Антигипоксическое действие нейротрофического фактора головного мозга в условиях нормобарической гипоксии in vitro

Моделирование нормобарической гипоксии проводилось в период стабильной работы зрелых сетей первичных культур гиппокампа, на 33 день развития культур in vitro путем замены нормоксической культуральной среды на среду с низким содержанием кислорода в течение 10 минут. Предварительно за 20 минут до начала эксперимента в опытной группе в среду культивирования добавляли BDNF в концентрации 1 нг/мл. Контрольным культурам моделирование гипоксии проводилось без аппликации нейротрофического фактора. Интактная группа воздействию нормобарической гипоксии не подвергалась.

В результате проведенного исследования было показано, что воздействие острой нормобарической гипоксии негативно влияет на спонтанную биоэлектрическую активность первичных гиппокампальных культур. Так, со второй минуты пребывания первичных культур контрольной группы в гипоксической среде зарегистрировано существенное снижение количества малых сетевых пачек (рис. 14A). На временном промежутке 3−10 минут сетевая активность по данному показателю статистически достоверно отличалась как от исходной активности культур, так и от активности интактной группы. Схожая динамика наблюдалась и по частоте внеклеточных потенциалов действия (рис. 14Б).

По сравнению с культурами, которые не подвергались гипоксическому воздействию, со второй минуты регистрации в контрольной группе происходил резкий спад активности и, начиная с третьей минуты и до окончания моделирования нормобарической гипоксии, мультиэлектродной матрицей регистрировались единичные внеклеточные потенциалы действия.

На данном интервале времени частота спайков контрольной группы была достоверно ниже исходного уровня активности. Также для культур, которые находились в гипоксической среде, выявлены достоверные различия по количеству внеклеточных потенциалов действия от интактной группы.

Аналогично в группе с превентивным добавлением BDNF, 1 нг/мл наблюдалось снижение спонтанной биоэлектрической активности в течение 10-минутного эпизода нормобарической гипоксии (рис. 14).

Рисунок 14. Динамика спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур клеток гиппокампа в течение 10-минутной нормобарической гипоксии. А — количество малых сетевых пачек; Б — количество спайков в секунду. * - достоверность различий с исходным уровнем активности, # - достоверность различий с группой «Нормоксия», а — достоверность различий с группой «Гипоксия», p < 0,05 (критерий Манна-Уитни).

Однако данное снижение развивалось медленнее, чем в контрольной группе. Достоверное снижение числа малых сетевых пачек относительно интактных культур произошло на 5 минуте действия гипоксии и на 6 минуте по сравнению с исходным уровнем активности. Количество малых сетевых пачек и частота внеклеточных потенциалов действия опытных культур были достоверно выше показателей контрольной группы.

Таким образом, применение нейротрофического фактора способствовало поддержанию сетевой пачечной активности культур во время действия нормобарической гипоксии. Тем не менее, на фоне гипоксического воздействия происходило изменение структуры сетевой пачки импульсов. Показано, что на временном промежутке 3−10 минут частота внеклеточных потенциалов действия статистически достоверно снижалась относительно исходного уровня активности, и отличалась от значения интактной группы в интервале 5−7 минут.

Реоксигенация вызывала усиление сетевой активности нейронов относительно исходного уровня в контрольной группе. Паттерн спонтанной биоэлектрической активности изменялся за счет увеличения количества малых сетевых пачек (количество пачек за 10 минут до гипоксии составлял 38,2±7,83, после реоксигенации 101,7±23,67) и незначительном увеличении среднего числа спайков в пачке (до гипоксии 251,8±102,1, после реоксигенации 432,7±141,3). Однако через 2 часа после моделирования гипоксии происходило необратимое снижение спонтанной биоэлектрической активности (количество пачек за 10 минут 3±5,67, среднее число спайков в пачке 508±232,98).

Проведено исследование спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур клеток гиппокампа в тдленном постгипоксическом периоде. Как видно из рисунка 15, количество малых сетевых пачек в культурах, которые не подвергались воздействию нормобарической гипоксии, в течение всего времени наблюдения достоверно не изменялось.

