Биофизические механизмы физиологического действия экзогенного O2 на животных

Представления о повреждающем действии свободнорадикальных или радикалообразуюгцих продуктов одноэлектронного восстановления кислорода в биологических системах являются доминирующими в течение последних трех десятилетий. Основное внимание привлекают такие формы активированного кислорода, как супероксидный радикал (V, пероксид водорода Н2О2, синглетный кислород 'Ог, гидроксильный радикал 'ОН, а также липидные радикалы, образующиеся, в частности, в жидкой фазе при распаде гидроперекисей липидов ROOH (Владимиров и др., 1975; Красновский 1988; Черницкий, Воробей, 1988; Halliwell, 1995; Скулачев, 1996; Скулачев, 1999). В многочисленных исследованиях было убедительно показано, что окислительные деструктивные процессы, вызываемые повышенными уровнями активированных форм кислорода в конденсированной водной фазе, а также липидными радикалами и гидроперекисями, могут лежать в основе клеточной патологии и сопряженных с нею заболеваний. В целом, результаты этих исследований можно рассматривать как развитие проблемы свободнорадикальной патологии и перекисного окисления в биологических структурах (Тарусов, 1964; Эмануэль, 1964). С этих позиций в настоящее время интерпретируются механизмы сердечно-сосудистой патологии и артериосклероза (Halliwell, Gutteridge, 1988), дегенеративных заболеваний нервной системы (Delanty, Dichter, 1998), аутоиммунных и хронических воспалительных заболеваний (McCord, 1985), старения (Harman, 1968), злокачественного роста (Oberley, Oberley, 1993) и др.

Не менее важными, однако значительно менее изученными, являются представления о биологической роли кислородных радикалов и процессов перекисного окисления в условиях физиологической нормы. Между тем, накапливается все больше фактов, указывающих на важную роль этих активных продуктов и процессов в нормальной жизнедеятельности. Так, отметим представления о важной роли процессов перекисного окисления липидов в функционировании митохондрий в норме (Владимиров и др., 1975). Известно также, что обусловленная генетической неполноценностью нейтрофилов недостаточная продукция супероксида при хроническом грануломатозе влечет за собой нарушение противовоспалительных механизмов и повышенный риск гибели организма от инфекции (Hohn, Lehrer, 1975). Этот пример отражает одну из наиболее полно изученных полезных биологических функций супероксида, продуцируемого активированными фагоцитами и связанную с бактерицидным действием этого радикала (Babior et al., 1973). В последнее время возрос поток новых данных о роликислородных интермедиатов в защитной функции клеток белой крови (Furukava et al., 1992; Kimura et al., 1993). Регуляторное участие активированных форм кислорода в жизнедеятельности клетки в норме установлено в процессах клеточного деления (Steinbeck et al., 1994; Moulton et al., 1998), экспрессии генов (Dalton, 1999) и апоптоза (Burdon et al., 1996; Del Bello et al., 1999), a также в реакциях неферментативной регуляции окислительного стресса (Halliwell, Gutteridge, 1989). В связи с проблемой роли кислородных радикалов в норме обращает на себя внимание ряд не получивших до сих пор объяснения фактов, в первую очередь таких как i) относительно высокая доля кислорода, превращаемого в клетке в активированные формы, достигающая в ряде случаев в покое 10−15% (Oshino et al., 1975; Shoaf et al., 1991), ii) многообразие внутриклеточных процессов одноэлектронного восстановления кислорода, приводящих к образованию О2' (McCord, 1995) и iii) относительное постоянство его внутриклеточной концентрации (Elstner, 1990). Следует согласиться с мнением McCord (1995) о том, что наше понимание биологической — в широком смыслероли супероксида в нормальном метаболизме клетки остается неполным.

Другой важный аспект этой проблемы в целом, в рамках которого и выполнена настоящая диссертация, заключается в том, что существующие в настоящее время представления основаны исключительно на исследованиях, проведенных в конденсированных средах — водных растворах, суспензиях клеток, субклеточных частиц и тканях. Между тем, для большинства наземных многоклеточных организмов нормальной средой обитания является газовая фаза — атмосфера. В атмосферном воздухе, наряду с молекулярным кислородом, постоянно присутствуют электрически заряженные частицы, представленные свободными электронами и ионизированными молекулами составляющих воздух газов и образующие пул т.н. &bdquo-аэроионов", обусловливающих электропроводность атмосферы. Физические процессы, лежащие в основе ионизации кислорода и других атмосферных газов, изложены в обзорах и монографиях (Бучельникова, 1958; Loeb, 1953; Loeb, 1967; Чалмерс, 1974, Goldman, Goldman, 1978; Pethig, 1984; Dolezalek, 1985). Наибольший вклад в изучение биологической роли естественной ионизации воздуха, в обоснование взглядов на роль знака заряда аэроионов и в исследование физиологических эффектов естественных и искусственных аэроионов внесли А. Л. Чижевский (работы периода с 1918 по 1960 гг), Л. Л. Васильев (1934 — 1962 гг), А. А. Минх (1958 — 1979 гг), А.Р. Krueger (1962 -1984 гг), F. Sulman (1967 — 1984 гг), Olivereau (1965 — 1981 гг).

В настоящее время известны многочисленные свидетельства биологической активности аэроионов, в первую очередь их влияние на ЦНС и высшую нервнуюдеятельность, активность желез внутренней секреции, систему иммунитета и другиефизиологические процессы и функции высших животных и человека. Вэкспериментах на животных была продемонстрирована адаптогенная активностьотрицательных аэроионов, выражающаяся, в частности, в повышении устойчивостиорганизма к гипоксии, холоду, действию ионизирующей радиации, инфекционныхагентов и ксенобиотиков (Васильев, 1962; Серова, 1966; Серова, Лакшин, 1970). Вподавляющем большинстве работ физиологически положительное («благотворное»)и/или лечебное действие связывается с отрицательными аэроионами (Krueger, Sigel, 1981). Известно также наблюдение, что более выраженные эффекты достигаются приионизации чистого кислорода (Раудам и др., 1966). Уникальные биологическиеэффекты искусственно генерируемых аэроионов, проявляющиеся на клеточном (Krueger, Smith, 1959; Witkowski et al., 1986), тканевом (Lotmar, 1972) иорганизменном (Lambert, Olivereau, 1987; Olivereau et al., 1981) уровнях иобнаруживаемые y организмов, относящихся к различным видам, классам и типам (Анисимов, 1975), позволяют отнести аэроионы к биологически важным факторамвнешней среды. При этом следует отметить чрезвычайно низкую концентрациюаэроионов в воздухе. Даже в условиях искусственной генерации, где концентрацияаэроионов обычно на 2 — 3 порядка превышает естественную, один ион может 10приходиться на 10 и более незаряженных молекул (Pettig, 1984).

Работы, связанные с использованием аэроионов в лечении различных заболеваний, представляют отдельное направление исследований этого фактора внешней среды. Терапевтическое действие отрицательных аэроионов описано многократно. Первые спорадические попытки лечения больных с помощью ионизированного воздуха были предприняты в начале 20-го века (Соколов, 1904). Впоследствии терапевтическая активность аэроионов была неоднократно подтверждена (Чижевский, 1960). Было обнаружено лечебное действие отрицательных аэроионов при лечении респираторных (Булатов, 1962; Palti et al., 1966), нервных (Sulman, 1980), нейроциркуляторных (Sulman, 1980; Rodgers, 1985) — психических (Baron et al., 1985), кожных (Чижевский, 1960) заболеваний.

Широкий спектр биологического и лечебного действия отрицательных аэроионов, может служить указанием на наличие некоторых универсальных механизмов, лежащих в основе их взаимодействия с биологическими объектами. Если учесть, что по своей физической природе эти частицы являются продуктами ионизации основных атмосферных газов, в частности, кислорода, закономерно предположить эволюционную детерминированность чувствительности к ним различных живыхформ. Подобный подход может, на наш взгляд, оказаться продуктивным для формирования современных взглядов на физическую и молекулярную природу действующего начала отрицательных аэроионов, а также на биофизические и физиологические механизмы биологических ответов на их действие. Общепризнанные представления о механизмах, лежащих в основе действия этих частиц на организмы, в настоящее время отсутствуют. В первую очередь, это относится к вопросу о природе действующего начала биологически и терапевтически высокоактивных отрицательных аэроионов. Так, до настоящего времени представления о биологической активности отрицательных аэроионов были связаны исключительно с электрическим зарядом этих частиц. В этой связи в качестве основных претендентов на роль биологически активного начала аэроионов выдвигались в разное время отрицательный ион кислорода Ог (Чижевский, 1933 -1960; Krueger, 1984; Loeb, 1967), ион С04″ (Rosenthal, Ben-Hur, 1980), ионы 04 и СОз (Лившиц и др., 1983; 1984), а также их кластеры типа ион*(Н20)п, где п может иметь значения 1.5. Строго обоснованные доказательства взаимосвязи биологической активности с любым из этих ионов, где были бы учтены не только физические свойства, но и взаимосвязь химической реакционной способности частиц с многочисленными биологическими эффектами ими вызываемыми, нам не известны.

Не менее важным представляется также невыясненный вопрос о биологическом субстрате, с которым взаимодействуют атмосферные или искусственные газовые ионы. Поскольку аэроионы поступают в организм из воздушной среды, принципиально возможны два пути воздействия на организм млекопитающих и других наземных животных — ингаляционный, связанный с поступлением этих частиц в дыхательный тракт, и кожный, связанный с &bdquo-бомбардировкой" (Чижевский, 1960) аэроионами рецепторов кожной поверхности. Ингаляционный путь и связанный с ним механизм были рассмотрены в известной теории &bdquo-органического (или &bdquo-гуморального") электрообмена", основные положения которой были сформулированы Чижевским и Васильевым еще в 30-е годы (Васильев, Чижевский, 1933). Согласно представлениям авторов, биологические эффекты аэроионов были обусловлены проникновением в легкие и в кровь электрического заряда ингалируемых частиц с последующими изменениями физико-химических свойств эритроцитов и коллоидов крови. Историческое значение этой теории, базировавшейся преимущественно на умозрительных представлениях, заключается в обосновании роли знака заряда и связанных с этим различий в биологической активности положительных и отрицательных аэроионов. В то же время, лежащее в основе этойтеории предположение о проникновении аэроионов в легкие, а также об их последующей диффузии в кровь и электрическом взаимодействии с клеточными элементами и биоколлоидами крови и лимфы и индукции изменений заряда клеток и биоколлоидов представляется маловероятным (Минх и др., 1972). Постулируемое теорией проникновение аэроионов в альвеолы легких, а также в бронхи на различных уровнях бронхиального дерева доказано не было (Andersen, 1965; Pavlik, 1967а- 1967bМинх и др., 1972; Скоробогатова, 1991). Кроме того, эта теория оказалась не в состоянии объяснить большинство из известных в настоящее время и связанных с действием аэроионов явлений и фактов.

В различное время высказывались предположения, связывающие биологические эффекты атмосферных газовых ионов взаимодействием последних с кожным покровом, включая рецепторный аппарат кожи. Наиболее полно эти представления обобщены в работе Финогенова (1962). На наш взгляд, такая точка зрения обоснована в тех случаях, когда рассматривается действие аэроионов на поврежденные участки кожи, где можно ожидать непосредственного взаимодействия заряженных частиц с клеточными элементами раневой поверхности, участвующими в восстановительных процессах. Действительно, известны работы, где было показано ускорение заживления кожных ран и ожогов под воздействием потока искусственных отрицательных аэроионов (Портнов, Пуце, 1972). Описанные явления, однако, следует скорее рассматривать как взаимодействие аэроионов с тканями и/или клетками организма in situ, что может представить самостоятельный теоретический и практический интерес. Таким путем, однако, не удается объяснить многочисленные свидетельства влияния аэроионов на эндокринную (Olivereau, 1969; 1970а, 1970b) и центральную нервную систему (Diamond et al., 1980; Скоробогатова, 1991), адаптогенные эффекты, установленные в экспериментах на животных (Васильев, 1962), а также и, возможно, в первую очередь, успешное терапевтическое применение отрицательных аэроионов при различных воспалительных, нервных, психических и других заболеваниях у человека (Булатов, 1962; Palti et al., 1966; Olivereau, 1976; Sulman, 1980; Baron et al., 1985; Rodgers, 1985).

Другое объяснение биологических эффектов аэроионов заключалось в предположении о взаимодействии этих частиц с рецепторами, расположенными в верхних отделах дыхательных путей. К сожалению, на основании известных единичных попыток связать действие аэроионов с возбуждением рецепторов носовой полости (Бут, 1966; Шандала, Трегубова, 1968) невозможно дать объяснениеизвестным фактам, а также обосновать представления о молекулярно-биологических и физиологических механизмах, лежащих в основе действия аэроионов.

Особое место среди представлений и биологическом действии аэроионов приобрела широко распространенная в 60-е — 70-е годы серотониновая гипотеза, выдвинутая Krueger (Krueger, Smith, 1960; Krueger, Sigel, 1981). Согласно этим воззрениям, физиологическое действие отрицательных аэроионов обусловлено уменьшением содержания серотонина в ЦНС аналогично тому, как это было обнаружено авторами в слизистой оболочке дыхательных путей при локальной аппликации аэроионов. Для объяснения этих фактов было высказано предположение об индуцируемом отрицательными аэроионами ускорении ферментативного расщепления серотонина. Широкий спектр действия серотонина как биологически активного вещества мог, по мнению авторов, объяснить многосторонность проявлений физиологического действия газовых ионов на организм. Эта внешне привлекательная гипотеза, ссылки на которую встречаются в литературе до настоящего времени, является первой и практически единственной, в которой предпринята попытка объяснить и связать воедино физиологические и биохимические механизмы действия аэроионов. Следует также отметить, что для объяснения этих механизмов авторы косвенно привлекают МАО-зависимые процессы, с которыми непосредственно связан обмен серотонина. В то же время, серотониновая гипотеза обладает целым рядом недостатков. Во-первых, она была создана на базе результатов, полученных при локальном воздействии аэроионами на периферическую ткань, что не дает оснований для экстраполяции на ЦНС и организм в целом. Во-вторых, в рамках этих представлений не рассматривается вопрос о передаче создаваемого аэроионами сигнала в структуры ЦНС, где развиваются молекулярно-физиологические события. В-третьих, в рамках этой гипотезы не рассматривается связь между физической природой и химическими свойствами активного продукта пула отрицательных аэроионов, равно как и биологический субстрат, с которым эти частицы могли бы первично взаимодействовать. В-четвертых, в том виде, в каком эта гипотеза сохранилась до настоящего времени, она не дает объяснения многочисленным новым фактам и открывшимся противоречиям, в частности разнонаправленным изменениям содержания серотонина в мозговой ткани при воздействии аэроионами различных знаков (Charry, 1984; Charry, 1987), активации отрицательными аэроионами противовоспалительных механизмов в эксперименте (Скардс, 1968) и при их лечебном применении (Palti et al., 1966; Портнов, 1976; Jorda, Schata, 1979; Yates et al., 1987; Deleanu, 1988). В-пятых, этагипотеза не в состоянии объяснить чувствительность к аэроионам других биологических объектов — от бактерий до высших растений и беспозвоночных животных (Минх и др., 1972; Анисимов, 1975).

Упомянутые выше основные концепции господствовали в науке на протяжении более полувекав настоящее время ни одна из них не может рассматриваться как состоятельная (Charry, 1984; Charry, 1987; Rroling, 1985). В целом, несмотря на сохраняющийся теоретический и практический интерес к этому фактору, до настоящего времени отсутствуют научно обоснованные представления о физико-химической природе биологически активного начала отрицательных аэроионов, а также о роли заряда иона, механизмах взаимодействия аэроионов с клетками, тканями и организмом в целом, потенциальных рецепторных структурах, воспринимающих сигнал, а также о ключевых физиологических механизмах, вовлеченных в ответные реакции. Это в значительной мере послужило основанием для формирования у ряда авторов скептического отношения к отрицательным аэроионам как биологически активному фактору естественной воздушной среды (Ritter, 1985). Высказываются также сомнения относительно физиологических и терапевтических эффектов искусственно генерируемых отрицательных кислородных ионов (Kroling, 1985; Charry, 1987).

Проведенный нами анализ работ, опубликованных в этой области в период с 1930 по 1990 гг. показал, что основной причиной противоречивости экспериментальных исследований биологической роли и лечебного действия аэроионов является отсутствие надежных методов селективной генерации биологически активного компонента аэроионного пула, в частности, отрицательных кислородных ионов. Между тем, именно эти компоненты аэроионного пула и, главным образом, супероксид, нам представляются наиболее важными и интересными. Нами были также изучены и обобщены все известные представления о механизмах биологического действия аэроионов. Выводы, которые были сделаны, свидетельствовали о невозможности на основании имеющихся данных дать современную трактовку известных фактов, а также разработать современную концепцию молекулярно-биологических механизмов действия этого фактора окружающей среды.

Основные противоречия и недостатки существовавших представлений были сформулированы нами следующим образом:1) Действующим началом отрицательных аэроионов является один из кислородсодержащих ионов или собственно кислородный ион 0{ (Loeb, 1967; Krueger, 1978), тогда как в случае положительных аэроионов это может быть одна из многочисленных положительно заряженных частиц. Наиболее часто речь идет о газовых ионах С02+, N+ или N02+ (Krueger, Smith, 1968; Sulman, 1980). Поскольку биологические реакции на действие этих противоположно заряженных частиц также почти всегда описываются как диаметрально противоположные (Чижевский, 1960; Krueger, 1978; Kroling, 1985), можно было бы предположить либо наличие двух симметричных входов для этих частиц, либо электрическое взаимодействие между разнозаряженными частицами, нейтрализующее биологически «полезное» и/или «целесообразное» действие одного из видов, в данном случае отрицательного иона. Ни одна из этих версий не нашла в данных литературы адекватного теоретического или экспериментального рассмотрения.

2) Общепринята точка зрения, согласно которой действие аэроионов реализуется через органы дыхания, в первую очередь через легкие крови (Васильев, Чижевский, 1933; Чижевский, 1960). В то же время, наличие электрического заряда делает практически невозможным свободное проникновение этих частиц даже в начальные отделы бронхиального дерева у человека и крупных млекопитающих (Скоробогатова, 1991). Поскольку у мелких лабораторных животных даже самые крупные воздухоносные пути имеют значительно меньший просвет, у этих животных следовало бы практически полностью исключить бронхо-легочный механизм действия аэроионов. В то же время известно, что физиологические реакции на аэроионы практически однотипны у всех млекопитающих, независимо от их размеров (Анисимов, 1975). Существует также достаточно много свидетельств, указывающих на вовлечение легочной ткани в ответ на воздействие аэроионов. Объяснение этого противоречия на основе до сих пор существовавших представлений невозможно.

3) В качестве одного из возможных механизмов воздействия аэроионов на организм животных и человека в ряде работ постулируется взаимодействие с рецепторами кожи (Финогенов, 1962). В то же время действием на кожу нельзя объяснить известные факты ответных реакций на аэроионы со стороны ЦНС, гипоталамических ядер и/или гипофиза и других желез внутренней секреции. Более того, сам факт взаимодействия высоколабильных заряженных частиц скожной поверхностью, экранированной шерстью у животных и одеждой у человека, представляется маловероятным. Кроме того, как в естественных условиях, так и в терапевтических целях воздействие или аппликация аэроионов в подавляющем большинстве случаев осуществляется ингаляционным путем (Портнов, 1978).

4) По мнению большинства авторов, исчезающе малые концентрации аэроионов в воздухе, в том числе в условиях их искусственного образования, трудно сопоставимы с выраженностью физиологических эффектов, ими вызываемых (К1^(1оп, 1960). Для объяснения этого противоречия в последней работе Чижевского (1960) было видвинуто предположение о лавинообразном развитии реакции, вызываемой в ткани единичными аэроионами. Аналогичные соображения высказывались позднее Лотмаром (1972), Крюгером и др. (1975; 1976). При этом оставались без ответа вопросы о биологическом субстрате, с которыми эти частицы могут взаимодействовать, а также о механизмах проникновения этих частиц в ткани. Впоследствии эти представления не были поддержаны и развиты.

Эти, а также многочисленные другие, менее явные, противоречия стимулировали начатый нами поиск активного начала газовой среды, молекулярные механизмы действия которого позволили бы непротиворечиво объяснить известные проявления биологической активности аэроионов. Кроме того, на этом этапе нами были также сформулированы в общих чертах представления о возможных путях и механизмах взаимодействия этого фактора с организмом млекопитающих животных и человека. При этом мы исходили из предпосылок, что действующий фактор пула отрицательных аэроионов, представляющихо наибольший интерес, может быть представлен кислородным ионом 02*, а также что биологическая активность атмосферного супероксида у млекопитающих реализуется, преимущественно, в результате ингаляции этого радикала в процессе дыхания.

Специфика ингаляционного способа воздействия супероксида на организм может быть обусловлена следующим. Физико-химические характеристики радикала (высокая реакционная способность и короткое время жизни в протон-содержащей водной среде слизистых оболочек носовой полости и носоглотки), особенности строения и физиологии полости носа (вихревой характер движения воздушных потоков и 100%-ное насыщение вдыхаемого воздуха парами воды) позволили нам заключить, что реализация химической активности ингалируемого радикала СЪ*" должна происходить преимущественно на уровне слизистой оболочки носовой полости. В этом случае можно ожидать появления физиологических эффектов, обусловленных активацией нервных центров и структур, анатомически и функционально связанных с хеморецепторами полости носа. Подобный физиологический механизм согласуется с известными данным о функциональной активации гипоталамуса аэроионами (ОНуегеаи, 1970). Кроме того, следовые количества стабильного продукта дисмутации супероксида — пероксида водорода — могут проникать в дистальные отделы дыхательного тракта, вызывая как местные реакции, так и рефлекторные ответы со стороны бронхов и легких. Это объясняет известные из литературы физиологические реакции глубоких отделов дыхательной системы (Булатов, 1962; Скоробогатова, 1966), недоступных для проникновения собственно заряженных кислородных ионов. С учетом известных к началу работы данных литературы, нами были сформулированы основные требования, которым должен был бы отвечать претендент на роль биологически действующего фактора аэроионного пула. Эти теоретические представления были обобщены нами следующим образом:• Претендент на роль активного начала атмосферных отрицательных аэроионов должен быть естественным компонентом воздушной средыэтот же газообразный продукт должен образовываться также при искусственной генерации отрицательных аэроионов, независимо от способа их генерации.• В основе воздействия этого продукта на организм может лежать ограниченное число относительно универсальных молекулярно-биологических и физиологических механизмов, которые должны аргументированно объяснять все основные биологические явления, связанные с действием отрицательных аэроионов, включая известные результаты их терапевтического применения.• Исходя из представлений об известном единстве живой и неживой материи, этот продукт или идентичный ему по своим основным молекулярным и химическим характеристикам должен быть представлен также во внутренней среде организма.• В основе взаимодействия этого продукта (ов) с биосубстратом должны лежать общебиологические принципы, при этом млекопитающие и человек должны обладать рецепторными структурами, способными к восприятию как отрицательных аэроионов, так и этого продукта, а также механизмами передачи сигнала в центры нервной и/или эндокринной регуляции. Местонахождением этого рецепторного аппарата могут быть начальные отделы дыхательной системы, в первую очередь носовая полость.• Универсальность распространения активного начала отрицательных аэроионов в воздушной среде может служить указанием на существование у дышащих легкими организмов эволюционно детерминированной потребности в аэроионах или основном действующем факторе последних. В контексте этого предположения можно было ожидать, что удаление этого фактора из среды (депривация) должно найти отражение в нарушении тех или иных функций у животных и, возможно, иметь следствием развитие патологических изменений.

На основании анализа данных литературы нами было сделано предположение об возможной идентичности активного начала пула отрицательных аэроионов с супероксидным анион-радикалом Ог* физико-химическими свойствами и химической активностью которого можно было бы объяснить известный спектр биологического и терапевтического действия отрицательных аэроионов. В связи с вышеизложенным, основной целью настоящей работы было выяснение биологической роли атмосферного супероксида и механизмов его действия на живые системы, а также изучение процессов адаптации организма к активированным формам кислорода атмосферного воздуха в норме и в условиях экспериментальной и клинической патологии.

Основные задачи работы включали:1. создание способа селективного генерирования супероксида О2* в газовой фазе и исследование физико-химических, биофизических и биохимических свойств этого радикала-2. разработку генератора — источника супероксида газовой фазы для экспериментальных биофизических и физиологических исследований и клинического применения-3. комплексное исследование биологической активности искусственно продуцируемого супероксида и продуктов его превращений при прямом действии в различных моделях на клетках и тканях, а также на целостном организме животных при ингаляционном пути поступления в организм-4. определение параметров общей токсичности и местного раздражающего действия супероксида газовой фазы и низких концентраций пероксида водорода при ингаляционном пути поступления в организм животных-5. изучение биологической роли атмосферного супероксида в условиях его элиминации из вдыхаемого воздуха (депривации)-6. исследование эффективности лечебного действия низких концентраций и/или доз активированного кислорода (супероксид, пероксид водорода) при заболеваниях и состояниях, связанных с усилением эндогенного окислительного стресса, сопровождающихся нарушением метаболических, регуляторных и иммунных механизмов (болезнь Паркинсона, болевой синдром, бронхиальная астма).ii. результаты и обсуждениепл. супероксид как биологически активный компонент пула отрицательных аэроионов11.1.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ОТРИЦАТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННЫХ ПРОДУКТОВ ИОНИЗАЦИИ КИСЛОРОДА В «ТИХОМ» КОРОННОМ РАЗРЯДЕОсновной задачей исследований на этом этапе была идентификация биологически активных компонентов пула искусственных отрицательных аэроионов. Для ее решения были предприняты 1) теоретический анализ вероятности образования видов кислородных ионов в электрическом разряде, 2) разработка методов генерации и анализа продуктов ионизации газов в «тихом» коронном разряде, и 3) изучение физико-химических свойств газового иона — основного продукта ионизации чистых газов и смесей (N2, О2, N2/O2, воздух) и вероятного претендента на роль биологически активного начала отрицательных аэроионов. В этом этапе работы принимали участие Н. И. Гольдштейн (формулировка задачи, участие в проведении физико-химических исследований, обработка данных и обсуждение результатов), NII Н. Мерзляк (участие в проведении физико-химических исследований, обработка данных и обсуждение результатов) и P. H Гольдштейн (участие в проведении физико-химических исследований).

