Актуальность проблемы. Воронеж — город с миллионным населением, расположенный в Центрально-Черноземном районе европейской части России. Проблема техногенного загрязнения Воронежа и близлежащих территорий из года в год обостряется, что отражается на всех компонентах экосистем. В городе и его окрестностях имеются крупные химические производства, например, ОАО «Воронежсинтезкаучук», крупная теплоэлектроцентраль «ВОГРЭС», расположенные в непосредственной близости от Воронежского водохранилища, Нововоронежская атомная электростанция. Нельзя не упомянуть и о большом количестве автомобильного транспорта на территории города, хорошо развитых железнодорожных путях сообщения.
В медицинской практике России используется свыше 6,5 тысяч лекарственных средств, производимых из лекарственного растительного сырья [90]. Все возрастающий интерес к фитопрепаратам обусловлен тем, что в случае рационального применения они сочетают в себе хороший терапевтический эффект с относительной безвредностью [120]. Однако, вследствие роста города Воронежа, резкого увеличения количества автотранспорта, расширения производственных площадей, вероятность сбора лекарственного растительного сырья населением вблизи источников выброса поллютантов существенно возрастает [86]. В связи с этим с практической точки зрения необходимо выяснить влияние антропогенного загрязнения на химический состав лекарственных растений в городе Воронеже и его окрестностях, определить возможность их использования в медицинских целях, выявить наиболее экологически неблагоприятные зоны указанной территории и дать рекомендации возможных районов заготовки лекарственного сырья.
В качестве объектов исследования было удобно и целесообразно в практическом смысле использовать такие лекарственные растения, как Polygonum aviculare L. (горец птичий) и Plantago major L. (подорожник большой). Оба вида в ботаническом, фитохимическом, фармакологическом, экологическом планах изучены весьма полно. Это характерные представители как естественных растительных сообществ, так и урбанофлоры. Сбор листьев подорожника большого и травы горца птичьего (спорыша) осуществляется преимущественно от дикорастущих растений, которые испытывают на себе влияние всего многообразия экологических факторов, в том числе и техногенного загрязнения.
Цель диссертационной работы — изучить влияние антропогенного загрязнения на химический состав лекарственного растительного сырья в городе Воронеже и его окрестностях на примере горца птичьего и подорожника большого. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1. Изучить содержание тяжелых металлов, пестицидов, радионуклидов в образцах верхних слоев почв и лекарственного растительного сырья горца птичьего и подорожника большого.
2. Исследовать взаимосвязи между концентрациями поллютантов в почве и в лекарственном растительном сырье, выявить аккумулирующие способности указанных растений по отношению к основным загрязнителям среды.
3. Провести фармакогностический анализ образцов лекарственных растений, отобранных в разных с экологической точки зрения местах, предполагающий макрои микроскопический анализ сырья, качественный и количественный анализ основных групп биологически активных веществ, а также выявить соответствие сырья требованиям нормативной документации.
4. Исследовать взаимосвязь между содержанием поллютантов и биологически активных веществ в отобранном лекарственном растительном сырье.
5. Выявить динамику накопления растениями основных поллютантов и биологически активных веществ в процессе их произрастания в различных с экологической точки зрения местах.
6. Изучить изменения содержания основных поллютантов и биологически активных веществ растениями, произрастающими в экологически отличающихся местах, заготовленными в разные годы.
7. Модифицировать методику количественного анализа водорастворимых полисахаридов в листьях подорожника большого с целью повышения ее экспрессности и простоты воспроизведения.
8. Выявить возможности требований действующей нормативной документации предотвращать использование в медицинской практике изучаемых видов лекарственного растительного сырья, собранного в экологически неблагоприятных районах, с вынесением рекомендаций по внесению изменений в случае необходимости.