При рассмотрении спонтанной биоэлектрической активности опытных групп было показано, что кратковременная нормобарическая гипоксия вызывает необратимые изменения сетевой активности нейронов в отдаленном постгипоксическом периоде. Так, на первые сутки после воздействия количество малых сетевых пачек в контрольных культурах достоверно снизилось относительно исходной активности в 4,9 раза. Статистически достоверное снижение спонтанной биоэлектрической активности обнаружено и в группе с превентивным введением BDNF, 1 нг/мл. Однако количество малых сетевых пачек было достоверно выше значений контрольной группы, а снижение активности относительно исходного уровня произошло лишь в 1,5 раза.

На 3 сутки постгипоксического периода количество малых сетевых пачек в опытных группах осталось статистически достоверно ниже относительно исходного уровня активности. Следует отметить, что по отношению к первым суткам постгипоксического периода в группе с аппликацией BDNF, 1 нг/мл данный показатель не изменился.

На 7 сутки после моделирования нормобарической гипоксии в контрольной группе малые сетевые пачки не зарегистрированы, в то время как у культур с превентивным добавлением BDNF, 1 нг/мл достоверных различий с исходным количеством малых сетевых пачек не обнаружено.

Таким образом, кратковременная нормобарическая гипоксия приводила к ингибированию сетевой пачечной активности культур в отдаленном постгипоксическом периоде, что, вероятно, обусловлено редукцией синаптических контактов и гибели функционально активных нейронов. Применение нейротрофического фактора нивелировало негативные последствия кислородного голодания, сохраняя сетевую пачечную активность культур клеток гиппокампа на определенном функциональном уровне с дальнейшем восстановлением в постгипоксическом периоде.

Рисунок 15. Количество малых сетевых пачек диссоциированных культур гиппокампа, регистрируемых за 10 мин записи на 1, 3 и 7 сутки постгипоксического периода. * - достоверность различий с исходным уровнем, # - достоверность различий с группой «Гипоксия», p < 0,05 (критерий Манна-Уитни).

Влияние кратковременной нормобарической гипоксии также негативно сказывалось на структуре сетевых пачек (рис. 16). Уже на первые сутки после острого кислородного голодания в контрольной группе установлено статистически значимое снижение количества спайков в пачке. Данная тенденция сохранялась на протяжении всего периода наблюдения. На 7-е сутки после кратковременной нормобарической гипоксии были зарегистрированы лишь единичные внеклеточные потенциалы действия.

Эффект BDNF проявлялся в сохранении среднего числа спайков в пачке в отдаленном постгипоксическом периоде. Достоверных различий по сравнению с исходной активностью культур не обнаружено.

Рисунок 16. Количество спайков в пачке диссоциированных культур клеток гиппокампа, регистрируемых за 10 мин записи на 1, 3 и 7 сутки постгипоксического периода. * - достоверность различий с исходным уровнем, # - достоверность различий с группой «Гипоксия», p < 0,05 (критерий Манна-Уитни).

Следовательно, можно предположить, что превентивное добавление нейротрофического фактора предотвращало изменения структуры сетевой пачки импульсов, вызванные гипоксическим воздействием. Данное предположение было подтверждено при анализе паттернов активации спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур клеток гиппокампа (рис. 17).

Также, как и в случае аппликации BDNF в культуры с нормоксическими условиями культивирования, добавление нейротрофического фактора в культуры с острой гипоксией вызывало уменьшение времени активации нейронов в составе сетевой пачки, обуславливая развитие более синхронизированного начала пачечной активности сети в целом.

Рисунок 17. Паттерн активации спонтанной биоэлектрической активности диссоциированной культуры гиппокампа. А — активность контрольной культуры до гипоксии и через 24 часа после реоксигенации; Б — активность культуры до аппликации BDNF (1нг/мл) и через 24 часа после аппликации и гипоксии. Цветовая диаграмма — время появления спайков в сетевой малой пачке, регистрируемых с электродов, мс.

