Результаты и обсуждение

Полногеномная амплификация

Доступное для анализа количество геномной ДНК (гДНК) является ключевым фактором, от которого зависит успешность последующего применения многих современных методов молекулярно-генетического анализа. После биопсии бластомера необходимо амплифицировать его гДНК, содержание которой менее 10 пг, что крайне недостаточно для проведения различных методов молекулярной диагностики (секвенирование, микрочипы, генотипирование коротких тандемных повторов, количественная ПЦР и др.). Количество гДНК необходимое для этих методов колеблется от 1 до 100 нг, что соответствует 160−1600 клеткам [7].

Главное требование к продукту ПГА — максимально возможная и пропорциональная репрезентативность всех участков генома единичных клеток. Для этого необходимо создание точек инициации репликации, равномерно разбросанных по всему геному на расстояниях, которые полимераза успеет преодолеть до того, как диссоциирует с матрицы ДНК. Несмотря на разнообразие методов ПГА (DOP-PCR, LA-PCR, MDA, MALBAC и др.) наиболее перспективными для целей ПГС являются две сходные технологии «PicoPlex» и «MALBAC» (Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles). Они обеспечивают широкое покрытие генома и достаточно равномерную амплификацию всех его участков за счет наличия квазилинейного этапа предварительной репликации первичного транскрипта амплификации, которая позволяет существенно уменьшить неравномерность воспроизведения гДНК в ходе последующего этапа экспоненциального роста числа ампликонов [9].

Наиболее показательной методикой ПГА, заслуживающей отдельного рассмотрения, является технология MALBAC (рис.1). Для этих целей разработан специальный праймер, который имеет на 5'-конце одинаковый 27-нуклеотидный «хвост», а на 3'-конце — последовательность из 8 случайных нуклеотидов. Такие праймеры при низкой температуре (15−20єC) равномерно гибридизуются на протяжении всей матрице гДНК, а при повышении температуры до 70−75єC начинают репликативно удлиняться с образованием полуампликонов различной длины (0.5−1.5 kb) с единственным «5'-хвостом». Для этих целей используется термостабильная ДНК-полимерза с вытесняющей активностью. Для этих целей разработан специальный праймер, который имеет на 5'-конце одинаковый 27-нуклеотидный «хвост», а на 3'-конце — последовательность из 8 случайных нуклеотидов. Такие праймеры при низкой температуре (15−20єC) равномерно гибридизуются на протяжении всей матрице гДНК, а при повышении температуры до 70−75єC начинают репликативно удлиняться с образованием полуампликонов различной длины (0.5−1.5 kb) с единственным «5'-хвостом». Для этих целей используется термостабильная ДНК-полимерза с вытесняющей активностью.

Случайный отжиг праймеров на матрице гДНК и их репликация с линейным ростом числа полуампликонов, а затем и полных ампликонов в ходе температурного цикла. Полные ампликоны замыкаются в шпильки за счет «липких» комплементарных концов, благодаря чему они теряют способность к дальнейшему участию в цикле линейной репликации. На финальном этапе протекает ПЦР с ДНК матрицы полных ампликонов с экспоненциальным ростом их числа. m — число температурных циклов (8−12); n — число праймеров гибридизованных с ДНК-матрицей; (m + 1) Ч n — число полуампликонов на m-цикле; m Ч n² — число полных ампликонов генерируемых на m-цикле.

При температуре 95 °C полуампликоны денатурируют с матрицы гДНК и далее они служат матрицей для репликации с обратной стороны, в ходе которой формируются полные ампликоны с двумя комплементарными друг другу концами («хвостами»). При снижении температуры до 58є C «липкие» концы полных ампликонов соединяются с формированием шпилечной структуры (петель ДНК), что предохраняет их от дальнейшей амплификации в следующих циклах (выход из цикла). Число таких циклов повторяется 8−12 раз, что обеспечивает квазлинейный рост достаточного числа полных ампликонов замкнутых в петли. Предварительная квазиленейная амплификация в течение небольшого числа циклов является критически важной для следующего этапа ПЦР поскольку позволяет избежать неравномерного воспроизведения гДНК в ходе экспоненциальной амплификации. На этом финальном этапе полные ампликоны сами являются ДНК матрицей для экспоненциальной амплификации в ходе обычной ПЦР. Наличие линейного этапа предамлификации имеет большое значение, что выгодно отличает MALBAC технологию от DOP-PCR и MDA, позволяющее реализовать на ее основе диагностику вариации числа копий генов (Copy Number Variation, SNV) и минимизировать долю ложноотрицательных заключений при определении SNP.

