Исследование полиморфизма гена L-myc (T3109G) в прогнозировании риска токсических осложнений при лечении неходжкинских лимфом

Семейство транскрипционных белков L-myc занимает важное место в регуляции пролиферации и дифференциации клеток [1], первоначально они были найдены в клетках рака легкого, а затем в ряде работ были доказаны их протоонкогенные свойства [2, 3]. В опухолевых клетках выявляют амплифицированные формы данного белка, которые нарушают общие механизмы регуляции, что присуще канцерогенезу [4]. Онкогенный потенциал данного семейства белков связывают в основном с его количественным увеличением, которое сопутствует не только малигнизации, но и метастазированию опухоли, ее агрессивному течению [5]. В последнее время усиленное внимание к данному семейству транскрипционных белков обусловлено появлением возможности разработки новых классов эффективных противоопухолевых препаратов [5, 6].

Полиморфизм гена L-myc также изучали в контексте оценки агрессивности опухолевых заболеваний и прогноза их течения [1, 3]. С нашей точки зрения данный интерес был вызван тем, что воздействие экспрессии гена, через ряд трансформаций клетки, нарушает в разной степени апоптические процессы [4]. Ряд авторов считает, что именно восстановление контроля над экспрессией гена L-myc будет успешным шагом в терапии многих опухолей, поскольку большинство опухолевых клеток зависимы от его воздействие вследствие метаболического перепрограммирования, нарушения апоптоза и токсического воздействия на организм [5]. Сочетанное токсическое действие опухолевого процесса и проводимой цитостатической терапии значимо влияет на индивидуальный прогноз больного [6, 7].

Токсические эффекты у больных с неходжкинскими лимфомами (НХЛ) при проведении курсов полихимиотерапии (ПХТ) вариабельны, часто носят непредсказуемый характер и способствуют ухудшению течения заболевания [8, 9]. Механизмы возникновения токсических эффектов и их клинические проявления хорошо изучены для курсов ПХТ при отдельных онкогематологических заболеваниях. При этом отмечается отсутствие четких прогностических маркеров токсичности [7]. Лечение НХЛ наиболее часто сопровождается клиническими проявлениями гематологической токсичности, особенно у лиц старше 60 лет. В зарубежных руководствах по диагностике и лечению приводят схемы ПХТ с учетом ряда особенностей пациентов, и в первую очередь — возраста. Важное внимание уделяется назначению колониестимулирующего фактора с профилактической целью. В целом схемы ПХТ применяемые при лечении диффузных крупноклеточных лимфом (ДККЛ) и мелких клеточных лимфом (МКЛ) не отличаются высокой токсичностью [10−12].

Токсические эффекты возникают не ранее двух курсов ПХТ, обычно их выявляют в течение первых четырех курсов [13], чаще регистрируют миелосупрессию с нейтропенией, реже — анемии или тромбоцитопении III-IV степени [9]. Нарушения функции печени и почек развиваются у отдельных пациентов с рефрактерными и агрессивными формами лимфом. Применение доксорубицина и винкристина в схемах ПХТ может обуславливать гепатологическую токсичность, а циклофосфамида — нефрологическую токсичность [14]. Флюдарабин и бендамустин обладают большей токсичностью, но в тоже время более эффективны. Применение менее токсических препаратов не улучшает эффективность лечения больных с НХЛ [9, 15].

Прогностические маркеры гематологической и негематологической токсичности являются мало изученными. Независимым предиктором миелосупрессии при лечении НХЛ, по данным отдельных авторов [8] являются воспалительные симптомы, которые выявляют не у всех больных. А нарушение апоптоза в опухолевых клетках носит распространенный характер. Метаболическое перепрограммирование опухолевых клеток, с участием мутантных изоформ L-myc [5, 6, 16, 17], продуцируемых в зависимости от полиморфизма гена L-myc, может стать важным прогностическим маркером.

Определить влияние полиморфных вариантов гена L-myc (T3109G) на риск развития гематологической и негематологической токсичности при проведении ПХТ у пациентов с различными формами НХЛ.