Мы предположили, что снижение спайковой активности нейронов в составе нейронной сети в контрольной группе в течение суток после воздействия нормобарической гипоксии, связано с гибелью нейронов. В группе с предварительным введением нейротрофического фактора, вероятно, наблюдалось сохранение нейронов в отдаленном постгипоксическом периоде. Для подтверждения этого предположения, мы оценили жизнеспособность нейронов в отдаленном постгипоксическом периоде.

Оценка жизнеспособности диссоциированных культур клеток гиппокампа проводилась на 33 DIV до моделирования нормобарической гипоксии и на 3 и 7 сутки постгипоксического периода. Показано, что количество живых клеток в интактных культурах на протяжении всего периода наблюдения не изменялось (и составляло 88−92%). Кратковременная нормобарическая гипоксия приводила к гибели основной части клеток в течение первых трех суток постгипоксического периода.

Уже через 24 часа после острого 10-минутного эпизода гипоксии появляются первые морфологические изменения в контрольной группе культур в виде некротизированых и апоптотических клеточных элементов, число которых увеличивалось в течение 7 последующих дней (рис. 18).

Рисунок 18. Процент мертвых (пропидиум иодид положительных клеток) в диссоциированных культурах гиппокампа до гипоксии (33 DIV), на 3 (36 DIV) и 7 (40 DIV) сутки постгипоксического периода (0,37 мл/л О2). * - достоверность различий с исходным уровнем; # - достоверность различий с контрольной группой, p < 0,05 (критерий Стьюдента).

Установлено, что количество мертвых клеток в группе без предварительной аппликацией нейротрофического фактора за первые трое суток статистически достоверно увеличилось в 4 раза по сравнению с нормоксическими условиями и составило 43% от общего числа клеток.

При исследовании морфологической структуры и жизнеспособности за семидневный постгипоксический период группы культур с превентивным добавлением BDNF, 1нг/мл было установлено, что количество мертвых клеток значительно ниже по сравнению с контрольными клеточными культурами. Через 7 суток после гипоксии количество мертвых клеток в среднем составляло всего 20% от общего числа клеток в культуре, что достоверно в 2,35 раза ниже, чем в контрольной серии (р<0,05 критерий Манна-Уитни).

Таким образом, проведенные эксперименты выявили, что 10-минутная нормобарическая гипоксия вызывает необратимые изменения в спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур гиппокампа. Наблюдалось снижение количества сетевых пачек импульсов и количества спайков в пачке и их ингибирование через 2−3 минуты после начала воздействия. Кроме того, в первые трое суток после моделирования нормобарической гипоксии в 4,2 раза возрастает количество мертвых клеток в контрольных культурах. Применение BDNF, 1нг/мл за 20 минут до 10-минутного эпизода гипоксии предупреждает все обнаруженные негативные эффекты кислородного голодания. В условиях гипоксии наблюдалось частичное сохранение биоэлектрической активности, после реоксигенации количество мертвых клеток достоверно ниже, чем в культурах без добавления нейротрофического фактора.

Антигипоксическое защитное действие BDNF в условиях кислородного голодания вероятно обусловлено сохранением окислительного фосфорилирования как основной функции митохондриальной дыхательной системы клеток. Однако вопрос о конкретном сигнальном механизме, который запускается нейротрофинами при гипоксии и приводит к повышению резистентности клеток, остается до конца не изученным.

Действие BDNF на клетки нервной системы связано с активацией большого числа внутриклеточных метаболических каскадов, опосредованных взаимодействием молекулы нейротрофина с двумя типами мембранных рецепторов (Сахарнова и др., 2012): низкоафинным рецептором к NGF (low-affinity nerve growth factor receptor, LNGFR), или p75, и высокоафинным тирозинкиназным рецептором В — TrkB (Patapoutian A., Reichardt L.F., 2001). Для изучения роли высокоафинного рецептора TrkB использовался селективный антагонист k252а (Sigma, K2015).

Показано, что применение k252а (150 нМ) полностью нивелирует положительные эффекты BDNF (1 нг/мл) при действии гипоксии (рис. 19).

Рисунок 19. Влияние нейротрофического фактора BDNF на изменение показателей спонтанной биоэлектрической активности первичной диссоциированной культуры гиппокампа через 7 суток после моделирования острой нормобарической гипоксии. * - достоверность различий с группой «Нормоксия»; ** - достоверность различий с группой «Гипоксия», (ANOVA, р<0,05, n=16).

