до 25 Дж/см²). Повторную флуоресцентную спектрографию проводили через 5 мин после облучения. По результатам исследования, можно утверждать, что интенсивность флуоресценции в воспаленной париетальной брюшине составляет 3200±150 Ед.ф., а лазерное облучения брюшины приводит к снижению этого показателя более чем в 4 раза, до уровней 750±70 Ед.ф.

Таким образом, в результате проведенных исследований методом флуоресцентной спектроскопии нами было выявлено, что после внутривенного введения крысам «Фотодитазина» в дозе 0.8 мг/кг, время, требуемое для максимального накопления фотосенсибилизатора в брюшине является промежуток в 2−2,5 часа. После проведения лазерного воздействия, интенсивность флуоресценции снижается на 76.6%, что свидетельствует о эффективности проведения ФДТ и снижения концентрации препаратов в тканях при экспериментальном разлитом перитоните.

При оценки эффективности применения фотодинамической терапии в лечении распространенного перитонита в сравнение с традиционными методами лечения отмечаются следующие клинико-морфологические изменения.

Через сутки после операции в основной группе у крыс сохранялись признаки пареза желудочно-кишечного тракта, воспаление париетальной и висцеральной брюшины. В брюшной полости имелся мутный экссудат с желтоватым окрашиванием, без запаха. Объем его составил до 1 мл у 4-ти из 6 животных, а у остальных — 2−3 мл. Ни в одном случае не было обнаружено признаков термического повреждения брюшины.

На третьи сутки после оперативного вмешательства, пареза мы не наблюдали, при этом мы отмечали сохранение равномерной слабовыраженной гиперемии брюшины с появлением обычного блеска последней. Объем экссудата (прозрачного вида) составил 0,5 мл у двух из шести животных, у остальных четырех животных менее 0,5 мл. Спаек между петлями кишки и брюшины как и признаков термического поражения брюшины не наблюдали.

Через пять суток после операции парез разрешался, исчезала гиперемия брюшины. Последняя приобретала гладкий, блестящий вид. В брюшной полости имелись единичные рыхлые спайки, выпота отмечено не было. Аналогичную картину мы наблюдали и на седьмые сутки после проведения санации методом ФДТ, которая макроскопически не отличалась от картины брюшины у здоровых животных.

В контрольной группе у животных с санацией брюшной полости 0,02% раствором хлоргексидина, изменения в брюшной полости были существенны, прежде всего, по объему и характеру экссудата. Динамики в объеме экссудата не было отмечено, он составлял 1−3 мл на протяжении всех семи суток послеоперационного периода и лишь к исходу седьмых суток экссудат становился прозрачным.

У животных основной группы функция кишечника восстанавливалась к началу вторых послеоперационных суток, а через 3−4 суток после мер оперативной санации поведение животных не отличалось от здоровых животных.

В контрольной группе крысы оставались менее активными, слабо реагировали на внешние раздражители, тянулись в основном к поильнику. Функция кишечника у них восстанавливалась на 4−5 сутки после операции, но даже в эти сроки крысы были вялыми и малоподвижными.

Летальность в основной группе составила 9,3% (4 крысы), из которых две скончались в течение первых 24 часов, и две в последующие 48 ч вследствие продолжающегося перитонита и нарастающей интоксикации. В контрольной группе летальность составила 27,3% (6 крыс) в течение первых 24 часов при явлениях продолжающегося перитонита. Данный результат доказывает более тяжелое течение перитонита в послеоперационном периоде в сравнение с традиционным методом санации.

При проведении лабораторных исследований были получены следующие результаты. Прежде всего, было отмечено, что при проведении санации брюшной полости методом ФДТ достоверно более выраженными были признаки купирования синдрома эндогенной интоксикации в сравнении с контрольной группой животных, где санацию производили 0,02% раствором хлоргексидина. Так, уровень лейкоцитов у крыс основной группы был ниже, чем у крыс контрольной группы к концу первых суток на 17,1% с достоверностью (р?0,05). На пятые сутки послеоперационного периода разница содержания лейкоцитов в периферической крови у крыс основной группы была в пределах нормы, а разница между показателями основной и контрольной групп возросла до 21,48% с достоверностью (р?0,05).