На рис. 2 в качестве примера представлены образцы продуктов ПГА генетического материала бластомеров в 1,5% агарозном геле. Как видно из рисунка, после ПГА в образцах № 1, 2 и 3 выявили недостаточное количество генетического материала, что привело к сомнительным результатам при проведении дальнейших исследований.

Рис. 2 — Пример визуальной оценки качества ПГА.

М — маркер молекулярной массы. К — контрольная ДНК (ДНК, разведенная до концентрации 6,25 пг/мкл, что примерно соответствует концентрации ДНК в одной клетке). 1 — 7 — номера образцов генетического материала бластомеров после ПГА.

Длина амплифицированных фрагментов ДНК лежала в диапазоне длин от 300 до 600 п. н. Как уже отмечалось выше, из 35 образцов в 3-х визуально наблюдали тусклые полосы (бенды), характеризующие недостаточную амплификацию геномной ДНК.

HLA-генотипирование

HLA-генотипирование проводили c использованием коммерческих наборов на основе технологии SSO, принцип которой основан на амплификации геномной ДНК из образца с последующей гибридизацией на олигонуклеотидных зондах нанесенных на микросферы. Для исследования использовали генетический материал после ПГА, полученный от всех 35 эмбрионов, а также соответствующую геномную ДНК от всех родительских пар. Правильная комбинация всех родительских аллелей HLA генов II класса во всех исследованных локусах (DRB1, DQA и DQB) была определена в 31 (88,6%) образце (табл.1). В образцах амплифицированной ДНК с тусклой (3 эмбриона) или нормальной (1 эмбрион) визуализацией бендов на геле были определены не корректно одна из аллелей (3 случая) или обе аллели (1 случай).

Таблица 1 — Результаты HLA-генотипирования эмбрионов по локусам DRB1, DQA и DQB с указанием числа совпадений с родительскими аллелями.

Как видно из представленных данных в подавляющем большинстве случаев (88,6%) подтвердилась возможность проведения HLA-генотипирования после выполнения ПГА генетического материала бластомеров, полученных на 3-й день дробления эмбрионов. Для выполнения процедуры ЭКО, по возможности, отбирали эмбрионы, HLA гаплотип которых характеризовался максимальной гетерозиготностью по исследованным локусам HLA генов II класса.

Масс-спектрометрическая детекция полиморфизмов (SNP)

MALDI-TOF масс-спектрометрия позволяет быстро, с высокой точностью и производительностью определять наличие генетических полиморфизмов, не требуя использования дорогостоящих изотопных или флуоресцентных меток. Результат измерения представляет собой масс-спектр продуктов реакции минисеквенирования в виде пиков, соответствующих ионам определенной молекулярной массы, по которым выносят суждение о нуклеотидных заменах в данном положении [10].

Процесс идентификации SNP данным методом включает следующие основные этапы. На матрице геномной ДНК, выделенной из венозной крови пациента, проводят амплификацию фрагментов генов, включающих исследуемый SNP полиморфизм. Дале выполняют дефосфорилирование продуктов амплификации ДНК с целью гидролиза дНТФ, которые препятствуют реакции минисеквенирования. Для этого используется щелочная фосфатаза креветки (rSAP — от англ. recombinant Shrimp Alkaline Phosphatase), которая дефосфорилирует 5' - и 3'-монофосфатные концы олигонуклеотидов и нуклеотидов, но не проявляет активности в отношении молекул ДНК и РНК, имеющих на концах 2 — 3 фосфатных остатка. Для проведения минисеквенирования используют короткий олигонуклеотидный зонд (от 15 до 30 нуклеотидов), который отжигается на ДНК матрице непосредственно перед нуклеотидом, где может иметь место замена (полиморфизм), а также строго определенный набор из 2'-дезокси (dNTP) и 2', 3'-дидезокситринуклеотидов (ddNTP) — терминаторы (не способны создавать фосфодиэфирную связь со следующим нуклеотидом). В ходе минисеквенирования ДНК-полимераза достраивает зонд комплементарно матрице, в роли которой выступает амплифицированный фрагмент нужного гена, с образованием продуктов разной молекулярной массы. Принципиальная схема реакции минисеквенирования представлена на рис. 3.