Процессы, протекающие в коронном разряде, достаточно сложны, поскольку образующиеся здесь электроны и ионы не являются моноэнергетическими. В качестве модели коронного источника отрицательно заряженных кислородных ионов была выбрана радиально-симметричная модель коаксиального реактора с полубесконечным отрезком проволоки (рис. 1).

Рис. 1. Модель зоны коронного разряда. 1 — острие- 2 — диэлектрик. Остальные пояснения в тексте.

Были рассмотрены отдельно области, А и В для случая отрицательно заряженного электрода. Область А.

Здесь рг можно принять равной нулю, поскольку скорость движения электронов, т. е. скорость их выхода из области, А с учетом дрейфа, захвата, рекомбинации и других процессов значительно превышает скорость движения ионоврз = 0, и ее следует учитывать только при высокой степени ионизированности кислородар4 г 0, так как отрицательные ионы при сравнительно низких энергиях электронов возникают во внешней области коронного разряда, в основном, в результате процессов прилипания: е" + 02 02.

Здесь р5 можно не учитывать, поскольку в области, А: Е (р5) «Е (рх), где Е (р5) и Е (р,) — напряженность поля, создаваемого в области, А зарядами р5 и рь Таким образом, необходимо учитывать только Е (Р1). Область В.

Возможно, что возбуждение кислорода в импульсах Тричела (ТпсЬе1, 1938; Могголу, Ьолуке, 1983), если они вызваны движением отрицательных ионов, происходит именно здесь, и что этот процесс также обусловлен прилипанием электронов. Поле в этой области определяет характер движения и образования отрицательных ионов, поэтому здесь р з = 0. Поле в области В, создаваемое р1 и рз из области А, недостаточно для ионизации и возбуждения кислорода. р2 г 0, так как здесь происходит эффективный захват электронов, потерявших энергию в области А. Р4 2 0, поскольку только отрицательные ионы создают пространственный заряд в области В. Также р5 г 0, и он влияет на движение ионов. Таким образом, в области В: Е? Е (Р1) + Е (р4) + Е (р5).

Анализ показал, что атомарный ион О" является, вероятно, одним из первичных продуктов ионизации кислорода, в образовании которого участвуют электроны с энергией 360 кДж моль" 1. Из относительно стабильных радикальных форм кислорода, ион Онаиболее реакционноспособен, вступая в реакции даже при температуре жидкого азота (Разумовский, 1979). Дальнейшая эволюция этого иона в воздухе может привести к образованию широкого спектра частиц, включая ион 02 а также таких молекулярных продуктов как О3, NO, N02, С02 и др. (Лившиц и др., 1984).

Освобожденные в первичном акте ионизации менее активные электроны с энергией 42 кДж моль" 1 могут быть захвачены при столкновениях с нейтральными молекулами. Таким путем также возможно образование иона 02: е + 02 -" 02с последующим образованием ионов О4″ «, Оз, N02, N03, COf и „ОН, причем в ряде случаев предполагается протекание процессов с участием трех частиц, напр.:02 + С02 + 02 ^ С04 + 02 02 + 02 + 02 04 + 02 На этом основании некоторые авторы рассматривают ион С04 как основнойбиологически активный продукт аэроионного пула (Rosenthal, Ben-Hur, 1980). Здесьважно отметить, что вероятность реализации процессов с участием трех частиц намного порядков меньше, чем реакций между двумя частицами. В частности, константы скорости последних двух реакций при комнатной температуре составляют, соответственно, 2*10“ 29 смбс-1 (Смирнов, 1978) и 3*10» 31 cmV (Разумовский, 1979).

Математический анализ реакций между газовыми частицами, возникающими вкоронном разряде, был проведен в работе Сальма и Лутса (1986). Решение этойсистемы до возраста частиц 1 с показало, что в реальных условиях основнымиотрицательными ионами в атмосферных условиях могут быть кластеры 02*(H20)s и02,(Н20)4. Действительно, существование подобных кластеров в атмосферномвоздухе было установлено. В прямых масс-спектрометрических исследованиях былопоказано, что среди продуктов ионизации обнаруживаются преимущественнокластеры вида СЬ’ЧНгО)^ где n = 1.5, если в качестве ионизатора используется аисточник (Huertas, Fontan, 1983, цит. по: Dolezalek, 1985). При ионизации в коронномразряде ион О2 обнаружен не был. В то же время, проведенный нами подробныйанализ физической модели коронного генератора газовых ионов, в частности, влияниеплотности зарядов на острие, плотности заряда свободных электронов, плотностизарядов отрицательных ионов и плотности зарядов, индуцированных в диэлектрике, атакже анализ вероятностей протекания описанных выше реакций показал (Гольдштейн, 1988), что наиболее вероятным относительно стабильным ибиологически активным продуктом, образующимся на отрицательном острие в"тихом" коронном разряде в кислороде может являеться отрицательныймолекулярный ион кислорода 02 который представляет собой супероксидный анионрадикал, обозначаемый в биохимической литературе как Об этом жесвидетельствуют выводы, сделанные в работах Бучельниковой (1958) и Fehsenfeld (1974). Работ, посвященных биохимической идентификации этого продукта в пулеионизированных и возбужденных частиц в коронном разряде в кислороде к моментуначала наших исследований нам не было известно.

Отрицательные аэроионы как источник супероксида. Основная задача экспериментальных исследований на этом этапе заключалась в разработке эффективного источника отрицательных кислородных ионов и сопоставление физико-химических и биохимических свойств основного образующегося продукта с известными характеристиками супероксидного радикала. В качестве генератора был выбран коронный ионизатор в виде радиально-симметричного коаксиального реактора с полубесконечным отрезком проволоки (Bregnsbo е1 а1., 1974), общий вид которого представлен на рис. 1. Комплекс требований, которые были нами определены при разработке генератора и условий ионизации газов, включал получение ионов в замкнутом объеме при нормальном атмосферном давлении и комнатной температуре, возможность использования различных газовых сред и их быстрой замены, контроль и регулировку высокого напряжения и ионного тока, минимизацию паразитных токов и поляризации материалов, возможность исследования продуктов ионизации в конденсированных средах (водные растворы, апротонные растворители), а также обеспечение осушения и дополнительной очистки исследуемых газов и возможности регулировки объемной скорости их потока, термостатирования и перемешивания жидкостей и предотвращения их интенсивного испарения под действием электронного ветра, предотвращения образования и/или возможности удаления побочных нейтральных газообразных продуктов (озон, окислы азота). Особое внимание было уделено разработке конструкции электродов. Испытания показали, что по ряду параметров (отсутствие побочных продуктов, стабильность работы и др.) оптимальным материалом для изготовления катода являются некоторые виды электропроводного угольного волокна, имеющие ряд преимуществ перед традиционными материалами (платина, золото, медь, сталь). Помимо ионизации молекул газов, конструкция катода обеспечивала нейтрализацию противоионов, устранение объемного заряда и элиминацию нейтральных побочных продуктов. Анод, во избежание поляризации, а также для предотвращения прямого окисления продуктов химических реакций, был изготовлен, в разных модификациях, из платины или КС1-агар-агара. Схематическое изображение установки и электрохимической ячейки для генерирования газовых ионов приведены на рис. 2.

Цикл работ по физико-химической и биохимической идентификации кислородных ионов, генерируемых в газовой фазе при прямой ионизации кислорода, газовой смеси азот/кислород или воздуха, а также при ионизации кислорода продуктами ионизации азота, возникающими на отрицательном острие в &bdquo-тихом" коронном разряде, включал прямые спектрофотометрические исследования в газовой фазе и в апротонныхрастворителях, изучение взаимодействия продуктов ионизации с известными акцепторами супероксидного аниона (цитохром с, нитросиний тетразолий, адреналин), с хлорофиллом и каротиноидами в диметилсульфоксиде (ДМСО), цитотоксическое действие продуктов ионизации на микроорганизмы, включая образование малонового диальдегида (МДА) и диеновых конъюгатов (ДК) в клетках, а также влияние на эти процессы ингибиторов супероксид-зависимых реакций (СОД, каталаза, тетранитрометан) и тушителей синглетного кислорода (азид натрия, гистидин, 1,4-диазо-бицикло{2,2,2}октан — ДАБЦО).

Некоторые электрические характеристики ячейки представлены на рис. 3: Рис. 3. Электрические характеристики ячейкиТок ионизации N2: кривые 4−1- Ток ионизации 02: кривые 5−8- Изменения значений тока показаны как функции от скорости протока газа, соответственно 50, 100,250 и 500 мл/минIII. 1.2. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ОТРИЦАТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННЫХ ПРОДУКТОВ ИОНИЗАЦИИ КИСЛОРОДАЭксперименты по обнаружению О' в газовой фазе. Поскольку многие из форм активированного кислорода обладают специфическим поглощением в иУ-области (Разумовский, 1979), нами была предпринята попытка непосредственного обнаружения возникающих в коронном разряде в токе кислорода продуктов по их поглощению в диапазоне 190−300 нм. Ионизированный кислород продували либо через кювету из кварцевого стекла с длиной оптического пути 120 мм, либо через интегрирующую сферу с покрытием из Ва80ф В этих экспериментах поглощающие в иУ-области продукты обнаружены не были (данные не приводятся). С учетом чувствительности спектрофотометра (не менее 0,01 ед. опт. плотности) и молярного коэффициента поглощения для Ог (Ю3 М" 1 см") было сделано заключение, что стационарная концентрация этого продукта в газовой фазе не превышает 10″ М. Эта оценка справедлива в случае, если возникающие продукты обладают большим временем жизни в газовой фазе и не гибнут с большой скоростью на внутренних поверхностях кюветы.

Эксперименты по обнаружению О2' в опрошенных растворителях. Один из возможных подходов для обнаружения Ог заключается в использовании апротонных растворителей, в которых эти радикалы могут обладать значительным временем жизни, достигающим нескольких часов (Hyland, Auclair, 1981). Действительно, при обдувании чистого ацетонитрила потоком ионизированного кислорода, в растворителе были обнаружены продукты, поглощающие в коротком ультрафиолете. В аналогичных условиях было зарегистрировано появление продукта (ов) с широкой полосой в области 270 — 280 нм также в ДМСО (рис. 4).АРис. 4. Спектры поглощения продуктов, образующихся при введении ионизированного кислорода в ДМСО.

Продолжительность обработки: 1 — 0 мин, 2 — 4 мин, 3−10 мин. Напряжение на катоде (-)3,0 ± 0,1квионный ток 7 мкА. А — оптическая плотность.

Однако, хотя эти спектры соответствовали тому, что наблюдается при генерации О2* в щелочном ДМСО, они не обладали достаточной характерностью. Дополнительные указания на возникновение Ог* в коронном разряде были получены с применением насыщенного раствора акцептора ё, 1-адреналина в ДМСО, который23под действием радикала 02* окисляется до адренохрома (М1эга, 1987, Мерзляк, 1989). Было обнаружено, что в этих условиях возникает характерная для адренохрома интенсивная полоса поглощения с максимумом около 480 нм, что может указывать на присутствие в газовой фазе супероксидного анион-радикала (рис. 5).Рис.5. Влияние продуктов ионизации кислорода на окисление адреналина в ДМСО.

Продолжительность воздействия: 0−0 мин- 1−1 мин- 3−10 мин- 4−30 мин. Напряжение на катоде (-)3,0 ± ОДквионный ток 7 мкА. А — оптическая плотность. нм400 500 600 700Были предприняты также попытки прямой идентификации супероксида путем регистрации спектра ЭПР в ДМСО, как это было описано при генерации значительных количеств этого радикала в щелочном ДМСО (Hyland, Auclair, 1981; Merzlyak et al., 1991). В условиях генерации супероксида, идентичных использованным в оптических исследованиях, сигнал в ДМСО зарегистрировать не удалось. Мы не смогли также обнаружить появление семихинонов тайрона при добавлении этой спиновой ловушки кислородных радикалов к ацетонитрилу или ДМСО спустя 20−30 минут после обработки потоком отрицательных ионов кислорода. Следует также добавить, что в контрольных опытах ДМСО, подвергавшийся аналогичному действию ионов кислорода, не вызывал окисления адреналина в адренохром при его добавлении к свежему раствору акцептора в этом растворителе. В связи с этими данными можно думать, что возникающие при ионизации кислорода и обладающие свойствами супероксида короткоживущиеактивные частицы исчезают в реакциях с остаточными количествами воды или примесей, содержащихся в коммерческих растворителях даже высокой степени очистки.

Взаимодействие продуктов ионизации кислорода с хлорофиллом и каротиноидами в ДМСО. Фотосинтетические пигменты хлорофиллы и каротиноиды обладают высокой чувствительностью в реакциях с формами активированного кислорода. В ряде случаев в результате этих реакций возникают специфические продукты, позволяющие охарактеризовать природу окисляющего агента (Мерзляк, 1989; Мегг1уак е1 а1., 1991). В этой связи были изучены спектры поглощения пигментных экстрактов листьев гороха, в спектры поглощения которых основной вклад вносят хлорофилл, а (максимумы при 450 нм и 666 нм) и хлорофилл Ь, проявляющийся в виде плеча при 650 нм и вместе с каротиноидами обусловливающий полосы поглощения между 460 и 510 нм. Исследование показало зависимое от длительности экспозиции продуктами ионизации кислорода прогрессивное снижение оптической плотности хлорофиллов и каротиноидов во всем видимом диапазоне оптического спектра, свидетельствующее о деградации пигментов. Была предпринята также попытка охарактеризовать продукты взаимодействия хлорофиллов с отрицательными кислородными ионами. Известно, что супероксидный анион, генерируемый электрохимическим восстановлением в ацето нитриле, вызывает селективный отрыв протона от углерода С-10 циклопентанонового кольца V хлорофиллов, а и Ъ с образованием соответствующих енолят-ионов (т.н. интермедиатов Молиша). В результате окисления этих продуктов молекулярным кислородом происходит образование продуктов с хлориновым или родиновым типами спектров поглощения, т.н. алломеризация хлорофилла (Мегг1уак е1 а1., 1985). Можно было предположить протекание этого процесса также при действии на пигмент продуктами ионизации кислорода. Опыты были проведены с растворенным в ДМСО неалломеризованным хлорофиллом а. Как и в опытах с общим экстрактом, действие ионов кислорода приводило к выцветанию основных полос поглощения пигмента и появлению отчетливых изобестических точек (рис. 6). Такой характер спектральных изменений характерен для необратимой деградации хлорофилла, например при его фотоокислении (Мерзляк, 1984). Это явление не наблюдалось при воздействии на хлорофилл, а нейтральным кислородом.АРис. 6. Влияние продувки ионизированным кислородом на изменение спектров поглощения хлорофилла, а в ДМСО.

Напряжение на катоде (-)3,0 ± ОДквионный ток 1,5 мкА. А — оптическая плотность. Продолжительность обработки: 1−0 мин, 2−10 мин, 3−30 мин, 4−60 мин.

Продукт ионизации кислорода как предшественник пероксида водорода. Впоследующих экспериментах было обнаружено, что в результате ионизации кислорода возникает продукт с выраженными окислительными свойствами, идентифицированный в хемилюминесцентной реакции с люминолом в щелочной среде как пероксид водорода. Доказательствами образования пероксида водорода могут служить ингибирование хемилюминесцентной реакции каталазой. Доказательствами присутствия супероксида как предшественника пероксида водорода послужили ингибирование процесса тетранитрометаном и резкое ускорение процесса в результате добавления каталитических количеств СОД (рис. 7).

Длительность воздействия, минРис. 7. Влияние восстановленных продуктов ионизации кислорода на образование пероксида водорода в щелочной среде.

1 — без добавок- 2 — в присутствии каталазы (1 мкМ) — 3 — в присутствии тетранитрометана (1 мкМ) — 4 — в присутствии СОД (30 нМ).

Напряжение на катоде: (-)3,0 ± 0,1квионный ток: 0,3 мкАбуферный раствор: гликоколь-КаОН, рН 10,1.

Эксперименты по обнаружению О2 в водной среде с применением акцепторов.

Было показано, что продукт (ы) ионизации кислорода дозо-зависимым образом окисляют адреналин и восстанавливают цитохром с и нитросиний тетразолиевый в растворе и/или на мембране, разделяющей газовую и водную фазы, а также что эти процессы эффективно ингибируются СОД (рис. 8,9).

0,1 -0,155 050 045 0400X, нмРис. 8. Изменение спектров поглощения цитохрома с (20 мкМ) в 50 мМ К-фосфатном буфере рН 7,8, содержащем ОД мМ ЭДТА, при взаимодействии с ионизированным кислородом.

При потенциале на катоде -3 кВ и величине тока 7,0 мкА скорость генерации супероксида составляла 20% от установленной в общепринятых условиях определения активности СОД в системе ксантиноксидаза-ксантин (РпскмсЬ, 1972).

Введение

формиата натрия (1 мМ) не увеличивало выход продукта. Обращает на себя внимание также факт, что ингибирование восстановления цитохрома с супероксиддисмутазой было неполным, и при концентрации фермента 3 ед. мл" 1 не превышало 64%, что может служить указанием на присутствие в пуле заряженных частиц также других восстанавливающих агентов. Такой активностью, в частности, могут обладать гидратированные электроны (еач—), формирующиеся в растворе из пула свободных электронов газовой фазы. Образование гидратированных электронов было нами показано, в частности, при ионизации молекулярного азота. Так, формирование супероксида в принципе возможно при возбуждении чистого азота с последующим выдуванием образующихся продуктов в кислород, а также в азоткислородных смесях и воздухе. Протекающие в этих условиях процессы могут быть описаны реакциями: а) N2 + 2е .(в газовой фазеб) е + 02 —" 02 В присутствии паров воды происходит образование гидратированного электрона еач, который может взаимодействовать с растворенным в воде кислородом с образованием гидратированной формы (02*)ад:в) е + Н20 е адг) еач + 02 ^02-ач}в водной фазе и на мембранеПри этом в НСТ-содержащей среде на мембране легко можно обнаружить появление интенсивной полосы поглощения с максимумом в области 540 — 560 нм при регистрации диффузного отражения целой окрашенной мембраны и при 515 нм после растворения мембраны в пиридине, что в обоих случаях соответствует поглощению диформазана.

Образование еая в результате ионизации азота было доказано введением в газовую среду закиси азота, что предотвращало образование супероксида путем элиминации еас: Ы20 + еа N2 + ОН + 'ОНИсчезновение восстанавливающей активности после введения закиси азота показано на рисунке 10: ОРис. 10. Накопление формазана на фильтрах «Владипор» при восстановлении нитросинего тетразолия продуктами ионизации азота (1).(2) и (3) — введение в газовую среду закиси азота или неионизированного азота (контроль).

Характерно, что прямое восстановление ИСТ гидратированными электронами в бескислородной среде не ингибируется СОД.

Было также показано, что прямая ионизация кислорода может быть заменена ионизацией азота с последующим выдуванием образующихся электронов в кислород. Электроны, двигаясь в электрическом поле и достигая область мембраны, могут взаимодействовать с растворенным кислородом. Поскольку химические реакции образующегося продукта, а также продукта ионизации кислорода или кислородсодержащих смесей во всех случаях ингибировались СОД, был сделан вывод об идентичности этого продукта с супер оксидным анион-радикалом кислорода. На основании полученных результатов были установлены оптимальные условия генерации этого продукта, идентифицированного впоследствии как супероксидный анион-радикал кислорода. В дальнейшем нами были разработаны способы получения газообразного супероксида также в условиях прямой ионизации воздуха. Уменьшение образования и выхода в зону реакции побочных продуктов было достигнуто путем изменения конструкции катода, что позволило уменьшить величину напряжения, а также осуществить активное выведение из зоны возбуждения следовых количеств побочных нейтральных продуктов (Оз в коронном разряде в кислороде, Оз и окислы азота — в воздухе). На способ генерирования супероксида в изученных газовых смесях, генератор супероксида и созданный на его основе медицинский ингалятор нами были получены два патента (DE 41 12 459 и DE 195 12 228).

Известно, что в силу ряда физических и технических ограничений прямая идентификация кислородных супероксид-радикалов часто оказывается затруднительной. Аналогично большинству исследований супероксид-иона invivo, основанных почти полностью на косвенных свидетельствах (Flohe, 1988), представленные в этом разделе данные позволили нам сделать вывод о том, что при ионизации кислорода в «тихом» коронном разряде возникают частицы, тождественные по всем исследованным свойствам супероксидному радикалу О2'. Это заключение было сделано по результатам исследований восстановления нитросинего тетразолиевого и цитохрома с, окисления адреналина до адренохрома, изменения спектров поглощения апротонных растворителей, взаимодействия с фотосинтетическими пигментами, образования пероксида водорода, зависимости этих процессов от присутствия СОД, тетранитрометана и каталазы, а также цитотоксического действия высоких доз продуктов ионизации на микроорганизмы (см. ниже).

Нами было установлено, что основными факторами, влияющими на состав продуктов и скорость генерации газообразного супероксида в коронном разряде, являются материал и геометрия источника ионов, величина потенциала возбуждающего электрода, состав газовой среды, скорость пропускания газа через зону электрического возбуждения и величина ионного тока в промежутке «острие-Земля». Были определены диапазоны каждого из факторов, в пределах которых достигалась оптимальная скорость генерирования супероксида, находившаяся в пределах 0,1 — 0,5 мкМ мин" 1 и было показано, что в выбранных условиях образование побочных продуктов (озон, окислы азота) пренебрежимо мало. В дальнейшем, нами были проведены комплексные исследования биологической активности, лечебных эффектов и токсикологических характеристик этих частиц, обозначенных в последующем изложении терминами &bdquo-экзогенный" или &bdquo-газообразный" супероксид. Большинство исследований проводили в условиях, практически исключающих образование побочных продуктов и при скорости генерации супероксида, измеренной по восстановлению цитохрома с на расстоянии 10 мм от катода, равной 0,25 ± 0,06 мкМ мин" 1.ii.2. биологические эффекты экзогенного 02*П.2.1. ЦИТОТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ НА КЛЕТОЧНОМ УРОВНЕ ВЫСОКИХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ПРОДУКТОВ ИОНИЗАЦИИ КИСЛОРОДАХорошо известно, что такие продукты превращений радикала как пероксид водорода, гидроксильный радикал и синглетный кислород ('СЬ), обладают цитотоксическими свойствами (Elstner, 1990). Известно также, что 'СЬ может быть отнесен к числу возможных первичных продуктов, образующихся в газовой фазе при прямой ионизации кислород-содержащих смесей и кислорода (Hagstrum, 1951; Бучельникова, 1958; Biondi, 1963). Время жизни синглетного кислорода в газовой фазе может достигать 2,7 с (Kasha, Khan, 1970). Этот продукт отличается высокой реакционной способностью (Фут, 1979; Сапежинский, 1988; Красновский, 1988), в силу чего способен вызывать необратимые деструктивные эффекты в мембранных структурах клеток.

С учетом этих данных, мы исследовали влияние относительно высоких концентраций продуктов ионизации кислорода на рост и процессы перекисного окисления липидов в культурах микроорганизмов Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, E. coli, Bacillus subtilis, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoneae, Pseudomona aeruginosa, Salmonella typhimurium, Candida albicans. Культуры были посеяны на средах на поверхности агара или в агаровом слое в посевных дозах 102 и 103 микробных тел на чашку Петри. Длительность экспозиции составляла 15 и 60 минут, максимальная скорость генерации супероксида 1,1 ± 0,3 мкМ мин" 1. Во всех случаях было отмечено зависящее от интенсивности и длительности воздействия угнетение роста микроорганизмов, более выраженное в культурах на поверхности агара.

Введение

в среду каталитических количеств СОД усиливало, тогда как введение каталазы почти полностью снимало цитотоксический эффект. На рисунках 11 и 12 приведены результаты исследования с использованием в качестве тест-объекта культуры Е. coli.

100 Пос оQ. IXО? л575 ш 50хо с-о *оQ.

25 100 л чО: ан яоа0 мкА 5 мкА 15мкАИонный ток в промежутке катод-объект25 мкАРис. 11. Влияние продуктов ионизации кислорода на рост колоний клеток культуры Е. coli как функция от величины ионного тока.

Ионному току 25 мкА соотв. скорость генерирования 02 1,1 ± 0,3 мкМ мин" 1к с. о а. IX §-£Xос- §-5о а.

100 100 755 025 82**28#**бmконтрольсупероксидсупероксид+СОД супероксид+СОД+катРис. 12. Влияние продуктов ионизации кислорода в сочетании с добавлением СОД и каталазы на рост колоний клеток культуры Е. coli. Ионный ток 5,0 ± 0,25 мкА.**) р < 0.01 к контролю- #) р< 0.05 к «супероксиду"Далее было показано, что тушители синглетного кислорода азид натрия (15 мМ) и ДАБЦО (50 мМ) не влияли на скорость роста микроорганизмов и накопление продуктов пероксидации липидов (данные не приводятся). Эти результаты были расценены как доказательство отсутствия в исследуемой газовой среде биологически значимых количеств 'Ог и, соответсвенно, о возможной связи цитотоксических эффектов ионизированного газа с образованием продуктов спонтанной и СОД-зависимой дисмутации супероксида — пероксида водорода и, возможно, гидроксильного радикала.

Цитотоксическое действие продуктов ионизации кислорода было обнаружено также в другой постановке экспериментов. Так, в последующей серии опытов обработке продуктами ионизации кислорода подвергались наконечники многоразовых ланцетов, предварительно погруженные в одну из клеточных суспензий, с последующей качественной оценкой бактериальной обсемененности смывов. Результаты одного из типичных опытов приведены в таблице 1.

Таблица 1. Качественная оценка влияния продуктов ионизации кислорода на рост колоний бактериальных культур. Длительность воздействия 15 минионный ток 25,0 ± 3,9 мкА.

