Влияние BDNF на спонтанную биоэлектрическую активность диссоциированных культур клеток гиппокампа на 14 день развития in vitro
В результате проведенного исследования было показано, что при добавлении в среду культивирования нейротрофического фактора BDNF происходят изменения спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур. Наиболее значимые изменения были выявлены при анализе длительности малой сетевой пачки импульсов (рис. 10). Так, обнаружено, что на временном промежутке 15−20 минут после добавления… Читать ещё >
Влияние BDNF на спонтанную биоэлектрическую активность диссоциированных культур клеток гиппокампа на 14 день развития in vitro (реферат, курсовая, диплом, контрольная)
На 14 день развития in vitro в среду культивирования в опытных группах добавляли нейротрофический фактор BDNF в конечной концентрации 0,1 нг/мл, 1 нг/мл и 10 нг/мл, а в контрольной группе — раствора альбумина в PBS. Регистрацию спонтанной биоэлектрической активности осуществляли до аппликации веществ, в течение 20 минут после добавления, через 2 и 24 часа.
В результате проведенного исследования было показано, что при добавлении в среду культивирования нейротрофического фактора BDNF происходят изменения спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур. Наиболее значимые изменения были выявлены при анализе длительности малой сетевой пачки импульсов (рис. 10). Так, обнаружено, что на временном промежутке 15−20 минут после добавления в среду культивирования BDNF, 0,1 нг/мл данный показатель достоверно (p<0,05) увеличился по сравнению с исходным уровнем в среднем на 70% (от 0,65±0,16 с до 1,11±0,19 с). Кроме того, длительность малой сетевой пачки достоверно (p<0,05) возросла относительно активности контрольных культур. Однако нейротропный эффект носил транзиторный характер (не менее 20 минут), и через 2 часа после аппликации BDNF спонтанная биоэлектрическая активность возвращалась к исходным значениям и не отличалась от активности контрольных культур, получавших раствор альбумина.
Схожая динамика изменений спонтанной биоэлектрической активности наблюдалась в группе первичных культур гиппокампа с применением BDNF в концентрации 1 нг/мл (рис. 10).
Риунок 10. Влияние нейротрофического фактора BDNF на (А) количество малых сетевых пачек/5 мин; (Б) количество спайков в сетевой пачке; (В) длительность малой cетевой пачки импульсов на 14 день развития in vitro. * - достоверность различий с исходным уровнем; # - достоверность различий с контрольной группой, p < 0,05 (критерий Манна-Уитни) Однако эффект действия нейротрофического фактора в данной концентрации был более выражен и проявлялся в более ранний период по сравнению с культурами, получавшими BDNF, 0,1 нг/мл. Через 10−15 минут длительность малой сетевой пачки была достоверно больше (p<0,05) как относительно исходной активности, так и от активности контрольных культур и культур с аппликацией BDNF, 0,1 нг/мл. На 20 минуте регистрации спонтанной биоэлектрической активности длительность пачки в среднем достоверно (p<0,05) превысила исходные значения на 83% (с 0,698±0,09 с до 1,286±0,21 с), но уже не отличалась от значений, полученных в группе с меньшей концентрацией BDNF. Через 2 и 24 часа после добавления нейротрофина спонтанная биоэлектрическая активность группы культур BDNF, 1 нг/мл статистически не отличалась от первоначальных и контрольных значений.
При оценке длительности малой сетевой пачки в группе с добавлением в среду культивирования BDNF, 10 нг/мл показано, что к 10−15 минуте (рис. 9) наблюдения обнаружено статистически достоверное (p<0,05) увеличение длительности малой сетевой пачки как относительно исходных, контрольных значений, так и значений, полученых при аппликации BDNF, 0,1 нг/мл, но не относительно значений, регистрируемых при аппликации BDNF, 1 нг/мл. Таким образом, повышение концентрации BDNF в 10 раз не вызвало дальнейшего увеличения длительности малой пачки. Таким образом, нейротропное действие BDNF в концентрации 1 нг/мл и 10 нг/мл было одинаковым и превышающим эффект от влияния BDNF, 0,1 нг/мл.