Научная новизна работы. Впервые для города Воронежа и его окрестностей исследовано экологическое состояние лекарственного растительного сырья на примере горца птичьего и подорожника большого на предмет загрязнения тяжелыми металлами, пестицидами и радионуклидами, а также установлена взаимосвязь между содержанием поллютантов в почве и растениях. Для травы горца птичьего и листьев подорожника большого, собранных на стационарных участках, проведены фармакогностические исследования, позволившие дать рекомендации для усовершенствования контроля качества названного лекарственного растительного сырья с целью предотвращения использования в медицинской практике изучаемых видов лекарственного растительного сырья, собранного в экологически неблагоприятных районах. Выявлена динамика накопления поллютантов и биологически активных веществ в лекарственных растениях, произрастающих в экологически разных районах, исследована взаимосвязь между этими процессами. Для листьев подорожника большого предложена модифицированная методика количественного определения водорастворимых полисахаридов, отличающаяся от ранее существующей экспрессностью, экономичностью, высокой воспроизводимостью и простотой. Новизна проведенных исследований подтверждается заявкой на изобретение № 2 013 110 215 от 06.03.13 г.
Практическая значимость и внедрение результатов работы. Исследовано экологическое состояние верхних слоев почв и лекарственных растений (на примере горца птичьего и подорожника большого) в городе Воронеже и его окрестностях, что позволило выявить территории наиболее сильного антропогенного загрязнения и экологически благополучные, подходящие для заготовки растительного сырья, отвечающего всем требованиям нормативных документов по содержанию поллютантов и действующих веществ. Выявлены особенности микроскопических признаков сырья горца птичьего и подорожника большого, произрастающих в урбоусловиях, что позволяет определять экологическую чистоту мест заготовки поступающего на реализацию лекарственного растительного сырья. Модифицирована методика количественного определения водорастворимых полисахаридов в листьях подорожника большого, отличающаяся меньшими длительностью и затратами. Выявлена необходимость в уточнении и усовершенствовании фармакопейных статей на траву горца птичьего и листья подорожника большого в целях повышения эффективности и безопасности лечения препаратами растительного происхождения.
На основании проведенных исследований модифицированная методика количественного определения водорастворимых полисахаридов внедрена в производственный процесс БУЗ «Центр контроля качества и сертификации лекарственных средств», в учебный процесс ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет», ГБОУ ВПО «Воронежская государственная медицинская академия им. H.H. Бурденко» Минздрава РФ, ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Минздрава РФ, ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия», ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» Минздрава РФ.
Теоретическая значимость работы. Работа вносит вклад в природоохранное направление экологии, связанное с фармацевтически ценными ресурсами. В диссертации намечаются новые направления урбоэкологии и фармацевтической экологии. Оптимизируются методы мониторинга экологического состояния лекарственного растительного сырья в условиях антропогенного воздействия.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Экологически неблагополучными по содержанию тяжелых металлов являются 60% отобранных образцов почв и 15% лекарственного растительного сырья. Из солей тяжелых металлов, накапливающихся в почве, растениями наиболее активно накапливается ртуть, медь и кадмий, причем у подорожника большого аккумулятивная активность значительно выше, чем у горца птичьего.
2. Подорожник большой аккумулирует радионуклиды из почв эффективнее, чем горец птичий, при этом цезий-137 накапливается растениями в большей степени, чем стронций-90.
3. Микропризнаки лекарственного растительного сырья горца птичьего и подорожника большого зависят от условий их произрастания и фенологической фазы растения.
4. Динамика накопления действующих веществ растением зависит от экологических условий его произрастания и находится в обратной зависимости от концентрации поллютантов.
5. Усовершенствованная методика количественного определения водорастворимых полисахаридов в листьях подорожника большого позволяет снизить время анализа более чем в два раза.
Личный вклад соискателя состоит в сборе материала, обобщении литературных сведений по теме, проведении всех серий научных экспериментов, самостоятельной обработке и интерпретации экспериментальных данных, подготовке всех публикаций по выполненной работе, выступлениях с результатами исследований на Международных научно-практических конференциях.