Рис. 3 — Принципиальная схема реакции минисеквенирования и масс-спектрометрического анализа продуктов реакции

Например, на матрице ACCGATGGCCGATGCATC [C/Т] GTC (замена C>T) при использовании зонда с 5'-ACCGATGGCCGATGCATC-3' с наборам нуклеотидов dT, ddC и ddG, продуктами реакции минисеквинирования будут: продукт — ACCGATGGCCGATGCATC+ddC, в случае аллеля «С» (5758 Да); продукт — ACCGATGGCCGATGCATC+dT+ddG, в случае аллеля «Т» (6102 Да); оба продукта — при гетерозиготном генотипе (рис.4).

Рис. 4 — Пример реакции минисеквенирования с использованием зонда (5485 Да) и набора нуклеотидов dT, ddC, ddG с последующей детекцией ПЦР-продуктов (5758 Да и 6102 Да), соответствующих аллелям «С» и «Т»

В настоящем исследовании использовали времяпролетный масс-спектрометр MALDI-TOF «Autoflex speed T» (Bruker, Германия) и набор реагентов «SNP-экспресс-MS» (Литех, Россия) к SNP следующих генов: фактор Ляйдена (F5), MTHFR, MTR и МTRR. Все этапы реакции минисеквенирования выполняли согласно протоколу производителя. Продукты минисеквенирования в объеме 0,4 мкл, наносили на мишень («AnchorChip»), предварительно покрытую матрицей на основе 3-гидроксипиколиновой кислоты. После высушивания мишени с нанесенными образцами ее помещали в масс-спектрометр. Регистрацию и анализ масс-спектров выполняли при помощи стандартного пакета программ для масс-спектрометра «Autoflex Speed»: «Flex Control», «FlexAnalysis» и «Genotools» .

Рис. 5. — Пример мультиплексного определения в программе «Genotools» двух SNP гена аполипопротеина Е (ApoE): R158C (*2) C>T (гетерозигота, пик «1») и C112R (*4) T>C (гомозигота, пики «2» и «3»)

Для каждого из аллелей конкретного SNP в программе «Genotools» создавали соответствующий протокол, включающий нуклеотидную последовательность зонда, типы нуклеотидов и терминаторов. После записи всех протоколов программа позволяла автоматически рассчитывать параметры масс-спектров для всего набора SNP с определением соответствующих им аллелей. Пример, результата мультиплексного анализа в программе «Genotools», когда в одной пробе определяли несколько (два) SNP, показан на рис. 5.

В настоящем исследовании у эмбрионов потенциально пригодных для переноса исследовали SNP-профиль наиболее важных полиморфизмов, связанных с системой свертываемости крови. Это представляется особенно важным, например, для пациенток с наследственной формой тромбофилии, поскольку наличие данных мутаций у их эмбрионов может сказываться в дальнейшем на репродуктивной функции и высоком риске тромботических осложнений у потомков [4]. Для диагностики полиморфизмов использовали генетический материал после ПГА, полученный от всех 35 эмбрионов, а также соответствующую геномную ДНК всех родительских пар. Правильная комбинация всех родительских аллелей полиморфизмов в исследованных генах была определена в 32 (91,4%) образцах. В 3-х образцах амплифицированной ДНК демонстрирующих тусклую визуализацию бендов на агарозном геле полиморфизмы в генах MTHFR и MTR были определены не корректно по одной из родительских аллелей.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о возможности успешной реализации расширенного ПГС, который помимо диагностики хромосомных аномалий методом aCGH позволяет одновременно осуществить стратегию отбора эмбрионов на предрасположенность к различным заболеваниям (например, неблагоприятных SNP для генов системы свертывания крови), а также выбор эмбриона с оптимальным HLA гаплотипом в случаях выраженной совместимости родителей по HLA-генам.