Таким образом, в этих сериях экспериментов было продемонстрировано отсутствие детектируемых физико-химическими и биологическими методами количеств хОг в пуле частиц, образующихся в «тихом» коронном разряде в кислороде.II.2.2. ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПРОДУКТОВ ИОНИЗАЦИИ КИСЛОРОДА И НИЗКОДОЗИРОВАННОГО ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА В УСЛОВИЯХ ХРОНИЧЕСКОГО ЭНДОНАЗАЛЬНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ЖИВОТНЫХВнимание к кислородным радикалам и их роли в возникновении и развитии окислительного стресса восходит к открытию фермента с супероксидцисмутазной активностью, что послужило свидетельством в пользу постоянного присутствия in vivo супероксида (McCord, Fridovich, 1969). Последовавшие многочисленные исследования и публикации в огромной мере способствовали становлению современных представлений о биологической роли супероксида и его реактивных интермедиатов. В настоящее время известно (Halliwell, 1994), что генерация in vivo супероксида и пероксида водорода может осуществляться в ходе различных ферментативных реакций в различных компартментах клетки — микросомах, митохондриях, эндоплазматической сети и др. (Elstner, 1990). Кроме того, супероксид, а также другие продукты одноэлектронного восстановления кислорода, могут быть специфически инициированы в клетках, отвечающих за воспалительный ответ — нейтрофилах и макрофагах (Babior, et al., 1973). Образование активированных форм кислорода в организме может быть также инициировано действием внешних факторов (радиация, озон, токсические вещества) либо непосредственно, либо приразрушении клеток и тканей и активации процессов внутриклеточного образования этих продуктов. В большом числе описанных случаев эндогенно образующиеся активированные формы кислорода обладают выраженным повреждающим потенциалом и вовлечены, повидимому, в этиологию и патогенез целого ряда заболеваний (Cohen et al., 1984; Halliwell, Gutteridge, 1988; Jarjour, Calhoun, 1994).

Выше было отмечено, что окружающая воздушная среда в нормальных условиях всегда содержит некоторое, хотя и исчезающе малое, количество атмосферного супероксида. Известно также, что концентрации супероксид-содержащих отрицательных аэроионов при' их терапевтическом применении превышают естественные на 2 — 3 порядка (Kroling, 1985). Одновременно речь может идти также об образовании при искусственной ионизации воздуха продукта спонтанной дисмутации супероксида — пероксида водорода. Нетрудно представить, что если действие ингалируемого супероксида может быть ограничено слизистой носовой полости и верхнего отдела дыхательного тракта, то не несущие электрического заряда молекулы пероксида водорода могут проникать в более глубокие отделы бронхиального дерева, достигая легочных альвеол.

В этой связи особую актуальность приобретает вопрос о токсичности супероксида и пероксида водорода, ингалируемых в терапевтических целях при их эндоназальной аппликации. Для ответа на этот вопрос нами были проведены специальные токсикологические исследования. Исходя из теоретических расчетов и сопоставления химической активности отрицательных аэроионов и супероксида, для дальнейших медико-биологических исследований нами был выбран диапазон скоростей генерации супероксида в кислороде, равный 0,2 — 0,3 мкМ мин-1 и концентрация перекиси водорода 50 мкМ.

Изучение общетоксического действия газообразного • В задачи исследования, в котором участвовали Н. И. Гольдштейн (постановка задачи, участие в проведении эксперимента, обсуждение результатов), Л. Антоновича и Д. Спруджа (проведение эксперимента, обработка данных и обсуждение результатов), входило изучение влияния ингаляций газообразного супероксида на показатели гомеостаза, морфологические и функциональные изменения внутренних органов и систем, а также поведенческие реакции у животных в условиях хронического эксперимента.

Исследование показало, что продолжительные ингаляции обогащенной супероксидом воздушно-кислородной смеси при скорости генерирования супероксида в пределах 0,2 — 0,3 мкМ мин-1 не вызывают выраженных токсическихэффектов у животных. Было отмечено некоторое увеличение числа эозинофилов в периферической крови, которое, однако, нет оснований расценивать как вызванное специфическим действием супероксида, поскольку умеренная эозинофилия, связанная с применением кислорода, в частности, при его инфузионном применении, описана неоднократно и не рассматривается как неблагоприятный признак. В более поздних клинических исследованиях (см. ниже) эозинофилия периферической крови обнаружена не была. Напротив, нами было отмечено достоверное снижение эозинофилов в мазках из носовой слизи у детей-астматиков после шестинедельного курса терапевтического применения ингаляций супероксида, что следует рассматривать как клинически благоприятный результат. Были отмечены также малозначимые с токсикологической точки зрения изменения белковых фракций крови, например возрастание гамма-глобулинов, которые были также обусловлены действием чистого кислорода, поскольку они были значительно сильнее выражены в контрольной группе животных, ингалировавших смесь неионизированного кислорода с воздухом. Качественное и количественное исследование лаважа из трахеи и бронхо-легочного отдела животных показало незначительное возрастание числа лимфоцитов и нейтрофильных гранулоцитов, что указывает на ограниченный катаррально-воспалительный процесс. Аналогичные явления быстропреходящего, с продолжительностью не более двух суток, раздражения верхних дыхательных путей были отмечены также у некоторых больных бронхиальной астмой в первые дни ингаляции супероксида (см ниже) и отрицательных аэроионов (Булатов, 1962). В обоих случаях это не оказывало отрицательного воздействия на больных и не препятствовало дальнейшему проведению терапии.

Далее, у животных основной группы было обнаружено увеличение массового коэффициента тимуса, а также нарастание числа клеток-предшественников Т-лимфоцитов в тимусе и селезенке, что можно предварительно оценить как отражение улучшения иммунной резистентности организма. Наконец, продолжительные ингаляции супероксид-содержащей газовой смеси повышали двигательную активность животных, что может быть расценено как стимулирующее действие супероксида. Этот вывод находит определенное подтверждение также в результатах проведенного нами независимого электронно-микроскопического исследования аденои нейрогипофиза крыс после 10 одночасовых сеансов ингаляций супероксида в аналогичных условиях. На ультраструктурном уровне были обнаружены признаки умеренной стимуляции аденоцитов, особенно сильно выраженные в пуле АКТГпродуцирующих клеток (см. ниже). Признаков функциональных нарушений и повреждения структур выявлено не было.

Изучение общетоксического действия низких доз пероксида водорода. Целью исследования являлось изучение параметров хронической токсичности низкоконцентрированного пероксида водорода (50 мкМ) при эндоназальной аппликации белым беспородным крысам. Работа проводилась совместно с Ю. Бобковым в рамках подготовки материалов для Фармкомитета РФ по новому лицензированному в России лекарственному средству для лечения болезни Паркинсона и симптомокомплекса паркинсонизма. Помимо пероксида водорода, лекарственное средство содержало допущенные к применению стабилизаторы, концентрация каждого из которых находилась в пределах, значительно ниже токсических.

Известно, что хорошо изученный с токсикологической точки зрения пероксид водорода относится к веществам малотоксичным. Из обобщенных в ЕСЕТОС (1993) показателей токсичности пероксида водорода следует, что значения 1ЛЭ50 при пероральном введении растворов в диапазоне концентраций от 9,6% до 90% составляют, по данным разных авторов, -1200 мг/кг массы тела. При определении острой кожной токсичности 35−90%-ных растворов было установлено, что концентрации 35% и 70% проявляют низкую кожную токсичность у кроликов, а 90%-ный раствор — у свиней и кошек. 1X50 для крыс при четырехчасовой экспозиции составляет 2000 мг/м3. В качестве основных поражений отмечаются отек легких и некроз эпителия бронхов. 5%-ный раствор пероксида водорода оказывал слабораздражающее действие на слизистые оболочки глаза, при этом максимально выраженные признаки воспаления наблюдались через 1 час после аппликации и полностью исчезали к 72 часам. Таким образом, установленные экспериментально токсические концентрации пероксида водорода значительно превышают концентрацию этого вещества в подлежавшем исследованию лекарственном средстве. На тканевом и клеточном уровне собственно пероксид водорода также рассматривается как относительно малореакционноспособный и нетоксичный продукт (НаШуе11, 1992).

Во время курса введения пероксида водорода в составе антипаркинсонического средства не было отмечено каких-либо различий в исследованных показателях между группами животных, получавших лекарственный препарат и контрольными. Двигательная и эмоциональная активность, реакция на внешние раздражители, потребление воды и пищи у всех животных соответствовали физиологической норме. В течение всего эксперимента была отмечена положительная динамика изменения массы тела, практически одинаковая у подопытных и контрольных животных. Не было зарегистрировано изменений состава периферической крови и биохимических параметров сыворотки крови. Эти показатели не претерпели изменений по окончании восстановительного периода. Морфологическая структура органов и тканей подопытных животных соответствовала норме и не отличалась от таковой у животных контрольной группы (данные не приводятся). Таким образом, результаты хронического эксперимента не выявили отрицательного влияния препарата, содержащего пероксид водорода в концентрации 50 мкМ, на функциональную активность и морфологическую структуру органов и систем организма крыс при эндоназальном применении в течение двух месяцев в суточных дозах 50, 500 и 1000 мкл/кг. На основании этих данных было сделано заключение об отсутствии у препарата общетоксического, а также раздражающего действия при эндоназальной аппликации. Было рекомендовано допустить новое антипаркинсоническое средство к клиническим испытаниям.

В целом, результаты приведенных выше исследований продемонстрировали отсутствие общетоксического действия на лабораторных животных двух изученных активированных форм кислорода — супероксида и пероксида водорода — при их эндоназальной аппликации в низких концентрациях и дозах. Полученные результаты подтверждают установившиеся представления о токсикологической безопасности отрицательных аэроионов при их лечебном применении. Здесь следует лишь отметить, что при применении ингаляций аэроионов в силу известной неопределенности в отношении качественного и количественного состава пула возбужденных и ионизированных частиц, генерируемых различными ионизаторами воздуха, в ряде случаев можно ожидать возникновение неблагоприятных побочных эффектов за счет образующихся побочных продуктов, в частности таких, как окислы азота или озон (Кгб1и^, 1985).

В настоящее время хорошо известно, что представления о повреждающем действии супероксида и пероксида водорода сформировались, в первую очередь, на основе исследований эндогенной продукции этих активированных форм кислорода и связанных с ними деструктивных процессов в клетках и тканях. В отличие от эндогенных форм, экзогенные супероксид и пероксид водорода, в ничтожных количествах представленные в атмосферном воздухе и естественных водах, входят вконтакт с ограниченной клеточной поверхностью, в первую очередь, слизистой оболочкой носовой полости и роговицей глаза. Сравнительно высокая антиокислительная защищенность этих структур, в частности, высокая супероксиддисмутазная и каталазная активность слизистой носовой полости (Halliwell, 1988), могут не только служить свидетельством адаптации к экзогенным активированным кислородным продуктам естественного происхождения, но также лежать в основе устойчивости тканей, подвергающихся воздействию этих факторов при их терапевтическом применении. Полученные нами в этом разделе результаты подтверждают это заключение.

П. 2.3. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ НИЗКИХ ДОЗ ЭКЗОГЕННОГО 02* НА КЛЕТОЧНОМ И ТКАНЕВОМ УРОВНЯХВплоть до настоящего времени, исследования биологических эффектов отрицательных аэроионов на тканевом и клеточном уровнях носили преимущественно описательный характер, а полученные результаты не нашли объяснения в рамках единой гипотезы действия аэроионов. Так, не нашли, на наш взгляд, удовлетворительного объяснения такие далекие друг от друга факты, как усиление отрицательными аэроионами двигательной активности мерцательного эпителия клеток дыхательного тракта (Krueger, Smith, 1959), стимулирующее действие этих частиц на процессы заживления ран (Портнов, Пуце, 1976) и известное из санитарно-гигиенических работ уменьшение титра микроорганизмов в искусственно ионизированном воздухе (Минх, 1974). В то же время, в свете развиваемых нами представлений, большинство из известных результатов этих и других исследований могут найти объяснение свободнорадикальной природой супероксида, как основного биологически активного фактора отрицательных аэроионов. Этот вопрос, однако, не нашел в научной литературе достаточного отражения. Единственная известная нам работа в этой области вышла из лаборатории Krueger (Kellogg, 1979). Ниже приведены основные результаты проведенных нами исследований биологической активности экзогенного супероксида на клеточном и тканевом уровнях.

Влияние на хемотаксис перитонеалъных макрофагов. Подвижность лейкоцитов периферической крови, обусловленная хемотаксисом и миграцией к очагам тканевой деструкции, является составляющей компонентой общей системы реактивности организма (Белокриницкий, 1987). Продукты перекисного окисления липидов способны выступать в качестве как стимуляторов, так и ингибиторов клеточных реакций, в том числе хемотаксиса лейкоцитов (Kitagava, Takaku, 1981; Elstner, 1990). Так, пероксид водорода в относительно высоких концентрациях (0,7 мМ) ингибирует миграцию и пролиферацию кератиноцитов человека (О'Toole et al., 1996). Как стимуляция, так и ингибирование подвижности лейкоцитов дополняют комплекс физиологических реакций воспаления и заживления ран. Действие супероксида газовой фазы как потенциального регулятора хемотаксиса лейкоцитов in vitro в литературе описано не было. Известно, однако, что в ряде случаев наблюдалось ускорение заживления кожных ран после их обработки отрицательными аэроионами (Портнов, Пуце, 1976).

Электрохимическая ячейка для генерации супероксида (см. рис. 2) оказалась удобным инструментом для изучения влияния газообразного супероксида на лейкоцитарный хемотаксис по методу, описанному в работе Boyden (1962). Перитонеальные макрофаги мышей (2−106 клеток мл" 1) ресуспендировали в среде, состоящей из 90% среды Хенкса и 10% сыворотки и помещали в нижнюю полость42ячейки (10), а газообразный супероксид генерировали в верхней полости (6), отделенной микропористым фильтром (8) &bdquo-МИНроге" 8МУР 1 300 с размером пор 8 мкм. После инкубации, фиксирования и окрашивания (Меньшиков, 1987) подсчитывали число клеток, мигрировавших из суспензии на верхнюю поверхность фильтра. Была обнаружена двухфазная реакция клеток. В течение первой фазы (9,2 ± 0,3 мин) наблюдался положительный хемотаксис в направлении источника супероксида. Во второй фазе (9,5 ± 0,7 мин) клетки, проникшие на верхнюю сторону фильтра, мигрировали обратно в суспензию, проявляя тем самым хемофобную реакцию. Наслоение на верхнюю сторону фильтра раствора СОД на любом этапе первой фазы хемотаксиса прерывало реакцию и обращало направление хемотаксиса.

Введение

в исходную среду каталазы предотвращало обращение хемотаксисанеионизированный кислород незначительно влиял на хемотаксис макрофагов (рис.

Таким образом, нами было впервые обнаружено действие газообразного супероксида как лейкоцитарного хемоаттрактанта. По аналогии с данными, приведенными выше, и с учетом изменений клеточной реакции в присутствии СОД и каталазы, можно предположить, что обращение хемотаксиса (хемофобная реакция) связано с неспецифическим повреждающим действием пероксида водорода как13).

500 -¦продукта дисмутации супероксида. Эти результаты и выводы находятся в соответствии с данными о стимулирующем подвижность клеток сперматозоидов действии низких концентраций супероксида (de Lamirande et al., 1997) и угнетении этих реакций пероксидом водорода (O'Toole et al., 1996).

Влияние на заживление ран в эксперименте. Экспериментальной моделью, объединяющей местную реакцию тканей, лейкоцитарные реакции in situ и бактериостатическое действие форм активированного кислорода, может служить заживление экспериментальных ран (Knighton et al., 1986). Хорошо известно, что процесс заживления ран включает эксудативную, пролиферативную и репаративную фазы, и что с этими фазами коррелируют пики потребления кислорода в участке повреждения (Knighton et al., 1984). Одной из важных функций кислорода является т.н. &bdquo-очищающая", связанная с дезинфекцией раневой поверхности и позволившая сформулировать роль кислорода как неорганического &bdquo-антибиотика". Известно также, что бактериостатическое действие кислорода в значительной мере обусловлено продукцией активированных кислородных интермедиатов лейкоцитами (Babior et al., 1973; Elstner, 1990). С другой стороны, значительная часть потребляемого раневой поверхностью кислорода расходуется на интенсификацию процесса образования элементов соединительной ткани, а именно гликопротеинов в экссудативной фазе и протеогликанов и коллагена — в более поздней репаративной фазе (Elstner, 1990). Взятые вместе, эти факты позволяют заключить, что воздействие экзогенных окислителей в нетоксичных дозах способствует ускорению процесса заживления ран (Murrell et al., 1990).

В исследовании на крысах нами было показано, что 30-минутная обработка экспериментальной раневой поверхности экзогенным супероксидом не влияет на экссудативную фазу процесса заживления, ускоряет на 18% (тенденция) пролиферативную и на 48% (р < 0,05) репаративную фазы заживления по сравнению с нейтральным кислородом. Одновременно было отмечено возрастание прочности соединительной ткани, определяемой по отрыву имплантированного в рану платинового кольца. Эти изменения происходили на фоне уменьшения показателя микробной обсемененности раны. Так, на 5-е сутки эксперимента на стерильных оттисках с поверхности ран было обнаружено 12,5 ± 4,6 микробных тел. см" после обработки раны потоком супероксида против 258,2 ±62,1 у животных, обработанных кислородом (р < 0,001). В обсуждении этих данных мы высказали предположение, что помимо активации лейкоцитарных реакций и образования угнетающего размножение бактерий пероксида водорода, супероксид мог играть роль фактора44активации регуляторного гена «oxyR» фибробластов (Christman et al., 1989), стимулируя, таким образом, коллагенообразование и процессы пролиферации. Позднее эффективность терапии экзогенным супероксидом долгонезаживающих ран на культе после ампутации нижней конечности была продемонстрирована нами у 6 больных.

Влияние на клетки APUD-системы. APUD-система привлекла наше внимание в связи с положительными результатами лечебного применения ингаляций газообразного супероксида у больных бронхиальной астмой, а также в связи с ранее опубликованными работами (Krueger, Smith, 1959; Krueger et al., 1962), где авторы в исследованиях in situ на тканях дыхательного тракта животных объяснили механизм действия отрицательных аэроионов влиянием последних на обмен серотонина (Krueger, Sigel, 1981). В настоящее время известно, что APUD-система играет важную, хотя и недостаточно полно исследованную роль в приспособительных реакциях организма. Специфическими функциями клеток APUD-системы являются поглощение предшественников, синтез, накопление и декарбоксилирование биогенных аминов, в том числе серотонина (Райхлин и др., 1983), окислительное деаминирование которых вне APUD-клеток может сопровождаться повышением уровня эндогенного окислительного стресса. В этих же структурах происходит выработка пептидных гормонов (Яглов, Ломоносова, 1985), участвующих в поддержании и регуляции тонуса гладкой мускулатуры трахео-бронхиального тракта и проницаемости сосудистой стенки (Кветной, 1981).

В экспериментах на крысах в условиях хронического 30-дневного воздействия по 60 мин в день экзогенным Ог*- было обнаружено увеличение числа и насыщенности гранулами секрета APUD-клеток тканей трахео-бронхиального тракта, соответственно, в 2,4 и 2,6 раза, в обоих случаях р < 0,01 к контролю (таблица 2).

Эти данные свидетельствуют о возможной элиминации из регионального кровотока медиаторов воспаления (например, таких, как серотонин и/или гистамин) и локального уменьшения окислительного стресса, расширяя тем самым круг адаптивных реакций, вовлеченных в механизмы лечебного действия экзогенного супероксида у больных бронхиальной астмой (см. ниже). Поскольку в силу наличия электрического заряда и короткого времени жизни проникновение анион-радикала 0-{ в глубокие отделы трахео-бронхиального тракта представляется маловероятным, полученные результаты могут быть объяснены локальными клеточными реакциямина пероксид водорода, образующийся в результате дисмутации супероксида в насыщенной парами воды атмосфере вдыхаемого воздуха.

Таблица 2. Влияние субхронических ингаляций газообразного супероксида на изменение числа и насыщенности гранулами секрета АРШ)-клеток трахео-бронхиального тракта крыс. В каждой группе п = 6- М ± т.

Группа животных Количество APUD-клеток в мм2 ткани Индекс насыщенности гранулами секрета (1) Контроль 0,26 ± 0,03 16,5 ± 2,2Р (1) vs. (2) <0,05 <0,05(2) Супероксид 0,63 ± 0,08 43,2 ± 8,4Образование пероксида водорода можно было бы предположить также в упомянутой работе (Kellogg et al., 1979), в связи с чем не вполне понятно описанное авторами уменьшение токсического действия отрицательных аэроионов при добавлении СОД. Образованием низких концентраций пероксида водорода можно также непротиворечиво объяснить, в частности, известные из данных литературы реакции клеток бронхиального дерева и легких на ингалируемые отрицательные аэроионы, в частности, неоднократно описанное явление стимуляции отрицательными аэроионами двигательной активности мерцательного эпителия бронхов, что способствует выведению слизи (Krueger, Smith, 1958; 1959). Известно, например, стимулирующее активность двигательного аппарата клеток действие низких (<10 мкМ) концентраций пероксида водорода, наблюдаемое у физиологически полноценных сперматозоидов (Маньковская, Серебровская, 1998). Аналогичные наблюдения были сделаны нами в предварительных исследованиях активности мерцательного эпителия препарата бронхов быка при воздействии продуктами ксантиноксидазной реакции. Рассмотренные под таким углом зрения, описанные в этой части работы результаты наших исследований могут служить дополнительными доказательствами идентичности основного биологически активного фактора отрицательных аэроионов с анион-радикалом супероксида, образование которого в пуле продуктов отрицательной ионизации кислорода было нами продемонстрировано выше.

П. 2.4. МОДИФИКАЦИЯ АКТИВИРОВАННЫМИ ФОРМАМИ КИСЛОРОДА ПОРОГОВ РЕАГИРОВАНИЯ СЕНСОРНЫХ СИСТЕММодификация временного порога восприятия запаха. Химические раздражители органов чувств могут оказывать стимулирующее или транквилизирующее влияние на организм, воздействуя тем самым на процессы регуляции интегративного поведения, при этом, например, существующая прямая анатомическая связь рецепторов обонятельной системы с гипоталамической областью и с лимбической системой обусловливает формирование эмоционального и вегетативного компонентов реакции на эти раздражители^аиЬН, 1987). Нами было обнаружено модифицирующее влияние экзогенного супероксида на временной порог восприятия запаха. В качестве интегрального ответа на ингалируемый экзогенный супероксид регистрировали изменения пространственной синхронизации биопотенциалов ЭЭГ у индивидов с различными типами полушарного реагирования после предъявления обонятельных раздражителей.

В группах из клинически здоровых профессиональных дегустаторов запахов и неспециалистов (20 и 73 испытуемых) по характеристикам пространственной синхронизации биопотенциалов мозга (изменение показателей а-индекса в ЭЭГ, коэффициента корреляции первой производной ЭЭГ, величины постоянного потенциала мозга в каждом полушарии при нагрузках, преимущественно адресованных либо левой, либо правой гемисферам), были отобраны «правополушарные» и «левополушарные» индивиды. Уровни конституционально-личностной тревожности и актуальной реактивной тревоги определяли по методике, описанной в работе Ханина (1978) — границы высокого и низкого уровней оценивались величиной 40 баллов.

Нами было установлено, что у дегустаторов-профессионалов реакция в правом полушарии на предпочитаемый запах и в левом полушарии на отвергаемый запах (в зависимости от типа полушарного реагирования) проявляется сразу после предъявления раздражителей, тогда как у неспециалистов эти реакции проявляются лишь на 3-й минуте воздействия.

Таким образом было обнаружено существование исходно низких временных порогов восприятия запахов у профессиональных дегустаторов. После 15-минутной ингаляции экзогенного супероксида различия между группами исчезли, при этом появление ЭЭГ-ответов у неспециалистов возникало уже на первой минуте подачи запахового раздражителя. Поскольку у дегустаторов-профессионалов существенных изменений выявлено не было, был сделан вывод о понижении временного порога47восприятия запаха у испытуемых-неспециалистов под влиянием ингаляций экзогенного супероксида.

Уменьшение порогов восприятия вкуса. Принято считать, что отрицательные аэроионы при локальном действии in situ способны модулировать скорость обмена серотонина, как это было показано на препаратах трахеи кролика и пищевода лягушки (Krueger, Sigel, 1981). Известно также, что вкусовые почки позвоночных содержат популяцию серотонинсодержащих клеток, выполняющих трофическую функцию (Есаков и др., 1976). Предполагается, что контролируемые субстанцией Р реакции высвобождения и обратного захвата серотонина вовлечены в процессы синаптической передачи возбуждения в структурах вкусовой почки (Соловьева, Есаков, 1984).

Модификация активированными формами кислорода чувствительности хеморецепторных структур была продемонстрирована нами в исследовании порогов восприятия вкусовых модальностей при раздражении вкусовых хеморецепторов. В экспериментах на 18 добровольцах, проведенных по двойной слепой схеме, изучали влияние 10-минутной локальной аппликации экзогенного супероксида или кислорода (контроль) на изменение порогов чувствительности рецепторов сладкого, кислого и соленого вкуса при нанесении адекватных раздражителей на области преимущественной вкусовой чувствительности языка. Установленные предварительно пороги чувствительности составляли 10,3 ±1,3 мМ для сахарозы, 2,3 ± 0,7 мМ для лимонной кислоты и 9,4 ± 2,1 мМ для NaCl. Было обнаружено понижение порогов вкусового восприятия, соответственно, на 185 ± 39%, 101 ± 7% и 101 ± 9% (во всех случаях р < 0,01 к индивидуальному контролю). У части испытуемых эксперимент был повторен с использованием в качестве источника супероксида ксантин-ксантиноксидазной смеси, применяемой для генерирования супероксида in vitro. Здесь было также обнаружено понижение порогов восприятия NaCl и лимонной кислоты на 76,9 ± 8,7% и 155,5 ± 26,6% (таблица 3).

Полученные результаты свидетельствуют о влиянии локальных аппликаций супероксид-содержащих смесей на понижение порога чувствительности вкусовых рецепторов языка. Поскольку во всех случаях применялось местное воздействие супероксида, в реализации описанных эффектов может участвовать не только собственно супероксид, но и продукт его дисмутации — пероксид водорода.

Таблица 3. Влияние локальных аппликаций супероксид-содержащих смесей на понижение порогов различения в процентах к исходному индивидуальному порогу при предъявлении раздражителей рецепторов сладкого, соленого и кислого вкуса, М±ш.