Представленное исследование выполнено в отделении гематологии Киевского областного онкологического диспансера. Коммунального предприятия Киевского Областного Совета «Киевский областной онкологический диспансер». Было обследовано 70 больных с диффузной крупно-клеточной неходжкинской лимфомой (ДККЛ) и 50 больных с хроническим лимфолейкозом/мелкоклеточной лимфомой (МКЛ). Возраст больных c ДККЛ был от 24 до 78 лет, их средний возраст составил 57,85± ±14,29 лет, а возраст больных с МКЛ был от 48 до 78 лет, и средний возраст — 63,66±9,27 лет. У больй ных специализированное лечение включало применение стандартных протоколов R-CHOP, CHOP и их модификаций [12, 18, 19]. Учитывая имеющиеся клинико-лабораторные подходы к определению риска токсических осложнений и редукции планируемой цитостатической терапии определили критерии включения в исследование. Критериями включения в исследование служили — отсутствие ВИЧ-инфицирования, а также предшествующих началу лечения: заболеваний внутренних органов и органной недостаточности (кардиальной, легочной, печеночной и почечной), снижения лейкоцитов, требующих обычно изменения числа и продолжительности курсов полихимиотерапии (ПХТ), особенно для больных старше 60 лет. Критериям включения соответствовали 34 пациента с ДККЛ и 29 пациентов с МКЛ. Всем больным было проведено полное необходимое клинико-лабораторное обследование. Были оценены клинико-лабораторные параметры, которые достоверно у больных с ДККЛ и МКЛ не различались [20]. В течение первых четырех курсов ПХТ у больных проводилась оценка клинико-лабораторных маркеров гематологической и негематологической токсичности, а также проводилось распределение в подгруппы по принципу наличия или полного отсутствия токсических проявлений и/или вида токсических осложнений для проведения статистического анализа. Всем пациентам, включенным в исследование, проводили молекулярно-генетическое тестирование полиморфизма гена L-myc (T3109G). Забор периферийной крови проводили в моноветы объемом 2,7 мл с калиевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты в качестве антикоагулянта («Sarstedt», Германия). Геномную ДНК для молекулярно-генетического исследования полиморфизма гена L-myc (T3109G) выделяли из лейкоцитов периферийной крови при помощи коммерческой тест-системы «ДНК-сорб-В». К цельной крови добавляли лизирующий раствор и сорбент на силикогеле. После лизиса, отмывали образцы растворами для отмывки № 1 и № 2 соответственно инструкции. Для эллюции ДНК с сорбента добавляли ТЕ-буфер. Полученный супернатант, содержащий очищенную ДНК, использовали для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Для определения полиморфизма T3109G (rs3134613) в гене L-myc использовали модифицированные протоколы [21] с применением метода ПЦР и последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ). Специфичные фрагменты исследуемого полиморфизма амплифицировали с использованием комерческого набора DreamTaq Green PCR Master Mix (фирмы «Thermo Scientific», США).с соблюдением условий проведения реакции (табл. 1).

Больным, соответствующим критериям включения в исследование, были проведены курсы ПХТ в соответствии с нозологическими формами заболевания. В табл. 3 приведены данные по проведенным первым 4 курсам ПХТ у обследованных нами больных.

полихимиотерапия неходжкинский лимфома токсический Табл. 1.

17 пациентам с ДККЛ после установления диагноза были назначены стандартные курсы ПХТ R-CHOP и 12 пациентам курсы CHOP, пяти остальным пациентам, из числа включенных в исследование, были назначены модифицированные протоколы с учетом имеющихся клинических особенностей. У 4 (11,76%) из 34 обследованных Состояние рестриктов в полиморфном локусе T3109G гена L-myc после гидролитического расще-пления анализировали в 3% агарозном геле (агароза «Thermo Scientific», США), с добавлением бромисто-го этидия, маркера молекулярного веса GeneRuler 50 bp DNA Ladder («Thermo Scientific», США) и дальнейшей визуализацией в траниллюминаторе и компьютерной обработкой (рис. 1).

