Введение. 
Распределение признаков деградации углеводородов среди гетеротрофной микрофлоры, выделенной из почвы и нефтешламов

Известно, что черноземные почвы отличаются высокой концентрацией микроорганизмов [1], нефтешламы также характеризуются присутствием в них гетеротрофных микроорганизмов [2].

Очевидно, что при исследовании процесса биодеградации нефтепродуктов в различных объектах необходимо изучение разнообразия трофических возможностей у гетеротрофной микрофлоры по отношению к индивидуальным углеводородам — компонентам поллютантов. Это поможет понять принципы функционирования углеводородокисляющих сообществ.

Целью данной работы стала оценка и сравнение разнообразия спектров потребляемых углеводородов у микроорганизмов, выделенных из нефтешламов, почвы и грунта на завершающем этапе биоремедиации.

В своем исследовании мы стремились выделить как можно больше изолятов гетеротрофных бактерий с учетом концентрации бактерий в высеве и исследовать спектр потребляемых углеводородов у выделяемой микрофлоры.

На основании полученных данных выделили минимальную группу углеводородов, которая позволяет оценить углеводородокисляющую направленность штамма.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Микроорганизмы выделяли из чистой почвы (чернозема), нефтешлама на завершающей стадии детоксикации и двух образцов нефтешламов, не подвергавшихся очистке. Нефтешлам № 1 представлял собой твердую черную массу, концентрация нефтепродуктов 345 г/кг, срок хранения более 40 лет, отобран из амбара накопителя. Нефтешлам № 2 отобран из нефтеловушки, он содержал нефтяные отходы, полученные при зачистке резервуаров. Концентрация нефтепродуктов в данном образце составила 340 г/кг.

Нефтешлам на завершающем этапе очистки (в дальнейшем грунт) отобран с площадки биологической очистки нефтешлама, обрабатываемого по технологии центра «Биотехнология» КубГУ. К моменту отбора пробы он представлял собой грунт с остаточным содержанием углеводородов — 34,8 г/кг. Принципы технологии детоксикации описаны в работе [3]. В очищаемый шлам в процессе биоремедиации вносили биогенные элементы, структурирующие вещества, регулировали водный режим.

Содержание нефтепродуктов в нефтешламах определяли флюориметрически на «Флюорат 02−3М» по стандартной методике согласно ПНДФ 16.1.21−98 КХА почв МВИ массовой доли нефтепродуктов в пробах почв на анализаторе жидкости «Флюорат 02» .

Выделение и количественный учет микроорганизмов проводили методом кратных разведений почвы (нефтешлама, грунта), суспендированной в физиологическом растворе.

Четыре грамма почвы (нефтешлама, грунта) разводили в 40 мл физиологического раствора. Далее по стандартной методике производили десятикратные разведения, а начиная с четвертого разведения для нефтешламов (грунта) и с пятого для почвы — двукратные разведения.

Соответственно посевы (0,1 мл почвенной суспензии) производили из последнего десятикратного разведения и двух первых двукратных разведений на стандартный питательный агар для гетеротрофных микроорганизмов.

Такой способ разведений дал возможность выделить в чистой культуре оптимальное количество изолятов для дальнейших исследований.

Для оценки способности к росту на различных углеводородах производили посев чистых культур штрихом на плотную минеральную среду с углеводородами.

Состав плотной минеральной среды: нитрат калия — 4,0 г, однозамещенный фосфат калия — 0,6 г, двузамещенный фосфат натрия (двенадцативодный) — 1,4 г, сульфат магния — 0,8 г, агар — 20 г, вода (водопр.) до 1 л. В качестве единственного источника углерода и энергии использовали индивидуальные н-алканы ряда гексан — октадекан, бензол (Benz) и его производные — 1,2,4-триметилбензол (псевдокумол — Psk), бутилбензол (b-Benz), о-ксилол (o-Xyl), толуол (Tol).

Также производили посевы выделенной микрофлоры на минеральную среду с хлороформенным экстрактом соответствующего объекта (нефтешламы и грунт).

Так как чистая почва не содержала нефтепродукты, микроорганизмы, выделенные из нее, культивировали на минеральной среде с сырой нефтью, взятой в качестве модельного поллютанта. Все субстраты вносили в расплавленную среду в концентрации 0,2% (об).

Чашки с легкими углеводородами (н-алканы ряда гексан — додекан, бензол и его производные) помещали в закрытый эксикатор, на дно которого наливали 10 мл углеводорода.

Нафтид нефтешлама вносили в плотную минеральную среду в бензольной эмульсии. Расплавленную среду нагревали и выдерживали в течение одного часа на кипящей водяной бане в вытяжном шкафу для удаления растворителя и периодически встряхивали. В результате получали дисперсию нефтепродукта в плотной минеральной среде. Культивировали при комнатной температуре в течение 7 суток. Учитывали результаты по системе «+» (наличие роста) и «-» (отсутствие роста).

Для группировки признаков деградации углеводородов в зависимости от качественных особенностей спектра потребляемых углеводородов использовали многомерное шкалирование, модуль (PROXSCAL, порядковая модель с разрешением связанных наблюдений) программы SPSS 11.5 for Windows. В качестве дистанции между объектами использовали Евклидову меру для бинарных данных.

Для измерения взаимосвязи между количеством деградируемых углеводородов и способностью к росту на поллютанте использовали тест хи-квадрат и коэффициент неопределенности в качестве меры связи. Анализ провели в программе SPSS 11.5 for Windows.

Для измерения разнообразия выделенной микрофлоры с учетом степени сходства индивидуальных характеристик роста штаммов на различных углеводородах использовали коэффициент Евклидова разнообразия (EDC — Euclidean diversity coefficient) [4]. Формула коэффициента Евклидова разнообразия:

.

где p — доли i-того и j-того фенотипа, — дистанция между i-тым и j-тым фенотипом, измеряемая как.

.

где — мера сходства между фенотипами. В данном исследовании использовали следующую меру сходства: отношение количества совпадающих признаков у пары штаммов к общему количеству признаков ;

.

где в стандартной нотации для бинарных данных a (1,1), b (1,0), c (0,1), d (0,0).