Воздействие Раздражитель Сахароза Лимонная кислота NaClКислород (контроль) (п = 18) 4,7 ± 3,6 (-) 9,4 + 4,1 (-) Ю, 1 ±-4,4Экзогенный супероксид (п = 18) (-) 185,2 + 38,8**) (-) 101,2 ±8,6**) (-) 100,7 ±-6,7**)Ксантинксантиноксидазная смесь (п = 8) (-) 9,4 ±4,4 (-) 76,9 ±8,7**) (-) 155,5 ±-26,6**)Отрицательно ионизированный азот (п = 18) (-) 50,6 + 30,2*) (-) 52,5 ±6,4**) (-) 28,5 ±-6,4*)Обозначения: *) означает р < 0,05 и **) р < 0,01 по отношению к индивидуальному контролю.

Таким образом, нами была продемонстрирована принципиальная возможность модуляции порога чувствительности рецепторов химического чувства изученными активированными формами кислорода. Эти продукты могут также модифицировать тканевой метаболизм серотонина и/или активность субстанция-Р-зависимую систему, оказывающую трофические влияния на чувствительные нейроны вкусового аппарата.

Стимуляция рецепторного аппарата слизистой оболочки носовой полости и усиление антиноцицептивного (болеутоляющего) действия анальгетиков. Роль специфических химических свойств активированных форм кислорода в модификации чувствительности сенсорных нейронов была продемонстрирована также в условиях стимуляции рецепторов слизистой оболочки носовой полости газообразным супероксидом и пероксидом водорода. В постановке этих экспериментов мы основывались на впервые обнаруженном нами эффекте усиления (потенцирования) супероксидом болеутоляющего действия анальгетиков (Goldstein, 1996: Pat. DE 195 14 522- Goldstein et al., 1996; 1997). Особый интерес представляло проследить изменение тех физиологических реакций организма, в реализации которых принимают участие структуры ЦНС, анатомически и функционально тесно связанные с рецепторами слизистой оболочки носовой полости одной стороны, и с центрами вегетативной нейроэндокринной регуляции — с другой. Последние вовлечены также впроцесс восприятия боли, участвуя в формировании различных модальностей ноцицептивных ответов животных и человека.

Определенное влияние на выбор модели исследования оказали также противоречивые данные литературы в вопросе о роли отрицательных аэроионов в процессах ноцицепции. Известны лишь единичные работы, из которых можно почерпнуть информацию о возможном влиянии отрицательных аэроионов на восприятие боли и механизмы ноцицепции. В ранних наблюдениях, сделанных еще в 60-е годы, наряду с седативным действием отрицательных аэроионов, было описано также уменьшение &bdquo-физиологического дискомфорта", связанного у больных с послеоперационными болями и, судя по описанию авторов, обусловленное ингаляциями отрицательных аэроионов на фоне предшествовавшего приема анальгетиков (David et al., 1960; David et al., 1962; Minehart et al., 1961). В этих работах, однако, взаимосвязь между лекарственной терапией боли и ингаляцией аэроионов, не рассматривалась. С другой стороны, известны работы, в которых наблюдались стимуляция отрицательными аэроионами активности надпочечников у животных (Olivereau, 1976), а также повышение уровня кортизола в плазме крови у человека в результате повторных ингаляций супероксида (Mose et al., 1976). Было также показано, что отрицательные аэроионы способны, в зависимости от уровня и качества искусственно созданного стресса, влиять на концентрацию серотонина и цАМФ в соматосенсорной области коры мозга у крыс (Diamond et al., 1980). Эти факты, а также наши данные о почти двукратном увеличении числа АКТГпродуцирующих клеток в аденогипофизе после ингаляций экзогенного супероксида крыс, позволили предположить возможность активации продукции про-опиомеланокортина в ответ на действие кислородных интермедиатов и вовлечение в ответную реакцию эндогенного ß—эндорфина.

В описанных ниже исследованиях в качестве моделей использовали болевую реакцию, вызванную субплантарным введением крысам 50 мкл 3%-ного раствора формалина (Dubuisson, Dennis, 1977; Dennis, Melzack, 1980; Abbott et al., 1995). Для фармакологического обезболивания был применен наркотический анальгетик омнопон. В первой серии опытов было выявлен потенцирующий анальгетическую активность омнопона эффект экзогенного супероксида (рис. 14).я я2 70сЯаев" 50о, а <�ичо ю"л, но О В Лчн £ч о ч о аа60 40 3020 10 О л. I-1 11"-1 I-1.ч-г-гО 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1,6 1.8 2.0Доза омнопона, мг/кгРис. 14. Потенцирование газообразным супероксидом омнопон — зависимой антиноцицепции в формалиновом тесте у крыс.

Дозы омнопона: 0,06 — 2,0 мг/кгв каждой точке п = 6. 1-омнопон- 2 — супероксид + омнопон- *) р < 0.05- **) р < 0.01Учитывая, что в условиях этих экспериментов имело место локальное взаимодействие супероксида с рецепторными структурами слизистой оболочки носовой полости, примененная модель могла способствовать выяснению вопроса о роли свободнорадикальной природы анион-радикала кислорода в обнаруженном эффекте. При этом исчезновение эффекта в результате элиминации 02* в реакции ферментативной дисмутации в присутствии СОД могло свидетельствовать в пользу свободнорадикальной природы механизма активации рецепторов носовой полости, участвующих в формировании антиноцицептивных ответов. Усиление физиологического эффекта могло бы служить свидетельством того, что действующим агентом выступает пероксид водорода как первый относительно стабильный продукт дисмутации супероксида. В исследованиях на крысах с применением омнопона было показано, что сочетание ингаляции 0' с эндоназальной аппликацией СОД действительно усиливает анальгетическое действие омнопона. Взаимосвязь этогоэффекта с ферментативной дисмутацией Ог* была подтверждена при замене Ог на пероксид водорода. Эндоназальные аппликации растворов пероксида водорода в сочетании с омнопоном вызывали идентичный эффект, закономерно исчезавший при эндоназальной аппликации каталитических количеств каталазы (рис. 15).(0) Контроль С71,1±6,9(1) Омнопон (2) Супероксид+омнопон4.5±2.1|12,5±4,1(3)СОД+супероксид+омнопон (4) Н202+омнопон (5) Кат.+Н202+омнопон2.2±1,82,1±1,812,7±3,0щММщШШШШЁШШШПродолжительность болевой реакции, минРис. 15. Модулируемое СОД и каталазой усиление супероксидом и пероксидом водорода анальгетических эффектов омнопона у крыс.

Формалиновый тестскорость генерации О2*: 0,2 мкМмин" 1- ингал.: 60 миномнопон: 0,125 мг/кг, в/брН202: [2*10″ 5 М], 2*25 мклСОД: 100 ед/мг белка, 2*25 мклкаталаза: 50 ед/мг белка, 2*25 мкл.

В контроле п = 12, в остальных группах п = 7- p (i vs. 2,3,4) < 0,05.

Таким образом, в этих исследованиях с применением in vivo методов ингибиторного анализа было показано, что физиологические эффекты, развивающиеся в ответ на эндоназальную аппликацию супероксида газовой фазы, обусловлены свободнорадикальной химической активностью ион-радикала Ог" - и взаимодействием последнего со слизистой оболочкой носовой полости. Из данных литературы известно, что у высокоорганизованных животных в основе разнообразных физиологических и биохимических реакций на действие отрицательных аэроионов может быть вовлечение в ответные реакции организма центров нейрогуморальной регуляции — гипоталамуса и гипофиза (Wasilewski et al., 1955; Gualtierotti, 1968; Olivereau, Bousquet, 1974; Olivereau, 1976). Известно также, что афферентные входы гипоталамуса анатомически и функционально тесно связаны с рецепторами слизистой оболочки носовой полости (Mendoza, 1989; Trotier et al., 1996). С другой стороны, ядра гипоталамуса тесно связаны с подкорковыми структурами мозга (мезолимбическая система, область52базальных ганглиев, гипофиз), участвующими в сложном комплексе нейро-гуморальных реакций, участвующих в формировании различных модальностей ноцицептивных ответов животных и в восприятии боли у человека (Mitchell, Gratton, 1992; Halpern, 1987). Физиологические аспекты потенцирования антиноцицептивного действия различных анальгетиков будут описаны в разделе IV.

В целом, нами была продемонстрирована принципиальная возможность модуляции супероксидом порога чувствительности рецепторов (вкусовые рецепторы) и порогов восприятия специфических (запах) и неспецифических (боль) раздражителей. Эти данные согласуются с развивающимися в последние годы представлениями о роли клеточного редокс статуса и активированных кислородных интермедиатов в процессах передачи сигнала на клеточном уровне. Показано, что стимулирующее действие форм активированного кислорода связано с Са2±сигнальной системой клетки (Suzuki et al., 1997) и что эти оксиданты вовлечены в такие клеточные процессы, как стимуляция экспрессии генов (Ramasarma, 1990), функционирование кальциевого насоса, проницаемость мембран, стимуляция аденилатциклазы и ингибирование фосфодиэстераз (Siflinger-Birnboim et al., 1992, 1996; Seeger et al., 1995). Следует также отметить, что супероксид и пероксид водорода способны влиять на текучесть мембран (Yamaoka et al., 1992) и электрическое сопротивление (Olesen, 1987) мембранных структур, неспецифически модифицируя проницаемость и, возможно, взаимодействие рецепторов мембран со специфическими лигандами и чувствительность к внеклеточным сигналам. Аппроксимируя эти результаты на эндоназальные аппликации экзогенного супероксида и пероксида водорода, правомерно предположить неспецифическую стимуляцию формами активированного кислорода хеморецепторов слизистой оболочки носовой полости. Последующие физиологические реакции будут зависеть как от типа рецепторных структур (обонятельный эпителий, рецепторы вомероназального органа, окончания тройничного нерва), так и от вовлеченных представительств в структурах головного мозга.II.2.5. ОБЩЕФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ДЕЙСТВИЯ АКТИВИРОВАННЫХ ФОРМ КИСЛОРОДАСпектр физиологического и биохимического действия аэроионов, очень широкий для высокоорганизованных животных, включает ответные реакции со стороны высшей нервной деятельности, регуляторное влияние на вегетативные реакции и процессы метаболизма. Одно из первых наблюдений стимулирующего двигательную активность животных действия отрицательных аэроионов принадлежит Herrington (1935). Okada (1938) наблюдал вызванные ингаляцией отрицательных аэроионов ускорение метаболизма молочной кислоты после выполнения мышечной работы и повышение уровня глюкозы в крови. Положительно заряженные аэроионы приводили к противоположным изменениям. В экспериментах на кроликах с анемизированной задней конечностью однократная ингаляция отрицательных аэроионов изменяла вобудимость этого нервно-мышечного препарата in situ (Благодатова, 1959). Автор сообщает о стабилизирующем влиянии отрицательных аэроионов на возбудимость нервно-мышечного препарата как при повышенном, так и при пониженном исходном уровне этого показателя. Подобные эффекты «нормализации» отрицательными аэроионами нарушенных или измененных функций описаны неоднократно. Pay дам и др. (1966) отмечают укорочение хронаксии и увеличение силы мышц у больных с выраженными нейротрофическими расстройствами конечностей после воздействия отрицательными аэроионами. Укорочение хронаксии, а также лучшую адаптацию к гипоксии у добровольцев и повышенную выживаемость животных в гипоксической среде после ингаляции отрицательных гидроаэроионов описывает Зун (1966). Значительная часть реакций целостного организма на воздействие аэроионами реализуется на уровне ЦНС. Овчарова (1966) в исследованиях секреторно — пищевых условных рефлексов у собак установила повышение возбудимости коры и значительное углубление внутреннего (дифференциального) торможения. После 15 сеансов ингаляции отрицательных аэроионов эти реакции сменялись угнетением условнорефлекторной деятельности, однако возбудимость подкорковых центров оставалась повышенной. Отмечено было также повышение функциональной лабильности подкорковых образований.

С другой стороны известно, что основной областью, где реализуется первичное взаимодействие аэроионов с организмом млекопитающих животных, являются органы дыхательной системы, при этом первичное взаимодействие с рецепторным аппаратом возможно уже на уровне слизистой оболочки носовой полости. Кратко обобщая немногочисленные работы в этой области (Финогенов, 1961; 1962;Скоробогатова, 1962; Шандала h Трегубова, 1968) можно отметить, что ингаляция биполярной смеси аэроионов не вызывает выраженных изменений в электрограмме обонятельной луковицы. При воздействии униполярно ионизированного воздуха была отмечена фазность реакции проекций обонятельных рецепторов: в первые минуты возрастала амплитуда как спонтанных медленных колебаний, так и «вспышек» быстрых потенциалов, после чего амплитуда значительно уменьшалась с одновременным изменением рисунка электрической активности. Таким образом, имело место такое же снижение возбудимости рецепторов, которое в целом характерно для ответа на химические и механические раздражители. Поскольку одинаковая динамика была отмечена при ингаляции как положительных, так и отрицательных аэроионов, был сделан вывод об отсутствии специфичности в рецепции аэроионов обонятельным эпителием. Существенно однако, что аналогичные изменения электрической активности в виде «вспышек» были зарегистрированы также в ольфакторно-гипоталамическом тракте, гипоталамусе и коре (Бут, 1966; Минх и др., 1975). Реакции этих отделов ЦНС могут служить материальным субстратом для развития дальнейших рефлекторных нервных, нейроэндокринных и иммунных реакций, а также изменений в обмене веществ (Васильев, 1953 и 1960; Маслова, 1951).

Неоднократно было также показано, что ингаляция отрицательных аэроионов сопровождается усилением окислительных процессов в организме. Основы для исследований окислительного метаболизма после воздействия аэроионами были заложены работами Чижевскогоодна из первых была опубликована в 1922 году (Чижевский, 1922). Дубинский (1939) обнаружил повышение на 50% интенсивности окислительных процессов в кишечной стенке после ингаляции отрицательных аэроионов. Nielsen и Harper (1954) описали влияние ингаляций отрицательных аэроионов на повышение активности ферментов дыхательного ансамбля клеток. В ряде сообщений, вышедших из лаборатории Krueger, были приведены данные об активации отрицательными аэроионами окислительного метаболизма и ускорении превращения сукцината в фумарат in vitro (Krueger, Smith, 1958, 1960). Ряд авторов придерживается мнения, что стимуляция окислительных процессов, обусловленная действием отрицательных аэроионов, может быть связана с повышением активности желез внутренней секреции (Штамберг, 1955; Раудам и др., 1966; Wasilewski et al., 1955; Gualtierotti, 1968; Olivereau, Bousquet, 1974). Было показано, что ингаляции отрицательно заряженных аэрозолей вызывают обратимые изменения в ядрах клеток фасцикулярной зоны коры надпочечников, где происходит синтез глюкокортикоидов.

Эти изменения авторы объясняют опосредованной реакцией, связанной с вовлечением гипофиза (Wasilewski et al., 1955). Gualtierotti, (1968) наблюдал вызванную ингаляциями средних доз отрицательных аэроионов стимуляцию продукции гормонов щитовидной железы, а также стимулирующее действие высоких доз на созревание сперматоцитов и фолликул в гонадах животных. Обобщая результаты этих и других аналогичных исследований и подчеркивая выраженные изменения в коре надпочечников как характерный ответ на действие отрицательных аэроионов, Olivereau и Bousquet (1974) объясняют эти эффекты активацией гипоталамо-гипофизарной системы. Более поздние обзоры исследований биологической активности аэроионов были сделаны Минхом (1976), Портновым (1976), Olivereau (1976), Jaskowski (1985), Krueger, Siegel (1981), Charry (1984, 1987), Kroling (1985), Reiter (1992). В последних трех критических обзорах основной акцент сделан на противоречиях в полученных различными авторами результатах и их трактовке. Известные противоречия в оценке влияния аэроионов на физиологические, включая мотивационно-поведенческие реакции, связаны, в первую очередь, с различиями в условиях экспериментов: видов животных, способов генерирования и доз аэроионов, длительности воздействия и сроков исследования эффектов. В особенности это касается исследований вовлеченных структур ЦНС, эндокринных желез и общей реактивности животных (Bachman et al., 1966; Gilbert, 1973), спонтанной двигательной активности (Olivereau, Aimar, 1977; Olivereau, Lambert, 1981), работоспособности (Duffee, Koontz, 1965). Авторы критических обзоров приходят к выводу, что на основании имеющихся на момент публикации данных нельзя сделать однозначный вывод о биологической активности аэроионов.

Сообщения об исследованиях общебиологического и физиологического действия эндоназальных аппликаций экзогенного супероксида и низкодозированного пероксида водорода в общедоступной литературе отсутствуют. Приступая к комплексному изучению разнообразных биологических, в том числе физиологических и биохимических реакций животных на действие этих активированных форм кислорода при их эндоназальной аппликации, мы исходили из предположения о возможном сходстве реакций, вызываемых этими продуктами, с физиологическими ответами на воздействие отрицательных аэроионов. Сопоставление физиологических реакций на воздействие экзогенного супероксида и отрицательных аэроионов представляло основную задачу большинства описанных в этом разделе исследований. При постановке экспериментов мы сочли целесообразным преимущественное использование физиологических методов, одинаковых или идентичных по информативности и вовлеченным системам и структурам с теми, которые были использованы ранее другими авторами при исследовании биологических эффектов отрицательных аэроионов. В каждом конкретном эксперименте эти методы были дополнены наиболее адекватными для соответствующей задачи и доступными для нас биохимическими, морфологическими, цитологическими и другими исследованиями. а) Влияние экзогенного супероксида на ультраструктурные изменения в гипофизе, физиологические и биохимические показатели животныхВ цикле работ ОНуегеаи (1974;1976) было продемонстрировано вовлечение гипоталамических ядер в ответные реакции на ингаляции искусственных аэроионов. С целью дальнейшего сопоставления эффектов, вызванных действием отрицательных аэроионов и экзогенного супероксида, нами было предпринято электронно-микроскопическое исследование аденои нейрогипофиза крыс после повторных ингаляций экзогенного супероксида. В исследовании принимали участие Н. И. Гольдштейн (формулировка нуль-гипотезы, постановка задачи, участие в проведении экспериментов, обработке и обсуждении результатов), Т. В. Аршавская (электронно-микроскопическое исследование тканей, обсуждение результатов), О. Н. Константинова (проведение экспериментов, обсуждение результатов). Кроме электронно-микроскопического исследования, регистрировали также динамику изменений массы тела животных и весовые коэффициенты органов после 10 ингаляций супероксида, а также спустя последующие 10 суток. Эксперимент был проведен на 56 животных. Контрольные животные получали ингаляции неионизированного кислорода. Результаты исследования приведены на рисунках 16, 17 и в таблицах 4 и 5.

Рис. 16. Ультраструктура аденоцитов гипофиза крыс. Вверху: аденогипофиз животных после 10 ингаляций экзогенного супероксидавнизу: аденогипофиз контрольных животных.(Ос) — комплекс Гольджи- ^ег) — гранулярный эндоплазматический ретикулум- - секреторные гранулы.

Таблица 4. Влияние повторных ингаляций экзогенного супероксида на изменение процентного соотношения аденоцитов различных типов в аденогипофизе крыс. Количество ингаляций супероксида 10. Контрольные животные подвергались аналогичным ингаляциям кислорода, М ± т.

Группа животных ФЗ клетки Гранулярные клетки ДК СТГАКТГТТГ ФСГ- /лгJ111- (1) Супероксид (<�У) (п = 7) 2,1 ±0,6 22,0±3,1 18,2±3,2 31,1±5,1 14,3±2,2 3,9±0,9 8,4±-2,1—-?-0)к@ недост. недост. <0,01 тенд. <0,05 <0,01 <0,01(2) Контроль (02) (п = 7) 5,3±0,7 28,0±3,2 9,7±1,9 24,4±4,1 20,3±3,4 12,0±1,8 0,3±-0,1Обозначения: ФЗ клетки — фолликулярно-звездчатые клеткиДК — дегенерирующие клеткиСТГсоматотропин-продуцирующие клеткиАКТГклетки, продуцирующие адренокортикотропный гормонТТГклетки, продуцирующие тиреотропный гормонФСГ-/ЛГклетки, продуцирующие фолликулостимулирующий и лютеинизирующий гормоныЛТГклетки, продуцирующие лактотропный гормон, недост. — недостовернотенд. — тенденция.

Было показано, что ингаляция экзогенного супероксида вызывает у животных явления активации секреторных элементов аденогипофиза, преимущественно ответственных за выработку тропных гормонов. Наибольший интерес может представить активация адаптивных адренокортикотропного и тиреостимулирующего гормонов. Функциональное напряжение аденогипофиза нашло отражение также в умеренном увеличении количества дегенерирующих аденоцитов (таблица 4).

Явления функционального напряжения и активации транспорта и выведения в кровь нейрогормонов обнаружены также в нейрогипофизе (рисунок 17 и таблица 5).

Предпринятое гистологическое исследование тимуса и надпочечников выявило умеренную диффузную гиперплазию лимфоидной ткани вилочковой железы, а также умеренную гиперплазию коркового слоя надпочечников. В последнем случае наблюдалось также некоторое увеличение массы органа. Изменения весовых коэффициентов внутренних органов животных приведены в таблице 6.

Рис. 17. Ультраструктура нейрогипофиза крыс. Вверху: нейрогипофиз животных после 10 ингаляций экзогенного супероксидавнизу: нейрогипофиз контрольных животных.(асс), (аз) и (тБ) — нейросекреторные окончания гипоталамуса в нейрогипофизе, соответственно, в фазах накопления, активного и умеренного выведения нейросекрета.

Таблица 5. Влияние повторных ингаляций экзогенного супероксида на содержание нейросекреторных окончаний в разных фазах функционального цикла в нейрогипофизе крыс. Количество ингаляций супероксида 10. Контрольные животные подвергались аналогичным ингаляциям кислорода, М ± т.

Группа животных Фаза функционального цикла Накопление и депонирование нейросекрета Умеренное выведение нейросекрета Активное выведение нейросекрета Истощение (1) Супероксид (о2-) (п = 7) 6,3 ± 0,9 33,2 ±3,9 45,8 ±4,5 14,7 ± 1,9Р (1) к (2) <0,05 >0,1 >0,1 тенденция (2) Контроль (02) (п = 7) 12,0 ±2,4 41,3 ±5,5 37,7 ±4,9 9,0 ± 1,2Таблица 6. Весовые коэффициенты внутренних органов белых крыс после 10-кратных ежедневных 60-минутных ингаляций экзогенного супероксида. Контрольные животные подвергались аналогичным ингаляциям кислородап = 56, М ± т.

Орган Весовой коэффициент в контрольной группе Весовой коэффициент в опытной группеСердце 4,16 ±0,38 4,36 ±-0,41Легкие 7,91 ± 0,62 9,72 ± 1,28Печень 33,10 ± 2,12 34,2 ±-3,10Селезенка 2,41 ± 0,22 2,71 ±-0,31Почки 8,42 ± 0,67 8,24 ±-0,71Тимус 1,42 ±0,12 1,57 ± 0,12Надпочечники 0,29 ± 0,02 0,37 ±-0,03*)Обозначения: *) означает 0,05 < р < 0,1 по отношению к контролю (тенденция).

Таким образом, исследование продемонстрировало явления умеренной стрессорной реакции с вовлечением гипофиза и ядер гипоталамуса в функциональный ответ на действие экзогенного супероксида. Интенсивность индуцированного супероксидом функционального стресса может быть, повидимому, легко контролируемой уменьшением общей дозы (длительности, повторности, интенсивности) воздействия. Функциональная активация аденои нейрогипофиза в ответ на повторные ингаляции экзогенного супероксида, опосредованнаявовлечением рецепторов носовой полости, позволяет объяснить значительную часть эффектов супероксида и, повидимому, отрицательных аэроионов. В одной из последних публикаций Скоробогатова (1991) рассматривает облегчающий эффект отрицательных аэроионов на ЦНС как возможный механизм физиологического действия этих частиц. В этой связи особый интерес, на наш взгляд, может представить описанная в данной работе активация АКТГ — продукции. Облегчающее действие АКТГ на мотивационное поведение и спонтанную двигательную активность, обусловленное действием гормона на мозговые структуры, показано в ряде исследований (Северьянова, 1988; Биетаги е1 а1., 1985; Яеи1 е1 а1., 1990). При остром стрессе основную роль в стимуляции секреции АКТГ играет гипоталамический кортикотропин-рилизинг фактор, при этом катехоламинэргическая регуляция секреции в гипоталамусе осуществляется одним из метаболитов катехоламинов, но не норедраналином (КооЬ, 1999). АКТГиндуцируемая активация секреторных элементов коры надпочечников может также лежать в основе описанного в литературе адаптивного действия отрицательных аэроионов. Кроме того, поскольку известно, что кортикостероиды способны модифицировать чувствительность гипоталамических клеток к входящим сенсорным импульсам, активация гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы может иметь следствием увеличение амплитуты и укорочение латентных периодов вызванных ответов в гипоталамусе, как это было описано при стимуляции септума или седалищного нерва (Северьянова, 1988), и расценивались автором как результат снижения порогов синаптической передачи и вовлечения в ответ большего числа нейронов. Определенное подверждение этого приведено нами в различных частях данной работы. б) Влияние экзогенного супероксида на поведенческие реакции и динамику изменений суммационно-порогового показателяВ отдельных исследованиях влияния экзогенного супероксида на показатели поведенческой активности животных принимали участие Н. Гольдштейн (формулировка нуль-гипотезы и постановка задачи, проведение экспериментов и обсуждение результатов), О. Воскресенская, Н. Левитская, В. Дубинин, А. Хоменко, О. Константинова (планирование и проведение экспериментов, обработка и обсуждение результатов). Было показано, что в недифференцированной популяции интактных животных (мыши, крысы) наблюдаются лишь ограниченные изменения поведенческих реакций, вызванные ингаляциями экзогенного супероксида. Длядемонстрации ниже приводятся результаты исследования на половозрелых крысах Вистар (таблица 7).

Таблица 7. Влияние однократной 60-минутной ингаляции экзогенного супероксида на поведенческие реакции крыс, М ± т.