Апробация материалов диссертации. Материалы диссертационных исследований докладывались и обсуждались на следующих конференциях: IV международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, медицине, фармакологии», Санкт-Петербург, 2012; III международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», Казань, 2012; V Международной научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ», Воронеж, 2013; II Международной научно-практической конференции «Проблемы и перспективы обеспечения комплексной безопасности личности и общества в условиях современности», Воронеж, 2013.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 научных работ, в том числе 5 публикаций в изданиях, рекомендованных перечнем ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертация включает введение, пять глав, заключение, выводы, список литературы и приложения. Она изложена на 159 страницах машинописного текста, содержит 6 рисунков, 28 таблиц.
Список литературы
включает 313 источников, из них 63 на иностранных языках. Общий объем работы с приложениями составляет 205 страниц.
Выводы
1. Наиболее неблагоприятными районами по загрязненности тяжелыми металлами верхних слоев почв и сырья горца птичьего и подорожника большого являются территории вблизи аэропорта и теплоэлектроцентрали. К наиболее запыленным зонам, где лекарственные растения не удовлетворяют требованиям нормативной документации по показателю общая зола, относятся так же территории вблизи автомобильной трассы и улица города. На основании результатов исследования на содержания пестицидов и радионуклидов в почвах и лекарственном растительном сырье горца птичьего и подорожника большого в городе Воронеже и его окрестностях район признан экологически благополучным.
2. Листья подорожника большого аккумулируют в себе тяжелые металлы из почвы эффективнее, чем трава горца птичьего, наиболее четкая корреляционная связь установлена для таких металлов, как ртуть, медь и кадмий. Цезий-137 накапливается растениями из почвы эффективнее, чем стронций-90, при этом листья подорожника большого проявляют большие аккумулирующие способности в отношении радионуклидов, чем горец птичий.
3. Макрои микроскопический анализ, а также качественный и количественный анализ основных групп биологически активных веществ показал полное соответствие всех отобранных образцов сырья действующим требованиям нормативной документации. Выявлены микроскопические особенности горца птичьего и подорожника большого, произрастающих в различных с экологической точки зрения районах, которые позволяют предложить расчет количества устьиц и других микропризнаков сырья для диагностики мест его сбора.
4. Содержание флавоноидов травы горца птичьего и водорастворимых полисахаридов листьев подорожника большого находится в тесной отрицательной взаимосвязи с содержанием тяжелых металлов, причем особенно сильное угнетающее действие на биосинтез флавоноидов оказывает цинк, медь и кадмий, а на биосинтез водорастворимых полисахаридов — хром, никель и мышьяк. 4
1 / К ь
5. Средняя скорость прироста концентраций тяжелых металлов изучаемыми растениями в заповеднике (контроль) почти в 2 раза ниже, чем у растений улицы города, и в 2,5 раза ниже, чем для растений, произрастающих вблизи автомобильной трассы. Средние же значения приростов концентраций флавоноидов в траве горца птичьего и водорастворимых полисахаридов в листьях подорожника большого для объектов, собранных в заповеднике, положительны. Для растений, собранных в городе, средние значения градиентов концентраций биологически активных веществ равны нулю, а для сырья, произрастающего вдоль автомобильной трассы, — отрицательны, что указывает на преобладание подавления биосинтетических процессов под действием антропогенного влияния.
6. Изменения содержания поллютантов и действующих веществ в сырье горца птичьего и подорожника большого, заготовленных в разные годы, в среднем не превышают 5%, что позволяет говорить об относительно стабильной экологической обстановке в городе Воронеже и его окрестностях. При этом изученные изменения содержания водорастворимых полисахаридов в листьях подорожника большого не превышают 2%, что указывает на экологическую приспособленность подорожника большого к антропогенному воздействию.
7. Модифицированная методика гравиметрического определения водорастворимых полисахаридов в листьях подорожника большого позволяет интенсифицировать процесс количественного определения и снизить время, расходуемое на него, с 4 до 2 часов (заявка на изобретение № 2 013 110 215 от 06.03.13 г.). Относительная ошибка предлагаемой методики при доверительной вероятности 95% составляет 1,49%.