Нейротропный эффект BDNF длился кратковременно и через 2 часа после добавления нейротрофического фактора в различных концентрациях активность нейронных сетей возвращалась к исходному уровню, статистически достоверных различий относительно исходной активности и активности контрольных культур не было обнаружено.
Кроме этого, аппликация различных концентраций нейротрофического фактора приводила к изменениям функциональных характеристик сетевой пачки импульсов, отражающих индивидуальную структуру нейронной сети диссоциированных культур клеток гиппокампа. В отличие от контрольной группы культур, в которой добавление альбумина на 14 DIV не вызывало изменения интегративного показателя автивности функциональной сети — «паттерна активации», в опытных группах аппликация BDNF (0,1 нг/мл, 1 нг/мл, 10 нг/мл) вызывала изменение внутренней структуры функциональной нейронной сети. Добавление в среду культивирования нейротрофического фактора повышало, вероятно, эффективность синаптической передачи, что приводило к увеличению количества нейронов, время активации которых было не более 50 мс. Подобная синхронизация нейронов в сети наблюдалась через 24 часов после аппликации (рис. 11).
Рисунок 11. Паттерн спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур гиппокампа (DIV 14). Слева — активность культур до аппликации, справа — через 24 часа после аппликации. А — контрольная культура; Б — BDNF, 0,1 нг/мл; В — BDNF, 1 нг/мл; Г — BDNF, 10 нг/мл. Цветовая диаграмма — время появления спайков в сетевой малой пачке, регистрируемых с электродов, мс.
Следует отметить, что степень синхронизации спайков зависела от концентрации добавляемого нейротрофического фактора. Наибольший эффект был отмечен при применении BDNF (10 нг/мл), на большинстве электродов время появления спайков в сетевой пачке было не более 15 мс.
Таким образом, в результате аппликации нейротрофического фактора BDNF на 14 DIV происходило изменение спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур клеток гиппокампа, регистрируемое по увеличению длительности малой сетевой пачки импульсов при отсутствии изменения в количестве спайков в пачке. В зависимости от концентрации добавляемого в среду культивирования нейротрофина, увеличение длительности малой сетевой пачки развивалось в течение 15 минут в случае применения BDNF в концентрации 1 нг/мл и 10 нг/мл и 20 минут в случае применения BDNF в концентрации 0,1 нг/мл. Кроме того, изменения происходили в структуре и функциональных характеристиках самой сетевой пачки импульсов. Аппликация различных концентраций BDNF дозо-зависимо приводила к общей синхронизации работы нейронных сетей, за счет снижения времени активации нейронов при развитии сетевой пачки.
Ранее (Агрба, Мухина, 2013, Широкова с соавт., 2013) было показано, что 14 день развития диссоциированных культур клеток гиппокампа in vitro высокой плотности характеризовался началом развития зрелых популяций синапсов с преобладанием аксошипиковых и аксодендритных асимметричных контактов между близлежащими нейронами и формированием сетевой пачечной активности с варьируемой частотой следования сетевых пачек импульсов. Поскольку изменение спонтанной биоэлектрической активности в ответ на добавление нейротрофического фактора развивалось только на 14 DIV при появлении зрелых химических синапсов и не в течение секунд, а в течение 10−15 минут и длительностью не менее 10 минут, следует предположить, что полученный положительный нейротропный эффект является медленным TrkB-зависимым и обусловлен, вероятно, непрямой активацией постсинаптических AMPA-, NMDAи GABAа-рецепторов (Caldeira M.V. et al., 2007, Porcher C. et al., 2011), а также, возможно, специфических Na±ионных каналов (Nav1.9) (Rose C.R. et al., 2004).