Тесты и параметры ИНГАЛЯЦИЯ КИСЛОРОДА (контроль, п = 30) ИНГАЛЯЦИЯ СУПЕРОКСИДА (п = 30) Открытое поле Горизонтальная двигательная активность 50,5 ±3,1 47,8 ± 3,6Вертикальная двигательная активность 9,9 ± 0,7#) 7,6 ± 0,8Отходы от стенки 1,7 ±0,2 1,9 ±-0,4Выходы в центр 0,7 ± 0,2 0,6 ± 0,2Груминг 1,7 ±0,3 1,4 ±-0,3Дефекации 1,7 ±0,3 1,8 ±-0,3Норковая камера Горизонтальная двигательная активность 19,7 ± 1,5 21,5 ± 1,1Вертикальная двигательная активность 6,4 ±0,5 6,8 ± 0,5Количество обследованных отверстий 11,4 ± 1,1 13,9 ± 1,1*Груминг 2,2 ± 0,3 2,6 ± 0,4Обозначения: *) = р < 0,05 к контролю-#) = р < 0,1 к контролю (тенденция).

Как видно из приведенной таблицы, значимые отличия между опытной и контрольной группами были отмечены только в тесте «норковая камера». Было также установлено, что данный эффект выражен в течение всего времени наблюдения и максимален (в процентном отношении) на последних 30 секундах наблюдения (38%). В более стрессогенном тесте «открытое поле» отличия между животными по большинству параметров практически отсутствовали. Возможно, супероксид даже несколько увеличивал тревожность животных, поскольку наблюдалась тенденция к снижению вертикальной активности (р < 0,1). Таким образом, при однократной ингаляции экзогенного супероксида только по одному из параметров поведенческого поведения было выявлено вызванное экзогенным супероксидом незначительное усиление ориентировочного рефлекса. В целом, эти результаты соответствуют установившимся взглядам, согласно которым физиологические ответы на воздействие отрицательными аэроионами проявляются преимущественно у животных, а также у человека, при наличии выраженных изменений гомеостаза, и не обнаруживаются или выявляются незначительно в условиях физиологической нормы.

В то же время известно, что рефлекторные реакции млекопитающих в значительной мере определяются функциональной лабильностью и типологическими особенностями нервной системы, и что поисковая активность, в частности, ориентировочно — исследовательская деятельность, могут служить критериями для выявления различий внутри популяции (Ротенберг, Аршавский, 1984; Северьянова, 1988). Действительно, в дальнейшем нами было показано, что в каждой популяции взятых в исследование животных наблюдается достаточно четкое распределение на типологические группы «активных», «пассивных» и «средних» особей. В таблице 8 в качестве примера приведены различия между животными, выявленные в популяции из более чем 300 самцов гибридных мышей СВА х С57&bdquo-1.

Таблица 8. Распределение популяции самцов гибридных мышей СВА х C57BI по показателю спонтанной двигательной активности (пробежки+стойки) в «открытом поле» за 3 минуты, М ± т.

Популяция в целом (п = 310) (1) «Активные» животные (п= 120) (2) «Пассивные» животные (п= 116) (3) «Средние» животные (п = 74) (4)58,1 ±4,3 74,1 ±4,1 39,6 ±4,7 60,1 ±-5,1Рр) и (з)(1) < 0.05- Р (2) и <0.01.

Аналогичные отличия были обнаружены также в тесте «норковый рефлекс». На основании этих различий животные были в дальнейшем отнесены, соответственно, к группам «активных», «пассивных» и «средних». Подавляющее большинство последующих исследований было проведено на животных первых двух типологических групп.

Повторные, один раз в сутки в течение 4-х дней 60-минутные ингаляции мышам экзогенного супероксида выявили достоверные различия в изменениях суммарной (пробежки + стойки) спонтанной активности «активных» и «пассивных» животных. Так, в отличие от «активных» животных, суммарная спонтанная двигательная активность которых снизилась на 72,9%, у «пассивных» животных с исходно более слабо выраженным ориентировочно-исследовательским поведением, реакция на этот раздражитель практически отсутствовала (таблица 9).

Таблица 9. Влияние 4-кратного ингаляционного воздействия экзогенным супероксидом на изменение суммарной (пробежки + стойки) спонтанной двигательной активности самцов гибридных мышей СВА х C57B1 в «открытом поле». Длительность тестирования в «открытом поле» 3 мин. Продолжительность каждой ингаляции 60 мин, М ± т.

Ингаляции экзогенного супероксида Ингаляции кислорода «Активные» животные (п = 30) «Пассивные» животные (п = 32) «Активные» животные (п = 19) «Пассивные» животные (п = 21) Суммарная двигательная активность Исходно После 4х ингаляций Исходно После 4х ингаляций Исходно После 4х ингаляций Исходно После 4х ингаляций53,2 ±3,7 38,8 ±3,1 *) Ни> Ul 32,0 ±3,2 51,8 ±3,9 49,5 ±3,3 36,1 ±3,2 35,6 ±-3,6Обозначения: *) означает р < 0,05 к исходному значению.

Другим методом интегральной оценки функционального состояния ЦНС является суммационно-пороговый показатель (СПП). Благодаря своей высокой чувствительности и относительной простоте исполнения, этот метод нашел широкое применение в практике отечественной токсикологии (Сперанский, 1974; 1975). Как было показано автором, СПП отражает одновременно два важных показателя возбудимости. Этими показателями являются лабильность нервных центров, которая в свою очередь влияет на способность к суммации импульсов при заданном постоянном интервале между ними, и порог болевого сгибательного рефлекса (Сперанский, 1975). Физиологической основой метода послужили представления физиологов школы Введенского — Ухтомского о существовании трехфазной реакции возбудимых тканей на раздражающий стимул, причем первая фаза — продромическое торможение — характеризуется повышением лабильности при одновременном увеличении порога. Эффект суммации импульсов выражается в том, что каждый подпороговый импульс оставляет после себя след повышенной возбудимости, сохраняющийся к моменту воздействия следующего импульса. Нарастание возбудимости продолжается до возникновения регистрируемой реакции (отдергивание лапы), являющейся ответом на сверхпороговый стимул. При действии факторов, повышающих лабильность ЦНС, к моменту действия очередного импульса след от предыдущего оказывается слабее, в результате чего возбудимость успевает больше приблизиться к исходному уровню. Даже при неизменной величине порогаэто приводит к увеличению СПП. При возрастании порога оба фактора действуют на СПП в одном направлении, что в значительной мере определяет высокую чувствительность метода и обусловливает значительные сдвиги показателя на самой ранней фазе воздействия испытуемым агентом.

Дальнейшие эксперименты были поставлены на половозрелых «активных» и «пассивных» мышах и крысах (всего -200 животных каждого вида). В отличие от ориентировочно-поведенческих реакций, исходные различия в значениях СПП у «активных» и у «пассивных» животных оказались незначительными. Так, у мышей этих двух субпопуляций величины СПП (в вольтах) составили, соответственно, 11,7 ± 3,2 и 10,1 ± 3,6. Для выявления влияния экзогенного супероксида, животных каждой группы подвергали однократной 60-минутной ингаляционной затравке супероксидом в потоке кислорода. Значения СПП измеряли по истечении 1-го часа, а также 24-х и 48-ми часов после окончания ингаляции. Как видно из таблицы 10 у «активных» животных наблюдалось значительное последействие: значения СПП продолжали возрастать, достигая максимальных значений через 24 часа после прекращения воздействия супероксидом. Реакция в «пассивной» группе отличается как своей значительно меньшей выраженностью, так и направленностью. У этих животных первоначальные изменения СПП, а также значения СПП в последующие двое суток были ниже исходных. В то же время, динамика изменений оказалась одинаковой у животных обеих субпопуляций, о чем свидетельствует тенденция к появлению максимума также у «пассивных» животных через 24 часа после прекращения воздействия.

Таблица 10. Влияние однократного 60-минутного воздействия экзогенным супероксидом на изменения суммационно — порогового показателя (СПП) у мышей. А — «активные», П — «пассивные», (М ± т).

Воздействие СПП, исходные данные Время после ингаляции 1 час 24 часа 48 часов, А П, А п, А п, А пИнгаляция экзогенного супероксида (п= 47) 11,2 ±3,2 11,5 ±3,5 12,2 ±3,5 10,6 ±3,0 16,8 ±3,6 *) 10,3 ±2,9 13,2 ±4,1 #) 9,5 ±-3,5Ингаляция кислорода (п = 45) 10,9 ±2,9 11,0 ±3,0 11,0 ±3,1 10,9 ±3,8 11,0 ±3,6 11,3 ±3,5 11,9 ±3,3 11,5 ±-2,7Обозначения: А — «активные», П — «пассивные» животные- *) означает р < 0,05 и #) означает 0, 05 < р < 0,1 к исходным значениям для данной группы (тенденция).

В условиях повторных воздействий экзогенным супероксидом в течение 4 дней по 60-минут ежедневно эти различия между реакциями животных обеих субпопуляций нивелируются (таблица 11).

Таблица 11. Влияние 4-кратного 60-минутного воздействия экзогенным супероксидом на изменения СПП у мышей, М ± т.

Воздействие СПП, исходные данные (вольт) СПП после 4-х кратного воздействия (вольт) «активные» «пассивные» «активные» «пассивные» Ингаляция экзогенного супероксида (п = 46) 10,7 ±3,1 10,5 ±2,7 14,8 ±3,7 *) 14,2 ±-3,4*)Ингаляция кислорода (п = 48) 10,8 ±3,3 10,9 ±3,4 9,8 ±2,9 10,1 ±-3,0Обозначения: *) означает р < 0,05 к исходным значениям для данной группы.

Принципиально аналогичные результаты были получены нами также в исследованиях на крысах (данные не приводятся). Таким образом, исследования поведенческих реакций и СПП у крыс и мышей показали, что эти показатели достаточно информативны для оценки реакций животных на воздействие экзогенным супероксидом. Было также показано, что выраженность реакций зависит от типологических особенностей особей. Реакция «активных» животных регистрируется сразу после окончания воздействия и выражается в устойчивом повышении СПП, отражая повышение функциональной лабильности ЦНС. Реакция «пассивных» животных характеризуется первоначально противоположной тенденцией. В недифференцированной популяции животных изменения поведенческих реакций на супероксид практически не выявляется. Этим могут быть объяснены существующие в литературе противоречия в вопросе о влиянии отрицательных аэроионов на поведенческие реакции животных. После повторных воздействий различия между животными обеих групп нивелируются за счет повышения лабильности «пассивных» животных.

Существующие до настоящего времени представления о механизмах взаимодействия аэроионов с организмом, ограничиваясь преимущественно рассмотрением роли заряда ионов при их взаимодействии с легочной тканью иповерхностью кожи (Чижевский, 1960; Скоробогатова и др., 1969; Минх и др., 1972; Скоробогатова, 1986), не позволяют объяснить многочисленные, в том числе полученные нами и описанные выше, результаты. Приступая к следующей части исследования, мы исходили из предположения, что объяснение разнообразных проявлений биологической активности аэроионов и экзогенного супероксида следует искать в их воздействии на регуляторные центры, которое может быть реализовано через рецепторные структуры носовой полости. В силу неустойчивости супероксида, а также высокой супероксидцисмутазной и каталазной активности слизистой оболочки носовой полости, экзогенный супероксид, а также образующийся в результате дисмутации последнего пероксид водорода, могут подвергатьтся бы строму ферментативному разрушению в полости носа, не проникая в региональную систему кровообращения мозга и, таким образом, не взаимодействуя непосредственно с нейронами внутри ЦНС. Это может свидетельствовать в пользу рефлекторного механизма реализации биологической активности экзогенного супероксида, осуществляемого в ответ на раздражение рецепторов носовой полости.

Как было показано выше, есть достаточно оснований считать, что первичным звеном в обработке афферентных сигналов от эндоназальных рецепторов являются ядра гипоталамуса, в связи с чем по крайней мере часть обнаруженных эффектов может найти объяснение вовлечением гипоталамо-гипофизарного комплекса. Принципиальная возможность влияния гормонов гипофиза на различные мотивационные системы и на поведение установлена в различных исследованиях (Ноздрачев, 1969; Корнеева и др., 1975; Северьянова, 1988; Бе К1ое1 й а1., 1991; На1а1з1а е1 а1., 1998). Реализация этих влияний через нейрогуморальные механизмы может найти, в частности, отражение в изменениях общего уровня активности животных (Ыуакаэ й а1., 1981; Северьянова, Плотников, 1986). Известно также, что реализация поведенческих реакций в значительной мере определяется облегчающим действием АКТГ (Ашмарин и др., 1978; Северьянова, 1988). В ряде исследований было показано, что этот эффект может быть вызван прямым действием гормона на мозговые структуры. Показано также, что АКТГ усиливает поведение избегания, повышая уровень мотивации (Северьянова, 1988).

Введение

интактным животным гидрокортизона облегчает процессы синаптической передачи, укорачивая латентный период, увеличивая амплитуду импульса в постганглионарных стволах, повышая лабильность и функциональную устойчивость ганглионарного аппарата. Приведенные в данной работе результаты исследований влияния ингаляции экзогенного супероксида на ультраструктуру аденои нейрогипофиза у крысподтверждают вовлечение гипофиза в нейрогуморальный ответ на экзогенный супероксид и свидетельствуют о возможной АКТГ-зависимой активации центральных нейрогуморальных механизмов. в) Влияние ингаляций активированных форм кислорода на потенцирование антиноцицептивных эффектов анальгетиковПредпосылками для проведения этих исследований послужили полученные нами ранее результаты, дающие общие представления о возможных структурах и процессах, вовлеченных в ответ на действие экзогенного супероксида и связанных с механизмами формирования ноцицептивной реакции. Первые попытки целенаправленного клинического применения отрицательных аэроионов в терапии боли были предприняты в 60-е годы (см. Kornblueh 1971), однако эти работы, как и в целом направление, не получили дальнейшего развития. Значительно позднее Beardwood и Jordi (1990) обнаружили противоположный эффект — ослабление отрицательными аэроионами антиноцицептивного действия морфина в тесте отдергивания хвоста (tail flick reflex) у крыс. В целом, однако, на основании данных литературы в настоящее время не представляется возможным дать объяснение немногочисленным и противоречивым данным о влиянии отрицательных аэроионов на центральные механизмы восприятия боли.

Следует отметить, что невыясненным остается также участие метаболического эндогенного супероксида, как и других реактивных форм кислорода, в функционировании периферического звена болевого анализатора. Предполагалось, что на тканевом уровне кислородные метаболиты, продуцируемые активированными лейкоцитами, могут способствовать образованию алкильных радикалов, усилению синтеза тромбоксана, брадикинина и простагландинов (Kimura, 1997; Jaeschke, 1995; Tracey, Walker, 1995). Неоднократно высказывались также предположения, что эти продукты могут быть вовлечены в развитие локальной гиперальгезии и воспалительных болей. В этой связи противовоспалительные нестероидные анальгетики рассматриваются как ингибиторы реактивных кислородных интермедиатов и синтеза простагландинов в периферическом звене боли. Однако в тщательно проведенных исследованиях было показано, что ни супероксид, ни такие продукты его превращений, как пероксид водорода и гидроксильный радикал, не играют специфической роли в сенситизации периферических рецепторов (Kress et al., 1995; Kimura, 1997). В то же время, имеется достаточно много свидетельств опосредования эндогенным супероксидом, продуктами его метаболизма иалкильными свободными радикалами процессов в ЦНС, вовлеченных в центральные механизмы формирования болевого ответа (Kress et ah, 1995).

Обобщая известные данные по этому вопросу и результаты описанных нами выше исследований, можно выделить несколько ключевых фактов и соображений, в частности: 1) эндоназальная аппликация отрицательных аэроионов имеет следствием седативный эффект, развивающийся с вовлечением центральных нервных и гуморальных механизмов- 2) ингаляция отрицательных аэроионов несколько уменьшает остаточные болевые ощущения у больных после операций, что в описанных в литературе случаях могло иметь место на фоне ранее введенных анальгетиков- 3) изменение моноаминоксидазной активности нервной ткани мозга после ингаляции отрицательных аэроионов свидетельствует в пользу вовлечения центральных серотонинэргических и катехоламинэргических механизмов, участвующих также в реализации ноцицептивной реакции- 4) облегчающее действие отрицательных аэроионов и экзогенного супероксида на процессы передачи нейросенсорной информации и реализацию условнои безусловно-рефлекторных реакций.

Взятые вместе, эти факты и соображения позволили нам предположить возможность модификации процессов переработки ноцицептивной информации и восприятия боли экзогенным супероксидом и/или пероксидом водорода. В свою очередь, вовлечение в эти процессы таких медиаторов центральной нервной системы, как серотонин и катехоламины, а также структур мозга, участвующих в формировании эмоционального (гипоталамус, мезолимбическая система) и ноцицептивного (базальные ганглии, ствол) ответов, может способствовать выяснению центральных механизмов действия супероксида и пероксида водорода при аппликации последних в область рецепторов слизистой оболочки носовой полости. С методической точки зрения, использование хорошо изученных экспериментальных моделей боли позволяет осуществить достаточно строгую количественную оценку физиологических ответов.

Всего нами было проведено в различных модификациях 12 независимых серий экспериментов на более, чем 500 животных (белые крысы), а также на белых мышах с применением общепринятых экспериментальных приемов — теста отдергивания лапы (Рандалл-Селитто-тест) как модели соматической боли, и теста с внутрибрюшинным введением раствора уксусной кислоты как модели висцеральной боли. Результаты основных из этих исследований приведены ниже. В работе принимали участие Н.

Гольдштейн (формулировка нуль-гипотезы и постановка задачи, планирование и проведение экспериментов, обработка и обсуждение результатов), А. Каменский, В. Дубинин, Н. Левитская, О. Воскресенская и О. Константинова (планирование и проведение экспериментов, обработка и обсуждение результатов), С. Бауманн (обсуждение результатов). Были использованы экзогенный супероксид (генераторы супероксида: SAR.TR.ON и медицинский ингалятор рго-тЬаГ), пероксид водорода, наркотические (омнопон, тримеперидин, морфин) и ненаркотические (анальгин, баралгин, диклофенак, аспирин) анальгетики, антагонист опиоидной анальгезии налоксон, необратимые ингибиторы МАО фенипразин (катрон) и ниаламид, а также супероксиддисмутаза и каталаза. Во всех случаях внутрибрюшинному введению анальгетика предшествовали 50 — 60 — минутные ингаляции экзогенного супероксида в потоке кислорода. Контрольные животные подвергались аналогичным процедурамвместо супероксида животные ингалировали неионизированный кислород.

Было показано, что ингалируемый супероксид потенцирует антиноцицептивное действие пороговых доз опиоидных анальгетиков тримеперидина и морфина в Рандалл-Селитто — тесте у крыс (рис. 18, 19). Ингибирование этих реакций ниаламидом и налоксоном могут свидетельствовать о вовлечении опиатных рецепторов и МАО — зависимых процессов (рис. 20, 21).

Анализ данных опытов с анальгетиком тримеперидином в Рандалл-Селитто тесте показал, что наблюдавшийся на 30-й минуте после инъекциии тримеперидина дозо-зависимый пик антиноцицепции обусловлен действием анальгетика, однако уже здесь выделяется потенцирующий эффект супероксида, явно различимый в сочетании с пороговой концентрацией тримеперидина (рис. 18). Пик, наблюдавшийся на 210-й минуте, был, очевидно, связан с максимальным проявлением потенцирующего эффекта, поскольку не наблюдался без обработки животных экзогенным супероксидом. Потенцирование тримеперидина, а также морфина в пороговой дозе развивается сразу после окончания ингаляции супероксида (рис. 18, 19).¦ Тримеперидин (5.0 мг/кг в/бр.- п=10)А Тримеперидин (2.0 мг/кг в/бр.- п=10)• Тримеперидин (1.0 мг/кг в/бр.- п=10)®Супероксид (ингаляция 50 мин., п=10)®Тримеперидин (1.0 мг/кг в/бр.- п=10) + Супероксид (ингал. 50 мин., п=16)0 30 60 90 120 150 180 210 240 270ВРЕМЯ (мин)Рис. 18. Потенцирование экзогенным супероксидом антиноцицептивного действия тримеперидина в пороговой дозе 1 мг/кг.

Рандалл — Селитто — тест, крысы. *) р < 0,05 к исходному уровню- **) р < 0,01 к исходному уровню. в Морфин (0.5 мг/кгв/бр.- п=10)О Морфин (0.5 мг/кг в/бр.) + супероксид (ингаляция 50 мин.- п=16)? Супероксид (ингаляция 50 мин.- п=12)ВРЕМЯ (мин)Рис. 19. Потенцирование экзогенным супероксидом антиноцицептивного действия морфина в пороговой дозе 0,5 мг/кг.

Рандалл — Селитто — тест, крысы. *) р < 0,05 к исходному уровню.• Налоксон (0,5 мг/кг., в/бр.)О Налоксон (0,5 мг/кг., В/бр.) + супероксид (ингал., 50 мин) II Налоксон (0,5 мг/кг., В/бр.) + морфин (0,5 мг/кг., В/бр.)? Налоксон (0,5 мг/кг., В/бр.) + морфин (0,5 мг/кг., В/бр.) + супероксид (ингал., 50 мин) А Морфин (0,5 мг/кг., В/бр.) + супероксид (ингал., 50 мин) иейи О Р< О 1=1О и о и а> Ч ОоЛ «о И50-, 403 020§- 100−10 -Iн 0—I-Г» 30 60¦ Инъекция (морфин)90 120 150Время (мин)180 210 240 270Рис. 20. Ингибирование налоксоном антиноцицепции, вызванной сочетанным действием морфина в пороговой дозе 0,5 мг/кг и экзогенного супероксида.

Рандалл — Селитто — тест, крысы. *) р < 0,05 к исходному уровню- **) р < 0,01 к исходному уровню.

Особенный интерес, на наш взгляд, может представить ингибирование ниаламидом супероксид-зависимого пика антиноцицепции (рис. 21). Аналогичный эффект уменьшения порога ноцицепции при исследовании супероксид-зависимого потенцирования омнопона в формалиновом тесте у крыс наблюдался при введении другого ингибитора МАО — катрона (фенипразина, рис. 21).

А Тримеперидин (1.0 мг/кг. В/бр.) + супероксид (ингал., 50 мин) (п=10)О Ниаламид (1.0 мг/кг. В/бр.) + супероксид (ингал., 50 мин) (п=10)? Тримеперидин (1.0 мг/кг. В/бр.) + ниаламид (1.0 мг/кг.) + супероксид (ингал., 50 мин) (п=10)I-1—1−1-1−1-1−1-1О 30 60 90 120 150 180 210 240 270ВРЕМЯ (мин)Рис. 21. Ингибирование ниаламид ом антиноцицепции, вызванной сочетанным действием тримеперидина и экзогенного супероксида.

Рандалл — Селитто — тест, крысы. *) р < 0,05 к исходному уровню- **) р < 0,01 к исходному уровню.

Эти результаты могут быть интерпретированы как доказательства активации ингалируемым супероксидом центральных МАО-зависимых механизмов перцепции боли, включая серотонинэргическую и/или катехоламинэргическую системы мозга. Мы обратили внимание также на наблюдавшееся в отдельных сериях экспериментов и вызванное ингаляцией супероксида понижение порога ноцицепции, на фоне которого проявлялся эффект потенцирования анальгетиков. Это явление было в дальнейшем отчетливо зарегистрировано в исследованиях на добровольцах. s2 fsa-а (0 фQ.>S О mф цоЮJ Ho01J ЦФ Isa4030201071,6 * 26 u I & 12,1 Ш— 4 14 Fl Bi t Ej ¦ г Г AJ/rvРис. 22 Уменьшение омнопон — зависимой антиноцицепции катроном и элиминация эффекта супероксидом.

Формалиновый тесткрысыдоза омнопона 0,75 мг/кг.- в каждой группе п = 6- &) = р 2″.1 < 0,01- *) = р з < 0,01- #) = р 4те.3 <0,01.

Как известно, результаты исследований на животных не всегда находят подтверждение в применении к человеку (Kilo et al., 1995). В этой связи нами было проведено плацебо-контролируемое исследование потенцирования супероксидом болеутоляющего действия низких (в 2 — 3 раза ниже терапевтических) доз наиболее распространенных ненаркотических анальгетиков: метамизола (5 мг/кг), диклофенака (25 мг) и аспирина (200 мг) по схеме с двойным плацебо (плацебо-ингалятор супероксида и плацебо-анальгетики). К исследованию были привлечены 12 практически здоровых добровольцев обоего пола (6/6) в возрасте от 20 до 49 лет (среднее 30,5 ± 9,5).

В эксперименте с анальгином на фоне приема плацебо и ложной ингаляции чаще наблюдалось слабое незначимое повышение ППБ. При приеме плацебо и истинной ингаляции, напротив, наблюдалось снижение ППБ — то есть некоторое повышениеболевой чувствительности. Отличия этих серий значимы сразу после окончания ингаляции, сохраняются на протяжении всего периода измерений и еще раз достигают уровня достоверности через три часа после окончания ингаляции.

На фоне приема анальгина и ложной ингаляции наблюдалось слабое повышение ППБ, приближающееся к уровню достоверности (отличие от серии с плацебо) в единственной точке — через 90 минут после окончания ингаляции (р = 0,08). На фоне приема анальгина и истинной ингаляции зарегистрировано весьма стабильное и заметное снижение болевой чувствительности в течение практически всего интервала тестирования. Это снижение достоверно относительно серии (плацебо + ложная ингаляция) в четырех временных точках, относительно серии (плацебо + истинная ингаляйия) в течение всего периода измерения, относительно серии (анальгин + ложная ингаляция) в двух случаях — в начале и в конце тестирования. Таким образом, на фоне ингаляций экзогенного супероксида препарат проявляет свое анальгетическое действие уже через 15 минут после приема (т.е. сразу после окончания ингаляции). Влияние это сохраняется не менее трех часов. Следовательно, ингалируемый супероксид усиливает действие анальгина, приводит к его значительно более быстрому развитию и пролонгации. На фоне приема аспирина и ложной ингаляции (рис. 24) обычно наблюдалось слабое повышение ППБ, не отличавшееся от изменений в серии (плацебо + ложная ингаляция).

При приеме аспирина и истинной ингаляции зарегистрировано довольно стабильное, хотя и незначительное снижение болевой чувствительности испытуемых. Это снижение достоверно относительно контрольной серии (плацебо + ложная ингаляция) через 30 минут после окончания ингаляции и относительно серии (плацебо + истинная ингаляция) в течение почти всего периода измерений. Значимое отличие от серии (аспирин + ложная ингаляция) отсутствовали.