Использование ФДТ позволило быстро купировать воспалительные явления, перевести раневой процесс из альтеративно-экссудативной фазы в репаративную, что нашло отражение и в динамике показателей ЛИИ. В первые сутки после проведения оперативного вмешательства в основной группе наметилась тенденция к снижению показателей ЛИИ на 30,91% в сравнение с предоперационным значением, и на 13,87% относительно контрольной группы. К седьмым суткам показатель ЛИИ был в пределах физиологических величин, а в контрольной обмечалось двукратное превышение контрольных показателей с достоверностью (р?0,05).

Биохимические показатели крови у обеих групп подопытных животных при развитии острого разлитого перитонита демонстрировали факт снижения содержания общего белка сохраняющегося на протяжении всего периода исследований. В первые сутки наблюдения у подопытных крыс основной и контрольной групп существенного различия в уровне содержания белка плазмы крови не было. Однако, наиболее выраженную тенденцию к повышению данного показателя мы обнаружили у крыс основной группы к седьмым суткам, когда его уровень повысился на 11,75%, по сравнению с контрольной группой с достоверность (р?0,05).

Содержание мочевины до момента оперативной санации превышало норму на 78,5%, к концу первых суток после операции, в основной группе мы фиксировали тенденцию к снижению показателя. В контрольной группе содержание мочевины на первые сутки после санации увеличилась на 21,64% в сравнение с основной группой с достоверность (р?0,05). В последующем концентрация мочевины в контрольной группе превышала данные по основной группе к третьим суткам на 17,37%, к пятым суткам на 7,83%. В основной группе аналогичные показатели были равны, соответственно, 14,63% и 4,78%. К концу седьмых суток уровень этого показателя у крыс соответствовал норме как в контрольной, так и в основной группе с достоверностью (р?0,05).

Показатели креатинина в плазме крови до санации брюшной полости превышали норму на 54,23%. К концу первых суток мы отмечали тенденцию к снижению уровня креатинина у крыс обоих групп, причем в контрольной группе эта тенденция была более выражена на 9,8% по сравнению с данными основной группы. К третьим и пятым суткам наблюдения, наоборот, более выраженная тенденция к снижению уровня креатинина была отмечена у крыс в основной группе по сравнению с контрольной группой. В основной группе показатели содержание креатинина плазмы уже к пятым суткам были в пределах нормы с достоверность (р?0,05).

Показатель АсАТ на начало опыта превышал норму в 2,1 раза. К концу первых суток было отмечено, что в контрольной группе имелось превышение активности данного фермента по сравнению с основной группой на 34,12% с достоверность (р?0,05). К пятым суткам превышение фермента в контрольной группе превышала норму на 19,63%, с достоверностью (р?0,05). В обеих группах активность данного фермента нормализовалась лишь к седьмым суткам послеоперационного периода с достоверность (р?0,05).

Превышение АлАТ на начало опыта составляла 83,9%. На протяжении всего периода наблюдения мы отметили более выраженное снижение активности данного фермента у крыс основной группы, по сравнению с контрольной группой. К концу первых суток после санации активность АлАТ в контрольной группе была повышена на 54,4%, на пятые сутки — на 11,83%, В основной группе данный показатель превышал норму в исследуемые интервалы времени, соответственно, на 24,05; 3,12%, с достоверностью (р?0,05). К седьмым суткам концентрация АлАТ у крыс в обеих группах возвращались к норме с достоверность (р?0,05).

До проведения санации при гистологическом исследовании имеет место картина фибринозно-гнойного перитонита с выраженной нейтрофильной инфильтрацией, отеком и полнокровием стромы. После проведения ФДТ наблюдалось значительное уменьшение интенсивности экссудативного воспаления, активация клеточных элементов системы мононуклеарных фагоцитов с сохранением венозного полнокровия.

Через пять суток после ФДТ интенсивность дисциркуляторных изменений в виде венозного полнокровия и отека стромы значительно снижается, отсутствует нейтрофильная инфильтрция, а активность клеточных элементов макрофагального ряда сохраняется, на седьмые сутки признаков воспаления не отмечается, брюшина соотвествует здоровой. При традиционном методе санации на седьмые сутки сохраняются признаки воспаления с тенденцией к уменьшению интенсивности нейтрофильной инфильтрации, отека и полнокровия стромы.