Клинико-лабораторные показатели и резуль-таты генотипирования в анализируемых группах сравнивали с применением методов вариационной статистики и бинарной логистической регрессии (программа SPSS₁₇.0) пациентов с ДККЛ в связи с отсутствием клинического эффекта или прогрессированием заболевания произвели смену проводимых курсов или добавили в схему ПХТ ритуксимаб. Восьми пациентам с МКЛ была назначена схема CHOP, а 17 пациентам — схема COP, двум пациентам модифицированные протоколы и двум терапия монопрепаратами (флюдарабином и лейкераном). В группе пациентов с МКЛ смена курсов ПХТ была проведена почти у 30% больных.

По результатам лечения полный ответ был у 28 пациентов из общего числа, частичный ответ — у 15 пациентов, у 18 пациентов отмечали плохой ответ или рецидивирующее течение, а 2 пациента умерло в связи с прогрессией заболевания. В течении первых 4 курсов ПХТ у больных были оценены клинические проявления гематологической и негематологической (печеночной и почечной) токсичности [22]. Наличие указанных токсических эффектов выявили у 42 из 63 (66,7%) пролеченных больных. Наименьшее число зарегистрированных токсических эффектов было у больных с полным и частичным ответом — 60,71% и 60% соответственно. В группе с ДККЛ токсические проявления были зарегистрированы у 24 (70,58%) из 34 пациентов, а в группе с МКЛ — у 18 (62,06%) из 29 пациентов. Полученные данные по распространению токсических эффектов при различных вариантах НХЛ достоверно не отличались между собой.

Токсические эффекты чаще были выявлены у больных с неблагоприятным ответом на курсы ПХТ или прогрессирующим течением, их число составило 75%. Но зарегистрированные данные по наличию токсических эффектов и эффективности проводимых курсов ПХТ у обследованных нами пациентов не выявили достоверной связи между токсичностью и неблагоприятным течением заболевания. В общей группе, обследованных больных с НХЛ, генотипы по гену L-myc нами были выявлены со следующей частотой: 3109ТТ — 27%, 3109TG — 54%, 3109GG — 19%. Частота распределения полиморфных вариантов гена L-myc имела отличия при сравнении частот генотипов в зависимости от варианта НХЛ. У пациентов с ДККЛ частота распространения генотипа 3109ТТ была несколько повышена по сравнению с пациентами с МКЛ, 32,35% и 20,69% соответственно.

У пациентов с ДККЛ достоверно была повышена частота распространения генотипа 3109GG по сравнению с пациентами с МКЛ (29,41% и 6,90%, соответственно). Анализируя особенности клинического течения заболевания, мы установили, что у 70% пациентов с ДККЛ и генотипом 3109GG наблюдали токсические эффекты при проведении, в тоже время ответ (полный или частичный) на проводимую терапию был у 80% распространения генотипа 3109TG по сравнению с его частотой у больных с ДККЛ (72,41% в отличие от 38,24%). Подобное различие могло быть следствием величины исследованных выборок или клинико-лабораторных особенностей больных. Поэтому нами было проанализированы клинико-лабораторные параметры пациентов в зависимости от генотипов по гену L-myc.

Наиболее часто генотип 3109TG выявляли у пациентов с II-IV стадией заболевания НХЛ, то есть при более распространенном процессе, по сравнению с пациентами с генотипом 3109ТТ (р<0,05), у которых преобладали локальные формы заболевания. Также достоверно была повышена частота распространения у пациентов с II-IV стадиями заболевания НХЛ генотипов 3109TG+ +3109GG по сравнению с пациентами с локальными формами, у которых преобладал генотип 3109ТТ (р<0,05).

У пациентов с генотипом 3109GG масса тела была достоверно сниженной (р<0,05) по сравнению с пациентами с генотипами 3109TG и 3109ТТ. Было выявлено достоверное увеличение лейкоцитов в периферической крови у пациентов с генотипом 3109GG (р<0,05) по сравнению с пациентами с генотипами 3109TG и 3109ТТ. У больных с генотипом 3109GG реже встречался один из токсических эффектов, а чаще выявляли три вида токсических эффектов. Два вида токсических эффектов чаще выявляли при генотипе 3109TG, а при генотипе 3109ТТ выявляли в основном одно из токсических проявлений.