Эффекты приема диклофенака натрия были минимальны. Серия с ложной ингаляцией практически не отличалась от контролясерия с истинной ингаляцией отличалась лишь от серии (плацебо + истинная ингаляция) в двух временных точках.

О Аспирин, 200 мг, + плацебо (ингалятор) ® Аспирин, 200 мг, + verum (ингалятор))? Плацебо (лек-во) + плацебо (ингалятор)? Плацебо (лек-во) + verum (ингалятор)Время (мин)Рис. 24. Потенцирование экзогенным супероксидом подавления боли в тесте давления на лунку ногтя при применении низкой дозы (200 мг) аспирина. Рандал-селито-анальгезиметрдобровольцы. Остальные обозначения см. рис. 23. I О Диклофенак 25 мг + плацебо (ингалятор) И ® Диклофенак 25 мг + verum (ингалятор)Время (мин)Рис. 25. Потенцирование экзогенным супероксидом подавления боли в тесте давления на лунку ногтя при применении дозы 25 мг диклофенака. Рандал-селито-анальгезиметрдобровольцы. Остальные обозначения см. рис. 23.

Механизм воздействия анальгина на систему болевой чувствительности связывается в последнее время с его влиянием на глюкокортикоидные рецепторы (Голиков, Николаева, 1993). Наличие этих рецепторов в головном мозге является хорошо хорошо установленным фактом (Cintra et al., 1994; Bannwarth et al., 1995). Показана также возможность взаимодействия серотонинэргической системы и системы глюкокортикоидов (Ogawa et al., 1994). Такое взаимодействие, следовательно, может рассматриваться в качестве возможного физиологического субстрата выявленного нами потенцирующего действия супероксида на эффекты низких доз анальгина.

Достаточно хорошо изученные анальгетические эффекты аспирина и диклофенака определяются, как известно, их преимущественно блокирующим действием на синтез простагландинов. Показано, что этот процесс происходит и в головном мозге, затрагивая центральные механизмы ноцицепции (Juma, 1986). Возможность взаимодействия серотонинэргической системы и системы простагландинов активно изучается (там же). Вероятность влияния супероксида на действие препаратов данной группы весьма велика. Относительно малая значимость зарегистрированных нами эффектов в случае диклофенака (рис. 25) может быть, в частности, связана с проведением экспериментов на практически здоровых испытуемых, то есть при отсутствии очага воспаления.

Таким образом, это исследование продемонстрировало возможность потенциирования анальгетического действия болеутоляющих лекарственных средств у человека. В этой работе были в принципе воспроизведены все основные закономерности реакций организма на экзогенный супероксид, обнаруженные ранее в экспериментах на животных. К ним, в первую очередь, могут быть отнесены явление потенциирования специфического действия ненаркотических анальгетиков, а также внешне парадоксальное явление понижения порога восприятия боли, вызванное собственно ингалируемым супероксидом. Интересным представляется также на первый взгляд отрицательный результат, полученный при испытании диклофенака в сочетании с экзогенным супероксидом. Объяснение этого эффекта может быть, однако, легко найдено в проведенном ранее сопоставлении действия отрицательных аэроионов и супероксида с действием адаптогенов, видимый эффект которого не проявляется в условиях нормального гомеостаза. Обсуждаемое испытание на добровольцах, в силу естественных этических соображений, проводилось без провокации воспалительного процесса, то есть без основного условия терапевтического применения нестероидного противовоспалительного анальгетика, каким является диклофенак. Интересно, однако, отметить, что диклофенак, как и аспирин, устранял гиперальгетическое действие собственно экзогенного супероксида.

Ноцицепция и боль — сложные полимодальные явления. В перцепцию соматической и висцеральной боли вовлечены различающиеся нейротрансмиттерные механизмы и нервные структуры, в связи с чем представлялось интересным исследовать также возможность модуляции экзогенным супероксидом ноцицептивного ответа в модели висцеральной боли. Работа была поставлена на самцах белых беспородных мышей. Болевая реакция в виде корчей развивалась в ответ на внутрибрюшинное введение 0,2 мл 0,6%-ного раствора уксусной кислоты (Тзагщ е1 а1., 1998). Как и в предыдущей работе, использовали наркотический и ненаркотический анальгетики промедол и баралгин. Общая схема экспериментов была аналогична описанной выше: животных предварительно подвергали ингаляции экзогенного супероксида или кислорода (50 минут), затем вводили внутрибрюшинно 0,1 мл раствора анальгетика или физиологический растворспустя 5 минут проводили внутрибрюшинную инъекцию раствора уксусной кислотычерез 5 минут начинали подсчет количества корчей в течение последующих 10 минут.

Было показано, что ингаляции экзогенного супероксида не вызывают изменений в количестве корчей в контрольной группе (без введения анальгетиков). Различия между группами животных после ингаляции супероксида и без нее составили 6% и достоверно не различались. Предварительная ингаляция супероксида также не влияла на анальгетическую активность баралгина.

Введение

баралгина в дозе 60 мг/кг вызывало значимое снижение количества корчей на 51% у мышей, не подвергавшихся воздействию супероксидау животных после ингаляции супероксида баралгин в этой же дозе вызывал значимое снижение количества корчей на 32%. Различия в ноцицептивной реакции между группами «баралгин» и «супероксид + баралгин» статистически недостоверны.

Введение

баралгина в дозе 30 мг/кг не вызывало значимых изменений числа корчей как в группах животных без воздействия супероксида, так и после ингаляции супероксида.

Введение

промедола в дозе 2,5 мг/кг вызывало значимое по сравнению с контролем снижение (на 55%) количества корчей в группе животных без обработки супероксидом.

Введение

промедола в той же дозе животным после ингаляции супероксида снижало количество корчей на 63%. Отличия между этой группой животных и животными, не получавшими супероксид, недостоверны.

Введение

промедола в дозе 1,25 мг/кг животным без обработки супероксидом вызывало значимое снижение числа корчей на 45% по сравнению с контролем, однако введение такой же дозы промедола животным после ингаляции супероксида не влияло на болевой ответ. Отличия между группами «промедол» и «супероксид + промедол» были статистически значимы (р < 0,05). Таким образом, в тесте висцеральной боли, вызванной химическим агентом, потенцирующее действие супероксида на антиноцицептивные эффекты использованных анальгетиков выявлено не было.

Полученные в этой части работы и приведенные выше результаты исследований свидетельствуют, в целом, о существовании сложного комплекса реакций центральной нервной системы на воздействие ингалируемого экзогенногосупероксида. Обнаруженное нами потенцирование антиноцицептивного действия анальгетиков разных классов позволяет предположить наличие одного или нескольких общих звеньев, вовлечением и/или активированием которых можно принципиально объяснить большинство из полученных результатов. В экспериментах с применением Рандалл-Селитто-теста были обнаружены две внешне принципиально различные реакции — сенситизация к болевому стимулу, вызванная экзогенным супероксидом без дополнительного воздействия анальгетиками, и потенцирование антиноцицептивного действия всех испытанных анальгетиков в моделях соматической боли. Можно полагать, что механизмы, лежащие в основе обнаруженного повышения чувствительности к болевому стимулу, принципиально сходны с теми, которые были обсуждены нами в других разделах работы, и связаны с понижением порогов проведения нервных импульсов в звеньях соответствующих рефлекторных реакций, т. е. со своеобразным «облегчением» передачи нервного сигнала внутри ЦНС, вызванного ингаляциями экзогенного супероксида.

Обсуждая механизмы формирования этих реакций, следует особо выделить роль кортикостероидных гормонов в синаптической передаче. В ряде работ было показано, что введение интактным животным гидрокортизона облегчает процессы синаптической передачи, укорачивая латентный период, увеличивая амплитуду импульса в постганглионарных звеньях и повышая лабильность и функциональную устойчивость ганглионарного аппарата (Ноздрачев, 1969; Северьянова, 1988). Было также показано, что у кошек после введения АКТГ в физиологически адекватных дозах наблюдалось облегчение развития поведенческих реакций (Северьянова, 1988). Логичным представляется предположить, что такая же сенситизация лежит в основе супероксид — зависимого повышения чувствительности рецепторов мозга к действию анальгетиков, и что сочетание этих двух процессов лежит в основе потенцирующего действия ингаляций супероксида.

Известно также, что при раздражении механоноцицепторов в моделях соматической боли имеет место преимущественное выделение серотонина и брадикинина, тогда как при боли, вызванной внутрибрюшинным введением химического раздражителя (корчи), главенствующую роль играет простагландин Ег. Различаются также механизмы трансмиссии ноцицептивного сигнала. Таким образом, различная по генезу боль имеет различия в пептидных механизмах ее модуляции, а также различные нейрохимические механизмы кодирования и проведения болевой импульсации (Калюжный, 1987). Эти особенности формирования ноцицептивной реакции в модели висцеральной боли послужили, повидимому, причиной отсутствия, в отличие от модели соматической боли, усиления супероксидом антиноцицептции у животных при введении низких доз анальгетика. Одновременно заслуживает внимания незначительная сенситизация, имевшая место и в этом случае, проявившаяся в уменьшении антиноцицептивного действия околопороговой дозы (1,25 мг/кг) анальгетика промедола. Этот вопрос, однако, нуждается в дальнейшем исследовании.

С использованием ноцицептивной реакции как общефизиологического ответа организма на раздражение рецепторов слизистой оболочки носовой полости, а также с применением in vivo ингибиторного анализа для идентификации действующего начала было показано, что потенцирующее действие отрицательно заряженного кислорода обусловлено преимущественно радикальной природой анион-радикала супероксида. Анализ данных литературы позволил предположить, что процессы, ведущие к потенцированию действия анальгетиков экзогенным супероксидом, опосредованы активацией центральных серотонинэргической и катехоламинэргической систем. Так, серотонин может играть роль в ноцицепции путем регуляции передачи ноцицептивной информации на различных уровнях периферической и центральной нервной систем (Taivo et al., 1992), причем как периферический, так и центральный пулы серотонина играют значительную роль в модуляции ноцицепции (Basbaum, Fields, 1984; Besson, Chaouch, 1987). В зависимости от условий эксперимента, путей введения и типа болевого стимула серотонин может усиливать, не вызывать эффект, или ингибировать поведенчески определяемую анальгезию (Jurna, Brune, 1990; Murphy et al., 1992). Известно также, что ингибиторы МАО, равно как и симпатомиметики, повышают доступность дофамина и норадреналина в синапсах, повышая тем самым морфиновую анальгезию (Pert, 1980). Кроме того, показано, что центральная компонента антиноцицептивного действия аспирина также в значительной мере зависит от целостности и уровня активности центральных моноаминэргических механизмов (Jurna, 1991). Таким образом, анализ результатов позволяет сделать вывод о том, что физиологическая активность газообразного супероксида, а также продукта его дисмутации — пероксида водорода реализуется путем вовлечения в физиологические ответы центральных нервных и нейрогуморальных механизмов. К ним относятся, в первую очередь, МАО-зависимые серотонинэргический и катехоламинэргический механизмы, а также нейрогуморальный, включая, вероятно, стимуляцию синтеза ?-эндорфина.г) Адаптация к физическим и химическим факторам среды и адаптогенное действие супероксида.

Окружающая среда является основным источником стрессорных воздействий на организм. Изменения, вызванные действием стрессоров, описываются общим адаптационным синдромом (Селье, 1960) и представляют собой приспособления к действию стрессора, направленные на сохранение гомеостаза. В большинстве случаев организмы способны переносить экстремальное действие стрессоров в течение ограниченного периода времени, продолжительность которого определяется видом стресс-агента, интенсивностью и длительностью его действия, а также видовыми и/или индивидуальными особенностями организма. Одним из ведущих патогенетических звеньев в реакциях организма на действие стрессорных факторов является активация пероксидного стресса и развитие сопряженных реакций со стороны антиокислительных защитных систем (Меерсон, 1981, 1985; Меерсон, Пшенникова, 1988; Айрапетянц, Гуляева, 1988). Показано, что динамика процессов липопероксидации может отражать последовательные этапы общего адаптационного синдрома (Гуляева и др., 1988; Айрапетянц, Гуляева, 1988). При малых и средних интенсивностях повреждающих факторов липопероксидация может быть компенсирована активацией антиокислительных систем, обеспечивающих уменьшение повреждающего действия пероксидного стресса.

На протяжении ряда лет (1966 — 1989 гг.) нами были исследованы изменения процессов липопероксидации, состояния антиокислительных систем, другие молекулярные и физиологические реакции животных при действии физических (гамма-облучение, электростатические поля) и химических (канцерогены, гидразин) факторов. В исследованиях при участии Б. Н. Тарусова, И. И. Иванова, С. К. Бузаса, М. Н. Мерзляка был обнаружен фазовый характер изменений антиокислительной активности липидов из печени крыс после общего рентгеновского облучения в дозах 800 и 1500 рентген и выявлены дозозависимые изменения антиокислительной активности, динамика которых может быть описана в понятиях адаптационного синдрома, включая фазы тревоги, адаптации и истощения (Мерзляк и др., 1969; Гольдштейн, 1972; Бузас и др., 1972; Гольдштейн и др., 1972; Виэаз ег а1., 1972). Было показано, что с увеличением дозы облучения длительность каждой фазы закономерно уменьшается. Принципиально аналогичная картина развития адаптационного синдрома и окислительного стресса наблюдалась нами также в цикле исследований биологического действия электростатических полей различной напряженности. Эксперименты были поставлены в рамках выполнения Программы разработки основ для гигиенического нормированияэлектростатических полей (Гольдштейн, 1977; Гольдштейн и др., 1977; Портнов, Гольдштейн, 1977).

Изменения окислительного стресса в развитии общего адаптационного синдрома могут служить указанием на возможность фармакологической коррекции отдельных звеньев, формирующих свободнорадикальную патологию. Показано, однако, что несмотря на кажущуюся очевидность такого подхода, желаемый терапевтический эффект не всегда может быть достигнут (Гуляева, 1988; McCord, 1995). В этой связи, значительный интерес могут представить воздействия адаптогенов и мягких стрессоров, способные увеличить адаптационный потенциал организма без развития побочных неблагоприятных эффектов. Примерами такого рода стрессорных факторов могут быть холодовое воздействие или дозированная физическая нагрузка (Меерсон и Пшенникова, 1988). Первые документированные свидетельства формирования адаптивных ответов на действие высоких доз отрицательных аэроионов относятся к 30-м годам 20-го века. Этим же периодом датируется обнаружение адаптогенного действия отрицательных аэроионов (см. Чижевский, 1960). Такие наблюдения появились задолго до возникновения самих терминов «адаптоген» и «стресс». В систематических исследованиях Васильева и его школы были приведены доказательства адаптогенного действия отрицательных аэроионов в повышении неспецифической устойчивости организмов к действию гипоксии, анафилаксигенов, инфекционных агентов, ряда физических факторов (Васильев, 1959; 1962).

В этой главе будут приведены результаты исследований адаптивных реакций организма животных, вызванных ингаляциями отрицательных аэроионов и экзогенного супероксида, а также адаптогенных, т. е. «повышающих общую неспецифическую резистентность организмов» (Брехман, 1981) эффектов экзогенного супероксида. В качестве повреждающих или стрессовых факторов нами были выбраны широко применяемые в медицинской практике гипербарический и нормобарический кислород, фенобарбитал и закись азота.

Сравнительное исследование процессов адаптации к экзогенному супероксиду и отрицательным аэроионам. Как нами было показано, экзогенный супероксид в составе пула отрицательных аэроионов может быть отнесен к естественным факторам воздушной среды. Элиминация этого фактора в условиях депривации аэроионов (см. ниже) или, напротив, повышение его содержания во вдыхаемом воздухе вызывают ряд преимущественно противоположно направленных физиологических ответов. В отличие от тяжелой патологии, вызванной депривацией аэроионов, нами не были ни в одном случаевыявлены признаки повреждающего действия экзогенного супероксида в выбранном диапазоне концентраций и доз. Многолетний опыт исследований биологической активности отрицательных аэроионов также дает основание утверждать, что в широком диапазоне испытанных концентраций и доз отрицательные аэроионы не вызывают патологических изменений в организме (Чижевский, 1960). Ответные реакции на воздействие высокими концентрациями отрицательных аэроионов носят адаптивный характер и в значительной своей части совпадают с таковыми, возникающими в ответ на воздействие экзогенного супероксида. Лучшим примером здесь может послужить успешное терапевтическое применение каждого из этих факторов в лечении бронхиальной астмы (Булатов, 1962; Jorda, Schata, 1979; Goldstein et al., 1975; Goldstein et al., 1976; Гольдштейн и др., 1977). В ряде случаев, динамика ответных реакций может быть описана в понятиях общего стресс — синдрома, что позволяет отнести экзогенный супероксид, как и аэроионы в целом, к естественным стресс-агентам окружающей среды. Это, в свою очередь, может служить указанием на существование сформировавшейся устойчивости к действию этих факторов.

С другой стороны, известно, что адаптация к слабым и/или кратковременным повторным стрессорным воздействиям может вызывать увеличение мощности стресслимитирующих систем центрального и периферического действия, включая активацию антиокислительных механизмов (Меерсон, Пшенникова, 1988). В этой связи, применение повышенных концентраций искусственно генерируемых отрицательных аэроионов, а также экзогенного супероксида, может представить известный интерес. Адаптогенное действие искусственно генерируемых отрицательных аэроионов описано в литературе неоднократно (Прессман, 1947; Минх, 1959; Васильев, 1962). Аналогичные исследования адаптогенных свойств экзогенного супероксида нам не известны. Кроме того, адаптогенные эффекты отрицательных аэроионов исследовались преимущественно на физиологическом уровне, без учета изменений эндогенного окислительного стресса.

В качестве интегрального показателя возбудимости ЦНС при действии отрицательных аэроионов и экзогенного супероксида, нами была исследована динамика изменений СПП. Кроме того, было проведено сравнительное исследование изменений эндогенного окислительного стресса в ответ на воздействие отрицательными аэроионами в наиболее часто использованных в литературе концентрациях и дозах, и экзогенного супероксида в концентрациях и дозах, использованных в нами в других разделах работы. Сравнительное исследование динамики изменений СПП было предпринято в условиях однократного и повторного 10-кратного, в течение 10 суток, воздействия каждым изфакторов при длительности каждой ингаляции 60 минут. Работа была проведена на -200 мышах. Результаты этих исследований приведены в таблицах 12 и 13.

Таблица 12. Динамика изменений СПП мышей в течение 48 часов после однократной 60-минутной ингаляции экзогенного супероксида и различных концентраций отрицательных аэроионов, М ± т.

Воздействие СПП, исходные данные Время после ингаляции 1 час 3 часа 24 часа 48 часовИнгаляция экзогенного супероксида (п = 36) 10,9 ±2,8 12,6 ±3.7 13,1 ±3,8 15,5 ± 3,8*/) 12,1 ±-2,9Ингаляция отрицательных аэроионов, 106 ион см3 (п = 34) 11,6 ±3,4 11,4 ±2,5 11,9 ±2,9 11,0 ±3,7 9,2 ± 2,2Ингаляция отрицательных аэроионов, 103 ион см3 (п = 30) 10,9 ±3,1 10,7 ±3,0 11,3 ±2,8 11,0 ±2,9 10,9 ±-2,9Обозначения: *) означает р < 0,05 к исходным значениям для данной группы, #) означает р < 0,05 к группам, получавшим отрицательные аэроионы.

Таблица 13. Динамика изменений СПП мышей в течение 10 суток в процессе ежедневных 60-минутных ингаляций экзогенного супероксида и различных концентраций отрицательных аэроионов, М ± ш.

Воздействие СПП, исходные данные Время от начала воздействия 24 часа 48 часов 120 часов 240 часовИнгаляция экзогенного супероксида (п= 34) 9,9 ±3,1 15,2 ±3.0 *) 13,8 ±3,9 12,9 ± 3,3 11,9 ±-3,9Ингаляция отрицательных аэроионов, 106 ион см3 (п = 34) 10,1 ±3,3 11,2 ±3,0 10,5 ±2,5 9,5 ± 2,6 9,0 ± 2,4Ингаляция отрицательных аэроионов, 103 ион см3 (п = 26) 9,8 ±3,1 9,4 ±2,8 10,0 ±2,9 9,6 ± 2,7 10,1 ±-2,9Обозначения: *) означает р < 0,05 к исходным значениям для данной группы.

Из представленных таблиц видно, что 1) низкие, приближающиеся к естественному уровню, концентрации отрицательных аэроионов не вызывают изменений СПП- 2) как экзогенный супероксид, так и высокие концентрации отрицательных аэроионов вызывают однонаправленное повышение возбудимости ЦНС, при этом, однако, действие экзогенного супероксида является более продолжительным и лучше выраженным.

Исследование изменений супероксиддисмутазной активности гомогената ткани мозга мышей в процессе 5-кратных 60-минутных ингаляций каждого из этих факторов показало, что во всех случаях наблюдается повышение СОД-активности. Наиболее устойчивым этот? Г Лэффект был в группах «экзогенный супероксид» и «отрицательные аэроионы» 10 ион/см причем в группе «экзогенный супероксид» эффект был выражен сильнее (рис. 26).

150 125 100*132121109117104*132* 122* 121 150*#& 141 117*115? супероксид? аэроионы? кислород*131 112а95через 3 часа послепервой ингаляции75 I96число ингаляций8978Рис. 26. Влияние повторных ингаляций экзогенного супероксида, отрицательных аэроионов и кислорода на динамику изменений СОД-активности гомогенатов мозга мышей.

Ингаляции по 60 минут ежедневноп = 6 в каждой группе. *) р < 0,05 к контролю- #) р < 0,05 к группе «аэроионы» и &) р < 0,05 к группе «кислород».

Активация ферментативной антиокислительной защиты в этой группе не была обусловлена действием нейтрального кислорода, в среде которого супероксид генерировался. Динамика первоначальных изменений СОД-активности тканей мозга в общих чертах соответствовала изменениям, характерным для фазы срочной адаптации, как это было описано в литературе (Гуляева, 1989).

В целом, полученные в этих экспериментах результаты подтвердили повышение возбудимости ЦНС и изменение процессов пероксидации, вызванные действием экзогенного супероксида и высокой концентрации искусственных отрицательных аэроионов. Эти адаптивные ответы принципиально не отличаются от описанных при эмоционально-болевом, акустическом, иммобилизационном стрессах (Гуляева и др., 1988; Oxenkrug, Requintina, 1998), действии электростатических полей (Гольдштейн, 1977; Гольдштейн с соавт, 1977) и низких уровней ионизирующей радиации (Гольдштейн, 1972; Гольдштейн и др., 1972). Показано также, что искусственные отрицательные аэроионы, в близких к естественному фону концентрациях, практически не вызывают изменений уровня антиокислительной защиты организма. В то же время, реакция на экзогенный супероксид, а также на высокие концентрации искусственных отрицательных аэроионов проявляется в уменьшении напряженности и/или подавлении окислительного стресса в изученных тканях. Сопоставление этих результатов с данными литературы позволяет провести аналогию с формированием системного «структурного следа» адаптации, характерного, в частности, для действия других относительно мягких стрессоров (Меерсон и др., 1985а, Меерсон и др., 1985bМеерсон и Пшенникова, 1988), развивающегося с вовлечением МАО-зависимых центральных, включая гипоталамические, механизмов (Masuda et al., 1993; Stratakis, 1995; Гениатуллина, Королев, 1996). В этом контексте индукция антиокислительной защиты может быть рассмотрена как один из компонентов адаптационного синдрома. Учитывая, однако, что окислительный стресс является общим звеном в патогенезе самых различных заболеваний, адаптивная активация антиокислительных систем может найти применение для повышения устойчивости организма к действию разнообразных повреждающих агентов.

Экзогенный супероксид и адаптация к нормобарической гипероксии. Из литературы известно, что ингаляции повышенных концентраций кислорода могут быть причиной развития целого ряда патологических процессов в различных органах и тканях. Одними из первых морфологические признаки повреждения развиваются в легочной ткани. Продолжительность выживания животных в насыщенной кислородом среде может достигать 96 часов (Smith et al., 1988). Приведенные в этой части свидетельстваадаптогенного действия экзогенного супероксида к различным формам кислородной интоксикации были получены нами: 1) в условиях однои трехкратного кратковременного и 2) непрерывного продолжительного воздействия на животных чистым кислородом при нормальном давлении, т.наз. нормобарическая гипероксия. В первой части исследования животных (крыс) помещали в среду чистого неионизированного или ионизированного кислорода с продолжительностью воздействия 60 минут ежедневно в течение 3-х дней. В этих условиях внешние признаки страдания животных отмечены не были. В то же время, при патоморфологическом исследовании тканей легких и сердца крыс после однократного и трехкратного воздействий (исследование проведено И.М. Ильинским) было установлено развитие выраженных повреждений у животных, получавших неионизированный кислород. Напротив, у животных, получавших в аналогичных условиях супероксид-содержащий ионизированный кислород, патологических изменений обнаружено не было. Краткое патоморфологическое описание приведено в таблице 14.

Таблица 14. Сравнение гистологических изменений в легких и в сердце крыс после одно-и трехкратных ингаляций экзогенного супероксида и неионизированного кислорода. Продолжительность каждой ингаляции 60 минут.

Действие неионизированного кислорода (контроль)Действие отрицательно ионизированного кислорода1-кратное воздействие (п = 6):Легкие1-кратное воздействие (п = 6): ЛегкиеВисцеральная плевра нормального строения, бронхи без особенностей, сосуды полнокровны, легкие воздухоносны. Альвеолы, в основном, одинаковые по размеру со свободными просветами, но в небольших участках имеются разрывы межальвеолярных перегородок с образованием увеличенных альвеолярных полостей.

Заключение

: при гистологическом исследовании легких выявлена слабо выраженная очаговая эмфизема.

СердцеВисцеральный перикард состоит из рыхлой соединительной ткани, покрытой снаружи слоем мезотелиальных клеток. В отдельных участках между перикардом и миокардом участки жировой клетчатки. Отмечается умеренное полнокровие коронарных артерий сердца. Пристеночный и клапанный эндокард без особенностей. Клетки миокарда без дистрофических изменений. Кровеносные капилляры миокарда расширены и полнокровны.

Заключение

: при гистологическом исследовании сердца найдено полнокровие миокарда.

Висцеральная плевра обычного строения. Альвеолы несколько расширены, одинаковые по размеру, со свободными просветами. Межальвеолярные перегородки тонкие. Бронхи и сосуды без особенностей.

