Горох посевной. 
Хромосомная организация геномов растений с хромосомами малых размеров или малоинформативным рисунком дифференциального окрашивания

Применение 9-АМА позволило впервые изучить рисунки ORи С-окраски хромосом 8 сортов гороха посевного (Pisum sativum L.), который имеет размеры хромосом, сходные с ромашкой. При С-окрашивании хромосом гороха выявляются небольшие прицентромерные и теломерные, а также мелкие интеркалярные С-бэнды. На основании оценки морфологии хромосом и рисунков С-бэндинга была проведена идентификация хромосом в геноме гороха в соответствии со стандартной цитогенетической номенклатурой Бликста (Рис. 21а) [Blixt, 1959].

Рис. 21. Кариотипы P. sativum L.: C- (а) и OR- (б) дифференциальное окрашивание хромосом. Компьютерное совмещение последовательно окрашенных хромосом ацетоорсеином (красный) и DAPI (синий) (в). 1−7 — номера хромосом в соответствии со стандартной номенклатурой Бликста.

Рисунки С-бэндинга хромосом у сортов овощного, сахарного, кормового и зернового гороха различались по размерам прицентромерных и приспутничных гетерохроматических блоков, а также интеркалярных С-бэндов в коротких плечах 2, 3, 4 и 7 хромосом и в длинных плечах хромосом 1 и 5.

Четкий OR-бэндинг c большим числом темноокрашенных районов был выявлен на хромосомах тех же сортов гороха. По рисункам OR-окраски идентифицированы все хромосомы (Рис. 21б). Также как и С-окрашенные хромосомы, они были расположены по размерам и центромерному индексу в соответствии с номенклатурой Бликста. Было проведено последовательное (Рис. 21в) OR-, а затем С/DAPI-окрашивание (Рис. 21а и 22а) хромосом гороха, которое подтвердило правильность такого подхода при их идентификации. Межсортовых различий по рисункам OR-окраски не было выявлено.

При исследовании хромосом гороха было обнаружено, что на профазных и прометафазных хромосомах после предобработки 9-АМА и процедуры FISH выявляется Q-подобный DAPI-бэндинг. В зависимости от фазы митоза DAPI-бэндинг может быть различной степени разрешения. По мере компактизации хромосом Q-подобный DAPI-бэндинг переходит в С-подобный DAPI-бэндинг (C/DAPI-бэндинг) (Рис. 22а).

Рис. 22. Кариограммы и идиограммы DAPI-окрашенных (инвертированное изображение) хромосом гороха (1−7 — номера хромосом в соответствии со стандартной номенклатурой Бликста): а — разные степени разрешения DAPI-бэндинга (на профазных хромосомах суммарное число DAPI-полос на гаплоидный набор хромосом гороха равно 344); б — точная локализация точек разрывов хромосом в транслокационных линиях гороха L-108 и M-10 по рисункам высокоразрешающего DAPI-окрашивания.

Это обстоятельство позволяет подобрать степень конденсации хромосом, при которой по рисунку DAPI-бэндинга возможно идентифицировать хромосомы и при необходимости локализовать на них точки хромосомных перестроек или ДНК-зонды. С помощью такого подхода была изучена структура кариотипов транслокационных линий L-108 и M-10 гороха. DAPI-бэндинг высокого разрешения позволил точно установить на профазных-прометафазных хромосомах точки разрыва хромосом при транслокациях (Рис. 22б). Для линии L-108 выявлены точки разрывов в проксимальных районах коротких плеч хромосом 2 и 7. Для линии М-10 впервые установлено наличие двойной транслокации между длинными и короткими плечами хромосом 2 и 4.

Сравнительное исследование рисунков DAPI-бэндинга хромосом у всех восьми сортов и 2 родственных линий (с высоким симбиотическим потенциалом) гороха, выявленных после FISH картирования рибосомных генов и теломерного повтора, обнаружило невысокий уровень внутрии межсортового полиморфизма, подобно С-окраске (Рис. 23).

У всех изученных образцов гороха 26S рДНК находится в районах вторичных перетяжек и на спутнике 4 хромосомы и в приспутничном районе 7 хромосомы. Сайты 5S рДНК располагались на 1, 3 и 5 хромосомах, причем высокоразрешающее DAPI-окрашивание дало возможность уточнить районы локализации 5S рДНК. Теломерные повторы выявлялись на концах всех хромосом (см. раздел 1.3.1, рис. 6) как в нормальных, так и в транслокационных кариотипах. Дополнительных сайтов гибридизации с рДНК и теломерными последовательностями не выявлено (Рис. 23).

Ag-ЯОР-окрашивание показало, что в изученных образцах гороха оба локуса 26S рДНК, расположенные на хромосомах 4 и 7, функционально активны. В линиях гороха, несущих транслокации по ЯОР-образующим хромосомам 4 и 7, изменений функциональной активности ЯОР в этих хромосомах не обнаружено.

Рис. 23. Хромосомы гороха сорта Frisson: а — С-бэндинг, б — FISH-картирование 45S (зеленый) и 5S (красный) рДНК, в — идиограмма хромосом с указанием расположения С/DAPI-бэндов (черный), 45S (зеленый) и 5S (красный) рДНК 1−7 — номера хромосом в соответствии со стандартной номенклатурой [Blixt, 1959; Fuchs et al., 1998].

Исследование геномного полиморфизма у изученных сортов и линий гороха методом RAPD-PCR-анализа в полиакриламидном геле с 3 информативными праймерами А06, А09 и А10 в выявило между ними различия по 45 полиморфным локусам. RAPD-спектры всех исследованных представителей сорта или линии делились на кластеры в четком соответствии с сортовой принадлежностью. В кластерах линии Sprint 2 и сорта Finale обнаружен геномный полиморфизм между изученными индивидуальными растениями. Полученные нами результаты подтверждают возможность применения RAPD-анализа для идентификации сортов гороха [Гостимский и др., 2005].

Таким образом, значительных кариотипических различий исследованных сортов и линий гороха выявлено не было. Тем не менее, даже небольшие специфические особенности их геномов могут служить основой для создания кариогеномного паспорта. Такой подход может быть особенно важен для сертификации определенного генотипа гороха посевного при создании новых сортов и проверке чистоты суперэлитного и элитного семенного материала.