У обследованных пациентов с НХЛ выявляли сочетанные токсические проявления при проведении ПХТ (табл. 7). У 23 пациентов (54,76%) из 42 пациентов с клиническими проявлениями токсичности были выявлены проявления одного из ее видов: у 10 (43,48%) из 23 пациентов — гематологической токсичности; у 5 (21,17%) из 23 пациентов — гепатологической токсичности; а у 8 (34,78%) из 23 пациентов — нефрологической токсичности. 70% пациентов с гематологической токсичностью, 100% пациентов с гепатологической токсичностью, 87,5% с нефрологической токсичностью имели аллель 3109G в гомозиготном или гетерозиготном состоянии. В табл. 7 приведены результаты сравнительного анализа, построенного по принципу сравнения одного или более двух видов токсичности в сравнении с отсутствием токсических эффектов.

У пациентов с отсутствием токсических проявлений была выявлена наибольшая частота распространения генотипа 3109ТТ, которая была недостоверно повышена в сравнении с частотой распространения генотипа у пациентов с наличием более двух токсических эффектов при проведении ПХТ (ч2=4,84, p=0,057, OR=0,19, 95% СІ (0,03−1,06)).

Далее нами было проанализировано риск развития гематологической и негематологической токсичности у больных с НХЛ в зависимости от полиморфизма гена L-myc (T3109G).

При проведении генотипирования у больных с гематологической и гепатологической токсичностью наблюдалась отчетливая тенденция к снижению частоты распространения генотипа 3109ТТ, и повышению частоты распространения генотипов 3109TG и 3109GG по сравнению с пациентами, у которых не было выявлено клинических проявлений токсичности при проведении ПХТ. У больных с нефрологической токсичностью было выявлено достоверное снижение распространения генотипа 3109ТТ по сравнению с больными без токсических эффектов, а частота распространения генотипов 3109GG и 3109TG+ +3109GG по гену L-myc, напротив, была достоверно повышена у пациентов с нефрологической токсичностью.

ДККЛ и МКЛ имеют различное гистогенетическое происхождение и иммуноморфологические особенности опухолевого процесса, но курсы и схемы проведения ПХТ при этих частых нозологических формах НХЛ во многом сходны.

Рядом экспериментальных исследований было показано, что наличие токсических эффектов ухудшает прогноз, особенно в случае сочетания с высокой агрессивностью опухолевого процесса и преобладанием экспрессии протоонкогенных генов, среди которых в последнее время широко изучают гены семейства L-myc [4−7]. Несмотря на растущий интерес к изучению влияния протоокогенов семейства L-myc на процессы онкологической трансформации в лимфоидных клетках и их анализ в экспериментальных работах, распространение полиморфных вариантов гена L-myc (T3109G) у больных с различными формами НХЛ остается плохо охарактеризованным [3, 4].

Нами впервые были охарактеризованы частоты полиморфных вариантов гена L-myc (T3109G) у пациентов с ДККЛ и МКЛ в украинской популяции. Получены данные об ассоциации генотипов 3109GG и 3109TG+3109GG со склонностью к распространению и генерализации процесса, с быстрым вовлечением в процесс нескольких групп лимфатических узлов и появлением экстранодальных очагов, что более характерно для обследованных нами больных с МКЛ.

Из предыдущего нашего клинико-лабораторного анализа известно, что у больных с МКЛ наблюдалась тенденция к увеличению показателей лейкоцитов, лимфоцитов и трансаминаз по сравнению с больными с ДККЛ и преобладание генерализованных форм, с более частым вовлечением в патологический процесс костного мозга, печени и селезенки. Данные особенности косвенно свидетельствует о склонности к генерализации процесса при наличии генотипов 3109ТG+3109GG вследствие агрессивного течения опухолевого процесса, который сопровождается накоплением большей опухолевой массы. Известно, что токсические эффекты усиливаются при распаде опухолевой массы [7].

Полученные результаты со всей очевидностью демонстрируют, что возрастающий риск нефрологической токсичности обусловлен не только проводимой терапией, но и агрессивностью, а также массой опухолевой ткани, и как показано в ряде публикаций [7] - увеличением продуктов распада, которые образуют в почках нерастворимые соединения, ухудшающие состояние больного, и возможность проведения дальнейшей химиотерапии. Поэтому пациенты с генотипами 3109TG и 3109GG, особенно при наличии повышенного количества лейкоцитов и сниженной массы тела, нуждаются в лечебно-профилактических мероприятиях, направленных на снижение риска развития нефрологической токсичности.