Таким образом, изучение динамики клинико-морфологических изменений у животных с распространенным перитонитом позволяет заявить, что использование метода ФДТ для санации брюшной полости способствует активному купированию воспалительного процесса и острой полиорганной недостаточности.

При исследовании антибактериальных свойств фотодинамической терапии отмечались следующие данные: на первые сутки после санации брюшины методом ФДТ, у выведенных из эксперимента животных число микробных тел значительно снижалось и составляло 10² в 1 мл экссудата; через трое суток после оперативного пособия в брюшной полости отмечалось незначительное содержание патогенной флоры с достоверность (р?0,05).

В контрольной группе животных с острым распространенным перитонитом, у которых санацию брюшины проводили 0,02% раствором хлоргексидина, концентрация микробных тел кишечной палочки в 1 мл экссудата составила: через 24 часа после операции -10⁴; через 72 часа — 10³; через 5 суток — 10² микробных тел в 1 мл экссудата. К седьмым послеоперационным суткам брюшная полость становилась стерильной. Полученные результаты доказывают высокую стерилизующую способность метода ФДТ при остром экспериментальном перитоните вызванный монокультурой кишечной палочки.

Данные экспериментальных исследований по изучению эффективности применения ФДТ при остром экспериментальном перитоните свидетельствуют о том, что максимальное время, требуемое для накопления «Фотодитазина» в воспаленной брюшине составляет 2−2,5 часа. По результатом спектрографии после лазерного воздействия интенсивность флуоресценции снижается на 76,6%, что свидетельствует об активно протекающей фотодинамической реакции и снижении концентрации препарата в париетальной брюшине при остром распространенном перитоните.

Анализ лабораторных, клинико-морфологических, бактериологических исследований проведенных на крысах после санации брюшной полости методом фотодинамической терапии на всех этапах исследования был результативным: о чем свидетельствует факт активного купирования воспалительного процесса в брюшной полости; синдрома полиорганной недостаточности; уменьшение обсемененности брюшной полости патогенной флорой, что доказывает снижении летальности в основной группе экспериментальных животных с 27,3% до 9,5%.

Новый разработанный и примененный нами способ интраоперационной санации брюшной полости при экспериментальном распространенном перитоните, представил с нашей точки зрения убедительные доказательства преимуществ лазерной «стерилизации» методом ФДТ. При комбинированном подходе к решению проблемы лечения перитонита, обеспечиваются условия оптимизирующие результаты лечения экспериментальных животных в случае привлечения нефармакологических способов потенцирования.

Выводы.

• 1. Время необходимое для максимального накопления «Фотодитазина» в брюшине составляет 2−2,5 часа после внутривенного введения препарата. После проведения лазерного воздействия, интенсивность флюоресценции снижается на 76,6%, что свидетельствует об активно протекающей фотодинамической реакции.
• 2. Проведенные исследования свидетельствует о высокой стерилизующей способности фотодинамической терапии для санации брюшины при остром экспериментальном перитоните, вызванном монокультурой кишечной палочки, по сравнению с традиционным методом лечения. Снижает число микробных тел к первые сутки до 10² в 1 мл экссудата, а через трое суток после операции — микрофлоры в брюшной полости не выявлено.
• 3. Санация брюшины при остром экспериментальном перитоните с использованием ФДТ позволяет в три раза быстрее отчистить брюшную полость от патогенной флоры, уменьшить эндогенную интоксикацию, и снизить летальность экспериментальных животных с 27,3% до 9,3% по сравнению с традиционным методом санации.
• 4. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о высокой эффективности метода фотодинамической терапии для санации брюшины, который способствует сокращению острой фазы воспалительного процесса в брюшной полости, снижению бактериальной обсемененности брюшины, быстрому купированию пареза желудочно-кишечного тракта и почечно-печеночной недостаточности у животных с экспериментальным каловым перитонитом.

Практические рекомендации Результаты экспериментальных исследований по изучению эффективности применения метода ФДТ при остром экспериментальном перитоните свидетельствуют о высокой эффективности ФДТ при санации брюшной полости. Высокая эффективность, простота способа, его доступность, надежность, исключение термического повреждения брюшины дают основание к дальнейшему изучению ФДТ для лечения больных с острым распространенным перитонитом.