Анализ спонтанной биоэлектрической активности через 7 дней после воздействия гипоксии показал полное угнетение сетевой пачечной активности при применении антагониста TrkB. При использовании k252а (150 нМ) более чем у 72% культур через 7 суток после гипоксии не выявлено сетевой пачечной активности. Исследование жизнеспособности клеток в первичной диссоциированной культуре гиппокампа также показало, что применение антагониста тирозинкиназного рецептора достоверно (р<0,01) увеличивает количество погибших клеток после воздействия гипоксии (рис. 20).

Рисунок 20. Количество мертвых (пропидиум иодид положительных) клеток в диссоциированных культурах гиппокампа на 7 сутки постгипоксического периода. Данные нормированы относительно группы «Нормоксия». * - достоверность различий с группой «Нормоксия»; # - достоверность различий с группой «Гипоксия», ANOVA, p < 0,05, n=12.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, о том, что все положительные эффекты, оказываемые нейротрофическим фактором головного мозга во время гипоксии, связаны с TrkB-рецептором. Блокада данного рецептора полностью нивелирует антигипоксические и нейропротективные эффекты BDNF (1 нг/мл) при гипоксии.

В ряде публикаций показано, что поддержание выживаемости нейронов посредством BDNF осуществляется через активацию внеклеточной сигнал-регулирующей киназы (ERK) или MAPK пути (Han B.N. et al., 2000, Hetman M. et al., 2004), в то время как другие исследователи представляют доказательства того, что в данном процессе участвует PI-3-киназный сигнальный механизм (Nakazawa T. et al., 2002, Veit C. et al., 2004). Также существуют данные о том, что p38 МАРК (один из сигнальных путей активации митогенактивированных протеинкиназ) играет роль в нейропротекции (Irving E.A., Bamford M., 2002, Park J.Y. et al., 2004). Одним из известных молекул-мишеней МАРК и PI-3-киназы является цАМФ-зависимый транскрипционный фактор (CREB). Это важный компонент данных сигнальных путей, ведущий к изменениям в экспрессии генов. Предполагается, что CREB способствует BDNF-опосредованному выживанию нейронов в центральной нервной системе, активируя антиапоптотическую экспрессию генов. Фосфорилирование участка CREB Ser133 нейротрофинами необходимо для активации CREB-опосредованных транскрипционных факторов (Arthur J.S.C. et al., 2004). В недавнем исследовании in vitro нейронов коры головного мозга в условиях циркуляторной гипоксии (гипоксии/ишемии) было показано, что экзогенное применение BDNF способствует повышению количества выживших кортикальных нейронов после повреждающего воздействия через активацию и MAPK, и PI3-киназного сигнальных путей, приводящих к активации фосфорилирования СREB. В большей части данный процесс связан с внеклеточной сигнал-регулирующей киназой ERK (Sun X. et al., 2008).

В 2012 году в экспериментах in vitro было исследовано действие BDNF на метаболизм кислорода в митохондриях мозга мышей (Markham A. et al., 2004, 2012). В случае инкубации с синаптосомами эффект BDNF выражался в концентрационно-зависимом повышении респираторного контрольного индекса (Respiratory control index, RCI, показатель эффективности дыхательной цепи, синтеза АТФ и целостности органелл). При этом в экспериментах на выделенных митохондриях BDNF не демонстрировал подобного эффекта и усиливал окисление только в случае использования субстратов митохондриального ферментативного комплекса I. Митохондриальный эффект BDNF контролировался MAPK сигнальным путем, а ингибитор митохондриального ферментативного комплекса I, ротенон, способен in vitro и in vivo ингибировать как митохондриальный, так нейропротективный эффект BDNF (Markham A. et al., 2004, 2012).

Таким образом, способность BDNF положительно влиять на метаболические процессы и эффективность утилизации кислорода в мозге демонстрирует исключительную его важность как компонента антигипоксической системы защиты клеток, способного повышать выживаемость нейронов и сохранять функциональность нейронных сетей в условиях гипоксии.