Наше исследование лимитировано числом обследованных пациентов, что не позволило в полной мере выяснить возможные ассоциации с риском развития гематологической и гепатологической токсичности, и сделать более убедительной ассоциацию с риском развития нефрологической токсичности. Для дальнейших исследований необходимо консолидировать усилия специалистов многих национальных клиник, в связи с не высокой частотой распространения ДККЛ и МКЛ, путем создания национального консорциума.

Проведенными исследованиями по влиянию полиморфных вариантов гена L-myc (T3109G) на риск развития гематологической и негематологической токсичности при проведении ПХТ при различных формах НХЛ установлено, что суммарная частота выявления клинических случаев гематологической и негематологической токсичности не различалась у больных с ДККЛ и МКЛ, и не была ассоциирована с полиморфизмом исследованного гена. Полиморфизм гена L-myc (T3109G) определял распространение опухолевого процесса, риск развития II—IV стадии заболевания у пациентов, которые чаще были выявлены при генотипах 3109TG и 3109GG; а наличие генотипа 3109GG было ассоциировано с потерей массы тела и повышением количества лейкоцитов в период манифестации заболевания, перед началом проведения курсов ПХТ. Риск развития нефрологической токсичности при проведении курсов полихимиотерапии у больных с НХЛ был ассоциирован с генотипами 3109TG и 3109GG по гену L-myc. Число токсических эффектов и особенности их сочетания у обследованных пациентов не было связано с полиморфизмом гена L-myc (T3109G).

Таким образом, необходимы дальнейшие исследования с целью разработки лечебно-профилактических мероприятий по снижению риска нефрологической токсичности у больных с НХЛ при проведении курсов полихимиотерапии.