8. Показана целесообразность внесения изменений в нормативные документы на траву горца птичьего в разделах «внешние признаки», «микроскопия» и «числовые показатели» и на листья подорожника большого в разделах «микроскопия», «числовые показатели» и «количественное определение» с целью повышения эффективности и безопасности лекарственного растительного сырья на стадии контроля качества и предотвращения реализации населению сырья, собранного в экологически неблагоприятных районах.
Заключение
На основании проведенных анализов образцов верхних слоев почв, а также сырья горца птичьего и подорожника большого можно сделать следующие заключения об экологическом состоянии почв и качестве лекарственного растительного сырья в городе Воронеже и его окрестностях (табл. 1, 2, 3 приложения 7). Оказалось, что 60% анализируемых образцов почв не соответствуют установленным нормам экологической безопасности, в них превышены предельно допустимые концентрации тяжелых металлов. Вдоль железнодорожных путей превышено содержание цинка, меди и кадмия, на улице города — цинка, вдоль автомобильной трассы и вблизи ТЭЦ — мышьяка, аэропорта — свинца и ртути, вдоль высоковольтных линий электропередач — никеля и мышьяка. Проведенные исследования показали полное благополучие почв города Воронежа и близлежащих территорий в отношении загрязнения хлорорганическими пестицидами, содержание которых крайне низко или не обнаружено, и в отношении радионуклидов.
15% образцов лекарственного растительного сырья можно признать неудовлетворительными из-за высокого содержания тяжелых металлов. Во всех образцах, собранных вблизи аэропорта, превышена концентрация свинца, а в листьях подорожника большого, произрастающего вблизи ТЭЦ, превышено и содержание мышьяка. Однако нормативная документация регламентирует лишь содержание четырех элементов (свинец, ртуть, кадмий, мышьяк). Предельно допустимые же концентрации цинка, меди и никеля в лекарственном растительном сырье, несмотря на данные литературы о высокой токсичности этих металлов, не регламентированы. Наши расчеты показали высокую способность ртути, меди и кадмия к накоплению лекарственными растениями из почв, при этом у подорожника большого аккумулятивная активность значительно выше, чем у горца птичьего.
Анализы образцов почв и лекарственного растительного сырья на хлорорганические пестициды показали их экологическое благополучие.
Радионуклидный анализ сырья выявил полное соответствие лекарственных растений критериям радиационной безопасности. При этом цезий-137 накаливается в растениях активнее, чем стронций-90, и листья подорожника большого проявляют большую концентрирующую способность в отношении радионуклидов.
Фармакогностический анализ всех отобранных образцов сырья горца птичьего показал их соответствие всем существующим нормам. Нами выявлена целесообразность внесения изменений в разделы фармакопейной статьи «внешние признаки», «микроскопия» и «числовые показатели». Рекомендуем заменить «Листья простые, очередные, короткочерешковые, цельнокрайние, различные по форме, широколопатчатые или широкоэллиптические, обратнояйцевидные, реже узкопродолговатые или почти линейные, тупые или островатые, длиной до 3 см, шириной до 1 см» на «Листья простые, очередные, короткочерешковые, цельнокрайние, различные по форме, широколопатчатые или широкоэллиптические, обратнояйцевидные, реже узкопродолговатые или почти линейные, тупые или островатые, длиной от 2 до 3 см, шириной от 0,8 до 1 см». Проведенные микроскопические исследования позволяют нам рекомендовать дополнение раздела «микроскопия» следующими сведениями: «без видимых утолщений клеток эпидермиса листа и с количеством устьиц на нижней стороне
•у его не более 180 на 1 см «. Раздел «числовые показатели» целесообразно, на наш взгляд, редактировать, заменив «суммы флавоноидов в пересчете на авикулярин не менее 0,5%» на «суммы флавоноидов в пересчете на авикулярин и абсолютно сухое сырье не менее 1,0%». Это позволит повысить эффективность и безопасность на стадии контроля качества поступившего лекарственного растительного сырья и избежать реализацию населению сырья, собранного в экологически неблагоприятных районах.