Заключение

: при гистологическом исследовании легких патологические изменения не обнаружены.

СердцеЗаключение: При гистологическом исследовании сердца патологические изменения не найдены.

3-кратное воздействие (п = 6):Легкие3-кратное воздействие (п = 6): ЛегкиеНебольшие участки легких в препарате без видимых изменений, но на большой площади препарата имеются выраженные эмфизематозные изменения — образование крупных альвеолярных полостей вследствие разрыва тонких межальвеолярных перегородок. Эти эмфизематозные полости имеют различные размеры. Сосуды полнокровны. Бронхи без особенностей, в их просветах небольшое количество эозинофильной слизи.

Заключение

: при гистологическом исследовании легких найдена выраженная эмфизема.

СердцеПерикард и эндокард без особенностей. В миокарде найдены стазы крови и агрегация эритроцитов в просветах капилляров. В крупных ветвях коронарных артерий выраженное полнокровие. Клетки миокарда без дистрофических и некротических изменений.

Заключение

: Выраженное полнокровие артерий и агрегация эритроцитов в капиллярах миокарда.

Гистологическая структуралегких без отклонений от нормы. Отмечено умеренное полнокровие сосудов легких.

Заключение

: При гистологическом исследовании легких патологические изменения не обнаружены.

СердцеЗаключениеПри гистологическом исследовании сердца патологические изменения не обнаружены.

Во второй части исследования определяли выживаемость животных в этих же средах в условиях продолжительного непрерывного воздействия. Эксперименты были поставлены в трех повторностях на 180 белых беспородных мышах. Было установлено, что выживаемость животных в условиях непрерывной нормобарической гипероксии, составившая в контроле 71,4 ± 1,8 часов, возрастала до 89,5 ± 1,6 часов (р < 0,05), если подаваемый в камеры кислород содержал супероксид.

Экзогенный супероксид и адаптация к гипербарической гипероксии (ГБО). Известно, что гипербарическая оксигенация является терапевтически эффективным методом лечения заболеваний, преимущественно связанных с тканевой гипоксией (Кричевская, Лукаш, 1977; Петровский и др., 1987). Вместе с тем, применение ГБО имеет ряд ограничений, в значительной мере обусловленных токсическими эффектами кислорода и развитием эндогенного пероксидного стресса (Кричевская, Лукаш, 1977; Кричевская и др., 1980; Тбгок, 1986; Crouch et al., 1988). В целом ряде исследований было показано, что именно активация окислительного стресса является основным патогенетическим звеном кислородной интоксикации, сопровождающейся в эксперименте судорогами и гибелью животных (Torbati et al., 1992; Dennog et al., 1999). На развитие этого процесса оказывают влияние разнообразные факторы, например, такие, как изменение перепада парциального давления кислорода в системе легкие — кровь — ткани, индивидуальные особенности антиокислительных систем, реактивное состояние организма. Оценка всех этих факторов весьма существенна при клиническом применении ГБО. Сказанное в первую очередь может быть отнесено к оценке адаптационного потенциала антиокислительных защитных систем (Петровский и др., 1987). В частности, в исследованиях на больных в процессе курса ГБО-терапии нами было показано, что интенсификация окислительного стресса после каждого сеанса ГБО выражена сильнее у больных с исходно более высокими значениями МДА, что может отражать зависимость реакции от индивидуального уровня антиокислительной защиты (Гольдштейн, Шинкаренко, 1985; Гольдштейн и др., 1986).

Основываясь на приведенных выше данных естественно было ожидать, что в основе механизмов антиокислительной защиты в условиях ГБО может лежать специфика антиокислительного пула. В литературе достаточно широко освещены вопросы вовлечения молекулярных факторов антиокислительной защиты (СОД, каталазы, глутатионпероксидазы, альфа-токоферола, глутатиона) в реакции организмов на нормобарическую и гипербарическую гипероксию (Crapo, Tierney, 1974; Torok et al, 1986; Crouch et al., 1988). В то же время, на момент начала описанных ниже исследований, а также несмотря на имевшиеся свидетельства участия фермента с СОД-активностью церулоплазмина и системы церулоплазмин — трансферрин (ЦП-ТР) в регуляции уровня окислительного стресса in vivo при различных патологических состояниях (Козлов и др., 1984; Козлов, 1985), роль этих ферментов в процессах защиты и/или адаптации к ГБО рассматривалась лишь в единичных работах.

В исследованиях, проведенных совместно с O.A. Азизовой, Ю. А. Владимировым, A.B. Козловым и Л. И. Шинкаренко, нами было продемонстрировано, что 1) в условиях однократного воздействия чистым кислородом при различных значениях избыточного давления (от 0 до 4 ати) из трех исследованных видов липидных экстрактов (тканей легких, мозга и эритроцитов периферической крови) в первую очередь страдают липиды легочной ткани, 2) в этих же условиях, а также при повторных воздействиях ГБО, происходит увеличение содержания конъюгированных диенов и накопление МДА в сыворотке крови крыс, значительно возрастая при повторных воздействиях в субтоксических (4 избыточные атмосферы, 30 минут) режимах (таблица 15).

Таблица 15. Влияние ГБО (2 ати) на концентрацию церулоплазмина, МДА и диеновых конъюгатов в сыворотке крови крыс, М ± т.

Исследуемый показатель Контроль ГБОЦерулоплазмин, 2,35 ±0,17 3,10 ±0,19*)(мкмоль/л) МДА, 38,5 ±6,1 47,0 ±6,1*)(нмоль/л) Диеновые коньюгаты, 56,2 ±4,2 80,0 ±-7,3*)опт. плотность Е232 Обозначения: *) р < 0,05 к показателю в контроле.

Было также показано, что одной из защитных реакций организма на действие ГБО является активация антиокислительной системы церулоплазмин/трансферрин, при этом по достижении определенного значения величины избыточного давления кислорода происходит истощение адаптационного потенциала этой системы, сопровождающееся усилением пероксидного стресса и гибелью животных (Шинкаренко и др., 1988; Шинкаренко и др., 1988; Гольдштейн и др., 1989; Вартанян и др., 1989). При этом следует отметить, что церулоплазмин, супероксиддисмутазная активность которого приблизительно на три порядка ниже, чем у СОД (Нейфах и др., 1988), не в состоянии, повидимому, обеспечить полноценную защиту структур от усиления эндогенного пероксидного стресса. С другой стороны, защитная роль церулоплазмина в крови можетзаключаться в окислении Ре2+ до Ре3+, что уменьшает вероятность взаимодействия двухвалентного иона железа с пероксидом водорода и образования радикала гидроксила. Существенно также, что церулоплазмин участвует в транспорте меди из печени в клетки других тканей, способствуя тем самым интенсификации синтеза СОД (Оийепс^е, 1986). В контексте основной задачи диссертационной работы, значение результатов этих исследований заключается, в первую очередь, в подтверждении развития адаптивных реакций антиокислительных систем организма на окислительный стресс, инициируемый воздействием гипербарического кислорода.

Известно, что в основу распространенных способов повышения устойчивости организма к токсическому действию гипербарического кислорода положена фармакологическая стабилизация нейродинамики, а также направленная регуляция уровня пероксидного стресса, в первую очередь, в тканях мозга (Ефуни, 1986). С другой стороны, принято считать, что искусственное применение антиокислителей лишь незначительно повышает толерантность к гипербарическому кислороду, и что в большинстве случаев существует узкий диапазон доз между проявлением терапевтических и токсических эффектов ГБО. В качестве альтернативного метода неспецифического повышения устойчивости и адаптационных возможностей организма к воздействию гипербарического кислорода, мы остановились на способе, основанном на прекондиционировании животных газообразным супероксидом. Учитывая, что в сложный комплекс адаптационного процесса помимо антиокислительных, вовлечены также многочисленные другие биохимические и нейрофизиологические механизмы, для сравнения исследовали адаптивные эффекты от предварительного введения экстракта из корней элеутерококка — известного адаптогена растительного происхождения (Брехман, 1981).

Наиболее однозначным проявлением токсичности гипербарического кислорода в экстремальных режимах является гибель животных, обычно сопровождаемая тонико-клоническими судорогами и наступающая либо в барокамере, либо сразу после извлечения животных. В десяти сериях экспериментов нами была исследовано выживание животных в условиях воздействия ГБО после прекондиционирования ингаляциями экзогенного супероксида или введения спиртового экстракта корней элеутерококка. Исследование было проведено на самцах мышей линий СзН и С57Ыаск, всего на более, чем 360 животных. Результаты оценивали по показателю полулетального времени толерантности (ЬТ5о), который отражает выживание 50% взятых в опыт животных после стандартизованного по длительности пребывания в условиях ГБО (3 избыточныхатмосферы чистого кислорода, ати). Скорость линейного подъема и снижения давления составляла 0,3 атм/мин при длительности каждого этапа 10 мин. Было установлено, что ЬТ50 в этих условиях составляет 85,0 ± 3,1 мин.

Прекондиционирование экзогенным супероксидом осуществляли 60-минутными ингаляциями супероксида в потоке кислорода, которые проводили ежедневно за 1 — 5 дней до воздействия гипербарическим кислородом. Животным контрольных групп ингалировали чистый кислород. Во всех случаях животных помещали в гипербарические условия через 24 часа после последней ингаляции супероксида или кислорода. В экспериментах с применением элеутерококка, последний в виде раствора различных концентраций, приготовленных из фармакопейной настойки на 30%-ном этиловом спирте, вводили в желудок с помощью зонда в объеме 0,2 мл один раз в сутки до кормления животных в течение трех недель до воздействия гипербарическим кислородом. Животным двух соответствующих контрольных групп вводили аналогичным образом физиологический раствор или 30%-ный этиловый спирт. Обобщенные результаты этих исследований приведены в таблице 16.

Таблица 16. Влияние прекондиционирования мышей экзогенным супероксидом или элеутерококком на выживаемость в условиях ГБО (3 ати чистого 02- ёР/Л = 0,3 атм мин" 1).

АдаптогенКратность воздействия или доза в млЧисло животных% выживанияX"ч из к к акЩ1−1 осо И" о4) вСО оКонтроль 1×2х Зх 4×5×28 21 21 21 21 2146,4 66,7 81,0 100,0 95,2 85,71,45,6*) 16,4***) 13,6***) 8,9**)ч оОчо «о вКонтроль 1×2х Зх 4×5×28 21 21 21 21 2146,4 66,7 57,1 47,6 33,3 14,31,4 0,3 ОД 1,4 6,1*)во «оОч 4) НОлКонтроль — 1 Контроль — 2 (спирт) 0,04 0,02 0,01 0,008 0,418 109 151 610 1750,0 80,0 77,8 86,787.5 90,070.61,6 1,7 4,9*) 4,9*) 6,0**) 1,9Обозначения: *) р < 0,05- **) р < 0,01- ***) р < 0,001, все к контролюРезультаты исследования подтвердили предположение о возможности повышения толерантности животных к токсическому действию гипербарического кислорода применением каждого из факторов. Умеренное адаптогенное действие экстракта элеутерококка было выявлено при применении средних доз (0,008 — 0,02 мл кг» 1). При этом было установлено, что в значительной мере толерантность к ГБО могла быть обусловлена действием этилового спирта. Адаптогенное действие экзогенного супероксида было выражено значительно сильнее. Повышение %-ной доли выживших животных было достоверно выражено после двукратной ингаляции супероксида, достигало максимума в 100% после 3-кратной ингаляции и сохранялось на высоком уровне в последующие сроки. Этот эффект не был связан с предварительной ингаляцией неионизированного кислорода, воздействие которого выявило обратную тенденцию, т. е. снижение толерантности к ГБО уже после второй ингаляции.

Адаптогенные эффекты экзогенного супероксида и действие фенобарбитала. Дляисследования адаптогенного потенциала ингалируемого супероксида при воздействии ксенобиотиков, нами были выбраны относительно хорошо изученные вещества с наркотизирующим действием: 1) фенобарбитал — соединение с невысокой токсичностью (ЛД50 = 162 мг/кг, крысы, per os), центральным механизмом действия (умеренное снотворное и антиэпилептическое средство) и с изученным механизмом детоксикации в печени (индуктор микросомальной Р450-системы печени) и 2) закись азотамалотоксичный, в наркотизирующих дозах относительно слабый агент (ED50 =105 об.%), метаболизм которого не связан с гидроксилирующей системой печени. Было показано, что фенобарбитал снижает интегральную двигательную и мотивационно-поисковую активность у &bdquo-активных" и, совершенно незначительно, у &bdquo-пассивных" мышей. Ингаляции супероксида вызывают умеренный седативный эффект у &bdquo-активных", но не у &bdquo-пассивных" животных. При сочетанном действии этих факторов ежедневные ингаляции супероксида полностью элиминировали действие последнего, восстанавливая исходное поведение &bdquo-активных" животных в открытом поле. Этот эффект не был зарегистрирован у &bdquo-пассивных" животных, поведение которых во всех случаях практически не выходило за пределы вариабельности показателя (таблица 17) Таблица 17. Влияние ингаляций экзогенного супероксида (в течение 4-х дней по 60 мин. ежедневно), фенобарбитала (60 мг/кг, 4-кратно, перорально) и их сочетания на интегральную двигательную активность (пробежки + стойки) самцов мышей в тесте «открытое поле», М ± т.

Субпопуляция животных Контроль Супероксид Фенобарбитал Супероксид + фенобарбитал" Активные" 72,8 ± 3,7 (п = 12) 56,9 ±3,3*} (п 9) 44,4 ± 2,8**^ (п = 11) 71,4 ±3,6 (п = 11)" Пассивные" 43,6 ± 2,9 (п=8) 41,0 ±2,9 (п=9) 37,4 ±2,7 (п=11) 37,3 ± 3,4 (п=11)Обозначения: = р < 0,05- = р < 0,01 по отношению к соответствующему контролю.

Учитывая известные данные литературы об уменьшении токсичности различных ксенобиотиков ингаляциями отрицательных аэроионов, различная реакция &bdquo-активных" и &bdquo-пассивных" животных при сочетанном действии газообразного супероксида и фенобарбитала могла быть обусловлена не только типологическими особенностями животных, реализуемыми на уровне поведенческих реакций, но также изменениями связанной с нейрогуморальными механизмами цитохром-Р450-активности ткани печени. Для проверки этого предположения было проведено два эксперимента, где определяли содержание цитохрома Р450 в микросомной фракции печени мышей после четырех ежедневных 60-минутных ингаляций супероксида (исследование было проведено совместно с А. Берман). Действительно, было обнаружено уменьшение содержания цитохрома Р450 у «активных» животных, где этот показатель составил 67% (р < 0,05) от значения в контроле. У «пассивных» животных это изменение было недостоверным. Полученные результаты могут служить дополнительным свидетельством в пользу идентичности физиологических реакций, развивающихся в ответ на действие отрицательных аэроионов и экзогенного супероксида.

Лдаптогенные эффекты экзогенного супероксида и толерантность к закиси азота.

Участие центральных нейрорегуляторных систем в механизмах адаптогенного действия газообразного супероксида было нами продемонстрировано в иной постановке экспериментов, где было исследовано развитие толерантности к действию закиси азота. Группа животных со &bdquo-средними" значениями СПП подвергались дважды в течение двух суток 15-минутным ингаляциям смеси закиси азота с воздухом (1:1, объем/объем) с последующей 30-минутной ингаляцией супероксид/кислородной смеси или кислорода.

СПП регистрировали перед началом, а также после 15 мин ингаляции закиси азота (группа N2O, таблица 18), 1 час и 24 часа после начала ингаляции закиси азота с последующей ингаляцией кислорода или супероксида (группы N2O + О2 и N2O + 02″) ингаляции закиси азота. По истечении 24 часов от начала 1-й ингаляции N2O животных вновь помещали на 15 мин в среду с закисью азота, после чего подвергали повторной ингаляции кислорода или супероксид/кислородной смеси.

Таблица 18. Коррекция экзогенным супероксидом суммационно-порогового показателя (СПП) крыс после однои двукратной ингаляции закиси азота. Исходные значения СПП: 10,8 ± 2,9, М ± т.

Время после окончания 1-й ингаляции супероксида Процедура Воздействие (п= 14 + 14) n20 + 02 n2o + огИнгаляция закиси азота (15 мин) Ингаляция супероксида (1 час) 15 минут Измерение СПП 6,7 ± 2,0 7,0 ± 2,21 час Измерение СПП 11,8 ±2,7 7,5 ±3,124 часа Ингаляция закиси азота (15 мин) Ингаляция супероксида (30 мин) Измерение СПП 19,3 ±3,8*) 10,4 ±3,048 часов Измерение СПП 27,5 ± 2,0**) 11,4 ±-2,5Обозначения: *) р < 0,05 и **) р < 0,01 по сравнению с исходными значениями.

Было обнаружено, что через 15 мин после первого воздействия закисью азота у животных обеих групп наблюдалось практически одинаковое уменьшение СПП, в среднем на 38%. В дальнейшем увеличение СПП в контрольной кислородной группе увеличивалось, тогда как у животных, получавших ингаляции супероксида, значения СПП полностью вернулись к исходным значениям (таблица 18, рис. 26).

Повышение толерантности к закиси азота экзогенным супероксидом было продемонстрировано также в другой постановке эксперимента, где воздействие супероксидом предшествовало ингаляции закиси азота. Исследование проведено на «средних» мышах, результаты представлены в таблице 19.

1−4: Изменения СПП после ингаляцийN20 без коррекции супероксидом *75−3810*1455−8: Изменения СПП после ингаляций N20 и супероксида-41−35ТД-20−2Рис. 26. Коррекция экзогенным супероксидом изменений суммационно-порогового показателя, индуцированных закисью азота у мышей.(1) и (5) — 15 минут после ингаляции закиси азота- (2) и (6) — 60 минут после ингаляции закиси азота- (3) и (7) — 24 часа после ингаляции азота- (4) и (8) — 15 минут после повторной (через 48 часов) ингаляции закиси азота. *) р < 0,05 к исходному значению.

Таблица 19. Изменения спонтанной исследовательской активности мышей после ингаляций закиси азота на фоне воздействий экзогенным супероксидом, М±ш.

Группа животных Спонтанная исследовательская активность (число обследованных норок за одну минуту) Исходные значения Фаза возбуждения (6-я минута) Фаза угнетения (15-я минута)(1) Закись азота (п = 12) 15,2± 3,1 28,8 ± 4,4* 9,2 ± 1,3*(2) Ог + закись азота (п=13) 13,9 ±2,8 25,1 ± 4,1* 20,1 ± 3,1*)&)(3)+ закись азота (п=13) 15,0± 3,0 40,9±4,6**)#) 38,1 ± 3,9**)#)&-)Обозначения: *} р < 0,05 и **} р < 0,01 к исходным значениям-#) р < 0,05 (з)к (2)и (1>- &) р < 0,01 (2)К (1)и (3)к (1).

Как и в предыдущем случае, в этом эксперименте был выявлен адаптогеный эффект экзогенного супероксида. При этом было показано, что собственно кислород в контрольной группе, практически не влияя на активность животных в фазе возбуждения, обусловливает сохранение исследовательского рефлекса в фазе угнетения. Экзогенный супероксид в этом тесте проявил активность в обеих фазах наркотизирующего действия закиси азота, причем как и в экспериментах с фенобарбиталом, это действие более отчетливо выявляется в фазе угнетения. Поскольку в метаболизм закиси азота не вовлечена система цитохрома Р450 печени, модифицирующее действие ингалируемого супероксида реализуется, скорее всего, на уровне ЦНС. Известно, что ингаляции закиси азота оставляют «след» в форме более или менее продолжительной активации окислительного стресса в тканях мозга (Селезнев и др., 1994; СЫпеу ег а1., 1995; СЫпеу е1 а1., 1998). Аналогичные наблюдения были сделаны нами при исследовании пероксидного стресса в крови больных, получавших закись азота в ходе хирургического вмешательства. Как видно из вышеприведенных данных, предварительные ингаляции кислорода и, в еще большей степени, супероксида, повышая антиокислительный потенциал ткани, выступают в роли адаптогенных факторов.

Окружающая среда является не только основным источником стрессорных воздействий, но также источником естественных факторов физической и химической природы, повышающих устойчивость организмов к действию стрессоров, или «общую неспецифическую резистентность организмов» (Брехман, 1981). В отечественной науке начало исследованиям этих факторов было положено работами Н. В. Лазарева и его школы по изучению влияния некоторых лекарственных препаратов на умственную и физическую работоспособность, а также на состояние неспецифической резистентности организма. К числу таких средств относятся препараты растительного (женьшень, лимонник, элеутерококк) и животного (пантокрин) происхождения, а также некоторые лекарственные препараты (дибазол и др.), способные «повышать устойчивость людей и животных к различным экстремальным и повреждающим воздействиям» (ВгекЬшап, 1981; Петков, 1981; Фулдер, 1981; Герасюта, Коваль, 1981).

Систематические исследования Васильева и его школы позволили обосновать представления об отрицательных аэроионах как адаптогенах к гипоксии, воздействию инфекционных агентов, анафилаксигенов, физических факторов (Васильев, 1962; Бе1еапи, 1988; Бе1еапи, Ма^пеапи, 1986). Из особенностей адаптогенных свойств отрицательных аэроионов в первую очередь обращает на себя внимание неспецифичность — свойство, присущее большинству природных и синтетических, как, например, дибазол и фенибут (Ковалев и др., 1981) адаптогенов. В известной мере к таким неспецифическим адаптогенным реакциям можно, повидимому, отнести изменения антиокислительных систем. Важная роль свободнорадикальных процессов в развитии стрессовых реакций организмов находит отражение в универсальности адаптационного ответа при действии факторов различной природы. Так, однотипная динамика изменений таких показателей пероксидного стресса, как содержание конъюгированных диенов и МДА, хемилюминесценция липидов и вспышка хемилюминесценции гомогената из печени крыс, были обнаружены нами в ответ на действие гипербарического кислорода, введение канцерогенов (Гольдштейн и др., 1972) и при интоксикации печеночным ядом гидразином (Майоре и др., 1985). Принципиально сходные изменения были также установлены нами при воздействии на животных экзогенным супероксидом и высокими концентрациями отрицательных аэроионов. При этом нельзя не согласиться со справедливостью известной точки зрения, что за внешней «неспецифичностью» часто скрывается недостаточное понимание процесса (Владимиров, Арчаков, 1972).

Для объяснения вероятных физиологических механизмов адаптогенной активности экзогенного супероксида мы обратились к данным литературы о механизмах действия адаптогенов растительного происхождения. Известно, что некоторые механизмы действия женьшеня и, повидимому, элеутерококка связаны с их стимулирующим влиянием на подкорковые отделы головного мозга, в первую очередь гипоталамус (Фулдер, 1981), с вовлечением других подкорковых структур мозга, а также коры больших полушарий (Петков, 1981). Так, экстракт женьшеня вызывает повышение содержания дофамина и норадреналина в стволе и серотонина в коре головного мозга. Аналогичные по направленности изменения в подкорковых центрах были обнаружены нами как результат ингаляции газообразного супероксида. Известно также, что элеутерококк регулирует интенсивность метаболизма, уменьшает степень десинхроноза, усиливает реакции приспособительного поведения, существенно влияет на длительность стадий общего адаптационного синдрома, удлиняя стадии резистентности за счет укорочения стадий тревоги и истощения, что обеспечивает более продолжительную и устойчивую жизнедеятельность в условиях действия разнообразных сильных острых и хронических воздействий (Брехман, 1981). В наших экспериментах, однако, элеутерококк оказался значительно менее потентным адаптогеном по сравнению с газообразным супероксидом, что может свидетельствовать о дополнительном вовлечении иных, нежели активируемые элеутерококком, адаптационных механизмов. Примером одного из них может быть обнаруженное нами и описанное в диссертационной работе угнетение газообразным супероксидом активности моноаминоксидаз мозга, предотвращающее эндогенноеформирование токсичных продуктов обмена моноаминов — пероксида водорода и, возможно, радикала гидроксила, а также активирующее серотонинэргическую и допаминэргическую нейромедиаторные системы. Известно, что предварительное введение животным хлоргилина ингибирует МАО-А в тканях мозга и замедляет развитие судорог, повышая выживание животных в ГБО (Гаришвили, Горкин, 1978, цит. по: Медведев, Триптон, 1997). Учитывая, что в катализируемой моноаминоксидазами реакции образуется пероксид водорода, было высказано предположение, что при патологических состояниях, сопровождающихся развитием окислительного стресса, ингибирование моноаминоксидаз можно рассматривать как защитный механизм, уменьшающий образование активированных форм кислорода — возможный источник последующего окислительного повреждения (Медведев, Триптон, 1997).

В целом, однако, роль моноаминоксидаз в адаптационном процессе только начинает проясняться. Модифицирование каталитических свойств МАО было обнаружено также при гипоксии и холодовом стрессе (Медведев, Триптон, 1997). Защитное действие к гипербарическому кислороду проявляется также в случае прекондиционирования животных эндотоксином, где физиологические ответы со стороны моноаминэргических систем опосредованы активацией гипоталамо-гипофизарно-адреналового комплекса (С1уа1о18 е1 а1., 1999; Билл, 2000). В эти процессы вовлечены гипоталамические паравентрикулярное и супраоптическое ядра (Гениатуллина, Королев, 1996; 81та1ак18 е1 аЦ 1995), которые по данным литературы в числе первых реагируют на воздействие аэроионов (ОНуегеаи, 1976) и где, по нашим данным, развиваются выраженные патологические изменения в условиях депривации экзогенного супероксида, (см. ниже).

В обсуждаемом разделе диссертационной работы нами было показано, что формирование ответных поведенческих, а также других ЦНС-зависимых реакций животных на воздействие физических и химических факторов умеренных интенсивностей в значительной мере зависит от типологических особенностей нервной системы, и что по этому признаку животные могут быть подразделены на две основные группы «активных» и «пассивных» особей с характерными для каждой группы типами поведенческого и биохимического реагирования, включая реакции на ксенобиотики и экзогенный супероксид. Таким образом, выявленные в работе различия между поведенческими реакциями «активных» и «пассивных» особей могут иметь генетическую и биохимическую природу (Ротенберг, Аршавский, 1984).