• 1. Tansey W. P Mammalian MYC Proteins and Cancer / W.P. Tansey // New Journal of Science. — 2014. — Vol. 2014. — P. 1—27.
• 2. DePinho R.A. The human myc gene family: structure and activity of L-myc and an L-myc pseudogene / R.A. DePinho, K.S. Hatton, A. Tesfaye, G.D. Yancopoulos, F.W. Alt // Genes & Development. — 1987. — Vol. 1, Issue 10. — P. 1311—1326.
• 3. Spinola M. Meta-Analysis Suggests Association of L-myc EcoRI Polymorphism with Cancer Prognosis / M. Spinola // Clinical Cancer Research. — 2004. — Vol. 10, Issue 14. — P. 4769—4775.
• 4. Wasylishen A.R. New model systems provide insights into Mycinduced transformation / A.R. Wasylishen, A. Stojanova, S. Oliveri, A.C. Rust, A.D. Schimmer, Z. Penn // Oncogene. — 2011. — Vol. 30, Issue 34. — P. 3727— 3734.
• 5. Dang C.V. Therapeutic Targeting of Myc-Reprogrammed Cancer Cell Metabolism / C. V Dang // Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. — 2011. — Vol. 76, Issue 0. — P. 369—374.
• 6. Wiese K. The Role of MIZ-1 in MYC-Dependent Tumorigenesis / K.E. Wiese, S. Walz, B. von Eyss, E. Wolf, O. Sansom, M. Eilers // Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. — 2013. — Vol. 3, Issue 12.
• 7. Cherenkov V.T. Vozmojnosti «REMAKSOLA» dlya profilaktiki toksicheskih gepatitov pri onkologicheskih bolnyih / V.T. Cherenkov, A.B. Petrov, T.M. Vasileva, M.M. Strojenkov // Voprossyi onkologii. — 2013. — Vol. 59, Issue 3. — P. 12—18.
• 8. Sharma R. Inflammatory (B) symptoms are independent predictors of myelosuppression from chemotherapy in Non-Hodgkin Lymphoma (NHL) patients — analysis of data from a British National Lymphoma Investigation phase III trial comparing CHOP to PMitCEBO / R. Sharma, D. Cunningham, P. Smith, G. Robertson, O. Dent, S.J. Clarke // BMC Cancer — 2009. — Vol. 9, Issue 1. — P. 153.
• 9. Xu X. Fludarabine-based versus CHOP-like regimens with or without rituximab in patients with previously untreated indolent lymphoma: a retrospective analysis of safety and efficacy / X. Xu, Y. Zhang, Z. Wang, X. Wu, Y. Yu, B. Yan // OncoTargets and Therapy. — 2013. — P 1385.
• 10. Dotan E. Impact of Rituximab (Rituxan) on the Treatment of B-Cell Non-Hodgkin's Lymphoma / C. Aggarwal, M. Smith // PT. — 2010. — Vol. 35, Issue 3. — P 148—157.
• 11. Rossini F. Long-Term Follow-Up of Patients with Intermediate or High-Grade Non-Hodgkin Lymphoma Treated with a Combination of Cyclophosphamide, Epirubicin, Vincristine, and Prednisone / F. Rossini, E. Terruzzi, D. Perego, F. Rivolta, E. Manca, E. M. Pogliani // Cancer. — 2004. — Vol. 100, Issue 2. — P. 350−355.
• 12. Bichakjian C.K. NCCN Clinical Practice Guidelines in oncology / C.K. Bichakjian, T. Olencki, S.Z. Aasi, M. Alam // Journal of the National Comprehensive Cancer Network. — 2016. — Vol. 14, Issue 5. — P. 574−597.
• 13. Wunderlich A. Practicability and acute hematological toxicity of 2- and 3-weekly CHOP and CHOEP chemotherapy for aggressive non-Hodgkin's lymphoma: results from the NHL-B trial of the German High-Grade Non-Hodgkin's Lymphoma Study Group (DSHNHL) / A. Wunderlich // Annals of Oncology. — 2003. — Vol. 14, Issue 6. — P. 881−893.
• 14. McCloskey J.K. Safe and Effective Treatment of Aggressive Non-Hodgkin Lymphoma With Rituximab and Bendamustine in Patients With Severe Liver Impairment / J.K. McCloskey, C.M. Broome, B.D. Cheson // Clinical Advances Hematology Oncology. — 2013. — Vol. 11, Issue 3. — P. 184−189.
• 15. Nastoupil L.J. Management Strategies for Elderly Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma / L.J. Nastoupil, R. Sinha, C.R. Flowers // Oncology & Hematology Review (US). — 2012. — Vol. 08, Issue 01. — P. 71.
• 16. Overdevest J. Utilizing the molecular gateway: the path to personalized cancer management / J.B. Overdevest, D. Theodorescu, J.K. Lee // Clinical Chemistry. — 2009. — Vol. 55, Issue 4. — P. 684−697.
• 17. Tilly H. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL): ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up / H. Tilly, U. Vitolo, J. Walewski, M.G. da Silva, O. Shpilberg, M. Andre et. al // Annals of Oncology. — 2012. — Vol. 23. — P. vii78-vii82.
• 18. Stewart D. Non-Hodgkin lymphoma / D. Stewart // Landmarks. — 2013. — Vol. 12, Issue 1. — P. 43−45.
• 19. Абушанаб С. Влияние генетических факторов на развитие клинических проявлений токсичности у больных неходжкинскими лимфомами / С. Aбушанаб, C.B. Выдыборец, Н. Г. Горовенко, И. Р Гортовская, С. П. Кирьяченко, З. И. Россоха // Гематология. Трансфузиология. Восточная Европа. — 2015. — № 3. — С. 48−61.
• 20. Yaylim-Eraltan I. L-myc gene polymorphism and risk of thyroid cancer / I. Yaylim-Eraltan, N. Bozkurt, A. Ergen, U. Zeybek et. al // Experimental Oncology. — 2008. — Vol. 30, Issue 2. — P. 117−120.
• 21. Алексеева Ю. А. Современная терапия неходжкинских лимфом / Ю. А. Алексеева // Фарматека. — 2013. — № 8. — С. 23−29.
• 22. Джалилов А. Ф. Неходжскинские лимфомы: основы классификации и иммуноцитохимической диагностики / А. Ф. Джалилов // Онкология. — 2013. — T. 15, № 4. — С. 264−272.