Фармакогностический анализ всех отобранных образцов сырья подорожника большого показал их полное соответствие всем существующим нормам. Выявлена целесообразность внесения изменений в разделы фармакопейной статьи «микроскопия» и «количественное определение». В результате микроскопических исследований рекомендуем существующие данные раздела «микроскопия» заменить следующими доработанными и дополненными сведениями: «При рассмотрении микропрепаратов листьев подорожника большого с поверхности наблюдаются многоугольные клетки верхнего эпидермиса и извилистые — нижнего. Видимых утолщений стенок клеток эпидермиса не отмечается. Кутикула местами образует складки. Устьица аномоцитного типа на обеих сторонах листа, с преобладанием на нижней стороне и ближе к жилке. Количество устьиц на нижней стороне листа не более 250 на 1 см², а на верхней стороне — не более 150 на 1 см². Эпидермис имеет выросты в виде волосков, простых и головчатых. Головчатые трихомы также преобладают на нижней стороне листа ближе к жилке и бывают двух типов: с одноклеточной ножкой и двухклеточной головкой, реже с двухклеточной ножкой и одноклеточной головкой. Количество головчатых волосков на нижней стороне
9 О листа более 35 на 1 см, а на верхней стороне — более 16 на 1 см. Простые волоски гладкие, имеют форму конуса, чаще встречаются на нижней стороне листа, обычно 2−4-клеточные, часто частично или полностью оборваны, распределены неравномерно, располагаются обычно вблизи крупных сосудов, величиной 41−89 мкм. В местах прикрепления волосков отмечали хорошо заметные розетки из 6−9 клеток эпидермиса. Над жилками видны механические волокна с толстыми прямоугольно-вытянутыми клетками". Данное описание характерно для сырья подорожника большого, произрастающего в экологически благоприятных районах.
Разработана новая методика количественного определения водорастворимых полисахаридов в листьях подорожника большого, отличающаяся от ранее существующих значительно меньшей длительностью, экономичностью и простотой воспроизведения. Экспериментально доказано, что рациональным является рассмотрение вопроса об изменении установленного ранее числового показателя листьев подорожника большого «полисахаридов не менее 12%» на «водорастворимых полисахаридов не менее 20% в пересчете на абсолютно сухое сырье».
Из общей картины выделяются данные, полученные для лекарственного растительного сырья, собранного вдоль высоковольтных линий электропередач. Влияние электромагнитного поля блокирует накопление как поллютантов, так и биологически активных веществ, а данные микроскопического анализа также указывают на сильное снижение активности метаболических процессов в растениях этих территорий.
В обоих видах лекарственного сырья наблюдается положительная динамика накопления биологически активных веществ в начале произрастания растений с последующим их уменьшением, причем для растений, произрастающих в заповеднике, постепенное уменьшение действующих веществ наблюдается в фазу плодоношения растений, а для особей, испытывающих антропогенную нагрузку, -уже в фазу цветения. Эти данные строго коррелируют с содержаниями тяжелых металлов в тех же образцах, при этом значения градиентов концентраций тяжелых металлов во всех случаях обратно пропорциональны градиентам концентраций действующих веществ, что доказывает подавление их синтеза поллютантами. Анализы показали, что лекарственное растительное сырье, собранное в фазу цветения вдоль автомобильной трасы, а также в фазу плодоношения на улице города характеризуются неудовлетворительным качеством. Сырье же, собранное в фазы бутонизации и начала цветения даже на территориях испытывающих сильную антропогенную нагрузку, соответствует всем требованиям действующей нормативной документации.
Изучение изменений содержания поллютантов и действующих веществ в сырье горца птичьего и подорожника большого, заготовленных в разные годы, показали колебания, в среднем не превышающие ±5%, что позволяет говорить о стабильной экологической обстановке в городе Воронеже и его окрестностях.