Нами было также показано, что защитные эффекты ингалируемого супероксида могут быть выявлены не только на уровне ЦНС. Предпринятое нами гистологическоеисследование легких — органа, проявляющего очень высокую чувствительность к повреждающему действию таких окислителей, как кислород в повышенных концентрациях, озон и окислы азота, выявило различную реакцию легочной ткани крыс на действие 98%-ного кислорода в зависимости от содержания в нем супероксида. В отличие от патологических изменений, вызванных вдыханием «чистого» кислорода и проявившихся в эмфизематозных изменениях в легочной ткани крыс, у животных, получавших ингаляции обогащенного супероксидом кислорода, никаких гистологических признаков развития эмфизематозных или других патологических изменений в легочной ткани обнаружено не было.

Известно, что повышение устойчивости организма к повреждающему действию ряда факторов физической природы может быть достигнуто многократным и/или длительным применением ограниченного по интенсивности стрессора. Так, в основном, формируется механизм долговременной адаптации, которая предположительно реализуется на основе многократного повторения стадии срочной адаптации (Меерсон, 1986). В настоящее время представляется затруднительным нарисовать полную картину адаптогенного действия газообразного супероксида. Представляется вероятным, что в зависимости от природы экстремального фактора, в формирование адаптивных реакций могут быть вовлечены помимо общих, реализуемых на уровне ЦНС и гормональной регуляции, также относительно специфические реакции, как например модуляция цитохром-Р450-активности микросом печени при действии ксенобиотиков, модуляция активности моноаминоксидаз, активация АРиО-системы или адаптивные изменения окислительно-антиокислительных механизмов.

Принято считать, что действие адаптогенов обычно не проявляется или может быть очень незначительным в условиях физиологической нормы, и реализуется при различных сочетаниях с действием того или иного стрессора. В этой связи Брехман (1968) подчеркивает, что адаптогены должны вызывать тем более выраженный эффект, чем неблагоприятнее действующие на организм факторы. Известная аналогия может быть проведена в отношении действия отрицательных аэроионов (ЬепЫелукг й ей., 1989) и, как было нами показано выше, экзогенного супероксида. Установлено также, что истинные адаптогены, улучшая приспособленность организма к существованию в различных неблагоприятных условиях, не вызывают в то же время в обычных условиях заметных общефизиологических реакций или каких-либо отрицательных сдвигов в обмене веществ (Брехман, 1981). Данные литературы в отношении естественных уровней отрицательных аэроионов свидетельствуют об аналогичном биологическом действии этого факторасреды. Примечательно, что в отличие от вышеперечисленных адаптогенов, воздействиям ничтожных концентраций газообразного супероксида в составе аэроионов организмы подвергаются непрерывно в течение всей жизни. д) Влияние экзогенных активированных форм кислорода на окислительный стресс и моноаминоксидазные системы мозгаВышеизложенные обстоятельства и данные литературы позволили нам предположить возможность угнетения в результате ингаляций супероксида активности моноаминоксидаз и активации дофаминэргической и серотонинэргической нейромедиаторных систем в тех структурах ЦНС, афферентный вход которых берет начало от рецепторов носовой полости. Следует отметить, что вопрос о влиянии аэроионов на метаболизм дофамина мозга рассматривался лишь в единичных работах (Charry, Bailey, 1985). Напротив, участие и роль аэроионов в метаболизме серотонина были исследованы неоднократно, и этот вопрос на протяжении длительного времени является предметом дискуссии (Charry, 1984, 1987). Первые представления о вовлечении метаболизма серотонина в физиологические реакции организма в ответ на воздействие аэроионами были сформулированы в лаборатории Krueger (Krueger et al., 1968; Krueger, Kotaka, 1969). В основу были положены наблюдения, свидетельствовавшие о снижении скорости метаболизма серотонина в ткани трахеи кролика отрицательными аэроионами (Krueger, Smith, 1960). Противоположные эффекты были описаны при действии положительных аэроионов (Krueger et al., 1966; Krueger, 1972; Sulman et al., 1975). Существенно, однако, что в большей части случаев эти представления основывались на исследованиях локального воздействия на ткань in situ и на измерении содержания конечного метаболита серотонина, 5-оксииндолуксусной кислоты, в моче. Предпринятые позднее измерения уровня серотонина, а также норадреналина и дофамина в тканях мозга крыс после ингаляции аэроионов не выявили заметных изменений в содержании этих нейротрансмиттеров (Charry, Bailey, 1985; Bailey, Charry, 1987). Известно, однако, что до 95% всего находящегося в организме серотонина сосредоточено в энтерохромаффинных клетках слизистой оболочки кишечника (Горкин, 1981) — значительные резервы серотонина сосредоточены также в тромбоцитах (там же). Кроме того, ткани органов дыхания, как и кишечника, содержат клетки APUD-системы, способные улавливать и накапливать медиаторы воспаления, в том числе серотонин (Алешин, 1984; Блинова, 1987; Joos et al., 1994). Таким образом, общепринятые взгляды на роль аэроионов в регуляции представляющего в данном контексте основной интерес пула серотонина в структурах ЦНС не могут служить предметом серьезного обсуждения. Противоречивость этих данных становится еще более очевидной с учетом неоднократных сообщений о благотворном влиянии ингаляций отрицательных аэроионов на больных смигренью, а также на гиперактивных подростков и гиперагрессивных психических больных, т. е. в тех случаях, где явно прослеживается связь патологического состояния с нарушениями функционирования нейротрансмиттерных, в первую очередь серотонинэргической, систем мозга (Baron et al., 1985; Yates et al., 1987). С другой стороны, полученные нами результаты свидетельствуют в пользу вовлечения МАО-зависимых нейрофизиологических процессов в общий ответ ЦНС на раздражение рецепторов носовой полости экзогенным супероксидом и/или пероксидом водорода.

Задачей данного этапа работы было исследование влияния экзогенного супероксида и низкодозированного пероксида водорода на активность моноаминоксидаз некоторых отделов мозга и сопряженные физиологические и биохимические процессы. Часть экспериментальных задач была выполнена нами совместно с И. Масловой, А. Хоменко, А. Каменским, В. Дубининым, Н. Левитской и М. Аврущенко. Всего было проведено шесть исследований влияния назально апплицированных газообразного супероксида и пероксида водорода на активность моноаминоксидаз (МАО-А и МАО-B) в гипоталамусе и базальных ганглиях мозга, содержание дофамина и продуктов его метаболизма и морфологические изменения в черной субстанции и стриатуме как без дополнительных воздействий, так и в условиях лекарственной нагрузки (резерпин) или действия нейротоксина (1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин, МФТП). В некоторых экспериментах были также исследованы показатели, отражающие состояние окислительного стресса — малоновый диальдегид (МДА), и диеновые конъюгаты (ДК), а также поведенческая активность животных. Исследование было проведено на -300 животных (крысы и мыши).

Антирезерпиновое действие и активация экзогенным супероксидом и пероксидом водорода моноаминэргических систем мозга. Исследование влияния экзогенного супероксида и пероксида водорода на динамику изменений поведенческих реакций, активности моноаминоксидаз и окислительного стресса в гипоталамусе и базальных ганглиях мозга животных было проведено в условиях фармакологической резерпиновой десимпатизации (Авакян, 1977; Комиссаров, 1986). Известно, что резерпин блокирует Mg++ - зависимую АТФазу, активно накачивающую протоны в везикулы. Нарушение протонового насоса ведет к уменьшению концентрации Н+ в везикулах и последующему угнетению протонирования моноаминов: дофамина, норадреналина, а также серотонина, что препятствует их накоплению. Через короткое время везикулы опустошаются и передача нервного сигнала нарушается. Имеющиеся остатки этих медиаторов разрушаются МАО. У животных (крысы, мыши) внешними симптомами действияотносительно высоких доз резерпина (более 2 мг/кг) являются снижение двигательной активности и угнетение поискового рефлекса. Результаты этих исследований обобщены в таблицах 20−24.

Эксперимент 1. Резерпин вводили до или после предварительной затравки животных (белые мыши), экзогенным супероксидом, что позволяло выявить «профилактические» или «лечебные» эффекты супероксида. Перекисное окисление липидов в гомогенатах тканей мозга оценивали по уровню содержания ДК и накоплению ТБК-активных продуктов (МДА). Активность различных субстратных форм моноаминоксидазы исследовали по методу Балаклаевского (1976). Особенности затравки 10'5 М раствором пероксида водорода в этом эксперименте заключались в применении ингаляционного способа. Последнее было вызвано методическими сложностями эндоназальной аппликации раствора у мышей. Для исключения системного действия пероксида водорода через поверхность легких, ингалируемый аэрозоль был образован сравнительно крупными частицами величиной 180 — 200 микрон. Режим ингаляций: по 1 мин через каждые 5 мин, в течение 1 часа. В этом эксперименте у резерпинизированных по описанной схеме мышей было выявлено антидепрессивное действие исследованных активированных форм кислорода, обнаруживаемое как при &bdquo-профилактическом", так и при &bdquo-терапевтическом" их применении (таблица 20).

Таким образом, в этом эксперименте было показано, что 1) как экзогенный супероксид, так и низкодозированный пероксид водорода восстанавливают угнетенную резерпином спонтанную двигательную активность мышей, 2) антирезерпиновые эффекты двух исследованных форм активированного кислорода выражены практически в одинаковой степени и 3) эффективность восстановления двигательной активности животных в условиях эксперимента не зависит от последовательности воздействия активированными формами кислорода и резерпина.

Таблица 20. Нормализация эндоназальными аппликациями экзогенного супероксида или пероксида водорода угнетенной спонтанной двигательной активности мышей, вызванной введением резерпина (5 мг/кг, в/бр.). Суммарная двигательная активность (пробежки + стойки, сумма за 3 мин), М ± т.

Эксперимент 2. Выраженное антирезерпиновое действие экзогенного супероксиданормализация подавленных поведенческих реакций животных — было также установлено в аналогичных исследованиях, проведенных на крысах. Кроме того, в этой работе были получены дополнительные доказательства вовлечения системы серотонина в ответ на ингаляцию супероксида — повышение ректальной температуры животных (таблица 21).

Таблица 21. Нормализация экзогенным супероксидом угнетенной спонтанной активности и повышение ректальной температуры у резерпинизированных белых крыс (резерпин: в/бр., 1-кратно 5 мг/кг и 3-кратно 2 мг/кг), М ± т.

Эксперимент 3. Далее, было показано, что в условиях 30-дневной ингаляции экзогенного супероксида без фармакологической нагрузки резерпином наблюдается угнетение МАО-В-оксидазной активности в гипоталамусе и базальных ганглиях, а также МАО-А-активности в гипоталамусе (таблица 22). Одновременно было отмечено также уменьшение напряженности окислительного стресса в исследованных регионах мозга.

Таблица 22. Влияние хронического воздействия экзогенным супероксидом наизменение активности различных субстратных форм моноаминоксидазы, содержание МДА и ДК в базальных ганглиях и гипоталамусе крыс. Супероксид: ингаляции в течение 30 суток, 4 часа ежедневно, М ± т.

Исследуемый показатель Группа животных Базальные ганглии ГипоталамусСеротониновая МАО (МАО-А) (нмоль/мг белка в мин) Контроль (Ог) Опыт (супероксид) 0,28 ± 0,02 0,34 ± 0,02 0,99 ± 0,08 0,28 ± 0,03**'Бензиламиновая МАО (МАО-В) (нмоль/мг белка в мин) Контроль (02) Опыт (супероксид) 0,65 ± 0,05 0,45 ± 0,03*' 0,93 ± 0,07 0,54 ± 0,05**'Малоновый диальдегид (нмоль/г сырого веса) Контроль (Ог) Опыт (супероксид) 551 ±28 348 ± 15*' 142 ±8 158 ± 7Диеновые конъюгаты (опт.плотн./мг ткани) Контроль (Ог) Опыт (супероксид) 0,100 ±0,006 0,038 ± 0,003*' 0,0143 ± 0,007 0,0026 ±-0,0004*'Обозначения: = р < 0,05- **' = р < 0,01- везде к соотв. контролюпопыт = 7- п контроль = 8.

В таблицах 23 и 24 отражена динамика изменений этих же показателей в условиях фармакологической десимпатизации животных на фоне предшествующих ингаляций экзогенного супероксида.

Таблица 23. Влияние подострого воздействия экзогенным супероксидом на изменение активности различных субстратных форм моноаминоксидазы, содержание МДА и ДК в базальных ганглиях и гипоталамусе крыс в условиях десимпатизации животных.

Резерпин: 1-кратно в/бр., 5 мг/кгсупероксид: Зх-крагно, ежедневно по 60 мин. Животным из контрольной группы вводили физиологический раствор и ингалировали неионизированный кислород, М ± т.

Исследуемый показатель Группа животных Базальные ганглии ГипоталамусСеротониновая МАО (МАО-А) (нмоль/мг белка в мин) (1) Контроль (2) Резерпин (3) Супероксид + резерпин 0,28 ± 0,02 0,24 ± 0,02 0,27 ± 0,01 0,93 ± 0,06 1,00 ±0,07 1,02 ±-0,06Бензиламиновая МАО (МАО-В) (нмоль/мг белка в мин) (1) Контроль (2) Резерпин (3) Супероксид + резерпин 0,65 ± 0,04 0,79 ±0,07*} 0,65 ± 0,04#) 0,93 ± 0,05 1,12 ±-0,Об*0 0,97 ± 0,05#)Малоновый диальдегид (нмоль/г сырого веса) (1) Контроль (2) Резерпин (3) Супероксид + резерпин 551 ±38 498±31*) 441 ±25*} 331 ±22 384 ± 35*) 337 ± 19Диеновые конъюгаты (опт.плотн./мг ткани) (1) Контроль (2) Резерпин (3) Супероксид + резерпин 0,100 ±0,007 0,108 ±0,007 0,107 ±0,008 0,0143 ± 0,0008 0,0235 ± 0,0012**} 0,0185 ±-0,0011#)Обозначения: = р < 0,05- **> = р < 0,01 для групп (2) уз. (1) — #) = р < 0,05 для групп (3) ув. (2). Число животных в каждой группе 15.

Таблица 24. Влияние подострого воздействия экзогенным супероксидом на изменение активности различных субстратных форм моноаминоксидазы, содержание МДА и ДК в базальных ганглиях и гипоталамусе крыс в условиях десимпатизации животных.

Резерпин: 3-кратно, 1х в сутки, 2 мг/кг в/бр.- супероксид: Зх-кратно, ежедневно по 60 мин. Животным из контрольной группы вводили физиологический раствор и ингалировали неионизированный кислород, М ± т.

Таким образом, было установлено, что ингаляции экзогенного супероксида и/или низкодозированного пероксида водорода способны предотвращать резерпин-зависимое повышение моноаминоксидазной активности и пероксидного стресса в гипоталамусе и базальных ганглиях, а также угнетение поведенческой активности у животных. Эти результаты согласуются с представлениями о вовлечении серотонинэргических механизмов в реакции на воздействие отрицательными аэроионами (Diamond et al., 1980), свидетельствуя в пользу возможной общности физиологических, в частности, центральных, механизмов действия экзогенного супероксида и отрицательных аэроионов. Эти результаты можно также рассматривать как одно из доказательств справедливости наших представлений об общности физико-химической природы действующего фактора отрицательных аэроионов и экзогенного супероксида.

Результаты этого исследования показали также, что изменение ферментативной активности моноаминоксидаз гипоталамуса и базальных ганглиев сопровождается изменениями пероксидного стресса в этих структурах. Повышение уровня пероксидного стресса у резерпинизированных животных не связано, повидимому, с действием собственно резерпина, являющегося in vitro ингибитором ПОЛ (Elstner, 1990). Известно, однако, что в процессе катализируемых моноаминоксидазами реакций окисления моноаминов образуется альдегид и эндогенный пероксид водорода, вносящий значительный вклад в окислительный статус тканей. Пероксид водорода образуется также на втором этапе реакции — окислении альдегида альдегидоксидазой (Rajagopalan, 1980). Эти оба процесса принято считать несущими основную ответственность за повреждения нервных структур, в частности, дофаминэргических нервных окончаний в базальных ганглиях (Cohen, 1984; Cohen et al., 1985). Ингаляции экзогенного супероксида и низкодозированного пероксида водорода почти во всех наблюдавшихся нами случаях нормализуют активность моноаминоксидаз. Таким образом, сопряженные с активностью моноаминоксидаз изменения пероксидного стресса имеют довольно сложную биохимическую природу. Предполагается, что на уровень пероксидации в случае МАО-зависимых реакций могут влиять как истощение запасов субстратов (серотонин, дофамин), так и определенные изменения субстратной специфичности моноаминоксидаз, — процесс, в свою очередь зависящий от редокс статуса тканей, в частности, от уровня окислительного стресса (Рамсэй, 1997; Медведев, Типтон, 1997). Аналогичные результаты были получены в работе Thomas et al. (1997), где авторами были исследованы показатели окислительного стресса после введения фармакологического ингибитора МАО-Bдепренила.

Рассматривая этот вопрос с другой стороны следует отметить, что наблюдавшееся в наших экспериментах уменьшение содержания конъюгированных диенов в гипоталамусе после ингаляций экзогенного супероксида могло быть связано с обнаруженной нами ранее активацией адренокортикотропной функции гипофиза. В этой связи следует также отметить, что а) гипоталамус содержит наибольшее, по сравнению с другими регионами мозга, количество рецепторов кортикостероидов, б) кортикостероиды, в частностикортизол, обладают выраженной антиокислительной активностью и в) у человека повторные ингаляции супероксида вызывают достоверное повышение уровня эндогенного кортизола в крови (см. ниже). В обсуждении механизмов уменьшения окислительного стресса, возможно, смогут найти место также наши данные о повышении супероксиддисмутазной, глутатионпероксидазной и каталазной активности в тканях мозга после повторных ингаляций супероксида. Применимость этих наших результатов в случае аппликации пероксида водорода требует, однако, дополнительных исследований. В обсуждении этого вопроса следует также принять во внимание возможную роль серотонина, как эндогенного антиоксиданта (Соболев, 1972), накопление которого в условиях угнетения активности МАО-А могло бы дополнительно способствовать повышению антиокислительного потенциала тканей.

Защита активированными формами кислорода нейротрансмиттерных моноаминоксидазных систем и структур базальных ганглиев мозга при действии нейротоксина МФТП. Вопрос о роли МАО-зависимых реакций в формировании окислительного стресса в тканях мозга при различных патологических состояниях обсуждался неоднократно (Chiba et al., 1984; Cohen, 1984; 1985; Cohen et al., 1985; Tetrud, Langston, 1989; DATATOP, 1989; Gotz et al., 1990; Myllyla et al., 1992; Mitzuno, 1994; Halliwell, 1994; Bondy, 1995; Ebadi et al., 1995; Медведев, Типтон, 1997). Установлено, что основной причиной усиления разрушения дофамина в ядрах базальных ганглиев является пероксидный стресс, связанный с повышенной активностью МАО-B клеточных элементов нейроглии (Jonakait, 1994; Merrill, Jonakait, 1995). Повышенная активность глиальной МАО-B базальных ганглиев рассматривается в качестве основной патогенетической причины болезни Паркинсона. В этой связи ингибирование моноаминоксидаз можно рассматривать как один из возможных путей для предотвращения возникновения или развития этой патологии. Известно, что ингибирование МАО-А увеличивает уровень серотонина в мозге, а ингибирование МАО-B и, в меньшей мере, МАО-А повышает содержание дофамина (Рамсэй, 1977). На этом, в частности, основано применение ингибиторов МАО-B в лечении идиопатической формы болезни Паркинсоназаболевании, при котором страдает в первую очередь дофаминэргическая система. Естественно, что в терапевтическом плане сказанное имеет смысл, если такое ингибирование не только сопровождается сохранением запасов дофамина (дофаминсберегающий эффект), но также происходит на фоне сохранения интактности и/или функциональной активности дофаминовых рецепторов.

В предыдущем разделе нами были продемонстрированы эффекты угнетения активности МАО-B в базальных ганглиях — основной подкорковой структуре мозга, ответственной за консолидацию функций ассоциативных и двигательных областей коры головного мозга. Было также показано, что эндоназальные аппликации экзогенного супероксида и/или пероксида водорода способны предотвращать или даже компенсировать патологические изменения, вызванные действием резерпина — алколоида, долгое время остававшегося единственной доступной фармакологической моделью симптомокомплекса паркинсонизма (Nagai et al., 1985; Zhang, Piantadosi, 1991; Montastruc et al., 1997). Одной из современных экспериментальных моделей паркинсонизма у животных является экспериментальная патология, вызванная введением нейротоксина МФТП (1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин). Было показано, что механизм повреждающего действия МФТП связан с образованием в МАО-зависимом метаболизме МФТП радикала МРР+ - метаболита, являющегося собственно нейротоксином и играющего ведущую роль в разрушении дофаминэргических нервных элементов базальных ганглиев. В настоящее время экспериментальная патология, вызванная введением животным нейротоксина МФТП, является одной из наиболее полно изученных моделей в нейротоксикологии. У обезьян МФТП вызывает разрушение серотонинэргических нейронов голубого пятна, возникновение в черной субстанции образований, сходных с тельцами Леви, обнаруживаемыми postmortem в тканях мозга у паркинсоников, а также развитие характерных нарушений двигательной функции (Forno L. et al., 1993). В отличие от обезьян, у грызунов МФТП не вызывает характерных изменений моторики в виде тремора и ригидности. При этом, однако, в полной мере обнаруживаются такие патологические изменения, как гибель нейронов в черной субстанции и стриатуме, а также нарушение поведенческих реакций и развитие признаков депрессивного поведения. На основе экспериментальных данных, полученных в исследованиях МФТП, была сформулирована гипотеза нейропротекторной роли ингибиторов МАО (Рамсэй, 1977).

С применением МФТП — модели нейротоксических повреждений у крыс нами было изучено &bdquo-профилактическое" и &bdquo-терапевтическое" действие эндоназальной аппликации пероксида водорода. Использовали стабилизированный раствор пероксида водородастабилизаторы — разбавленные растворы бензойной кислоты и ЭДТА (ЕСЕТОС, 1992).

Эксперименты выполнены на 60 самцах белых нелинейных крыс. Все животные были распределены на 6 исходно равных групп в соответствии с дизайном исследования, представленном в таблице 25.

Таблица 25. Дизайн исследования влияния эндоназальных аппликаций препарата, содержащего пероксид водорода, на развитие нейротоксических эффектов МФТИ у крыс.

Для оценки исходной двигательной и ориентировочно — исследовательской активности животные за сутки до введения препаратов тестировались в «открытом поле». Показателиисходной двигательной и ориентировочно — исследовательской активности животных представлены в таблице 26.

Таблица 26. Показатели поведенческих реакций крыс в тесте «открытое поле» .I: исходные данные, до введения препаратов Величина пробега Количество стоек Переев е за 30- 120 с за 30 — 120 с ходы ьн ие, а и, о го о чо о СТ о <�ч Всего о т о чо о 0 о с4! Всего ЛП I II я >>л ц о э- 25,5 15,0 12,4 11,4 64,3 3,0 2,5 3,4 2,5 11,4 1,9 1,6 0,3 3,2я о ±2,1 ±2,0 ±1,5 ±2,3 ±6,0 ±0,5 ±0,6 ±0,3 ±0,5 ±1,4 ±0,3 ±0,6 ±0,2 ±-0,7Плацебо 25,8 18,5 12,6 9,0 65,9 3,6 2,6 2,9 1,7 10,8 2,5 2,2 0,7 4,2±2,4 ±2,5 ±1,8 ±1,8 ±6,0 ±0,6 ±0,5 ±0,3 ±0,3 ±1,1 ±0,5 ±0,4 ±0,2 ±-0,6л о 5 а 25,0 15,2 12,8 14,2 67,2 4,3 2,7 2,1 2,7 11,8 2,0 1,6 0,6 1,7а, и С ±1,5 ±1,8 ±1,6 ±1,6 ±4,1 ±0,6 ±0,4 ±0,4 ±0,4 ±1,4 ±0,6 ±0,5 ±0,2 ±-0,6МФТП 25,0 15,1 14,3 10,9 65,3 3,2 2,6 2,3 2,6 10,7 1,9 2,3 0,5 2,3±3,2 ±2,2 ±2,3 ±2,2 ±8,6 ±0,5 ±0,5 ±0,6 ±0,5 ±1,0 ±0,5 ±0,7 ±0,2 ±-0,7•в- 25,3 14,1 12,1 10,9 62,4 3,2 2,4 1,6 2,0 9,2 2,3 2,5 0,7 2,7о & С ±1,5 ±2,0 ±1,5 ±1,1 ±4,4 ±0,6 ±0,5 ±0,3 ±0,4 ±1,2 ±0,4 ±0,7 ±0,2 ±0,7*" к я о 28,0 13,4 12,8 10,0 64,2 3,5 2,7 1,7 1,7 9,6 2,2 0,9 0,2 2,2x и р ±1,7 ±1,7 ±2,1 ±1,8 ±5,0 ±0,7 ±0,3 ±0,5 ±0,3 ±1,0 ±0,4 ±0,2 ±0,1 ±-0,8Обозначения: ЛП = латентный период выхода из центра арены в открытое полеПереходы Iчисло отходов от стенки ареныПереходы II — число выходов в центр ареныГруминг = число умываний.

Через сутки после введения препаратов животные повторно тестировались в «открытом поле». Кроме того, для изучения ориентировочно-исследовательской активности животных в новых экспериментальных условиях крысы тестировались также в «норковой камере». Поскольку у животных контрольных групп («контроль» и «плацебо») через сутки после воздействий в обоих использованных тестах — открытом поле и норковой камерене было отмечено достоверных отличий в параметрах поведения (см. таблицы 27 и 28), вдальнейших расчетах эти данные были объединены в группу «суммарный контроль» с числом животных п = 20.

Таблица 27. Показатели поведенческих реакций крыс в тесте «открытое поле» после эндоназальных аппликаций пероксида водорода. II: через сутки после введения препаратов.

СЗ Величина пробега за 30−120 с Количество стоек за 30−120 с Переходы ГрумингИ И >, Рк (-4 о го о ю о СТ о <�м Всего о со о о СТ о <�м Всего ЛП I II Л Ч О, а н 17,8 10,0 8,4 5,1 41,3 1,5 0,9 1,1 2,5 4,6 2,8 1,0 0,5 1,0к о «±2,2 ±2,2 ±2,0 ±1,5 ±6,4 ±0,2 ±0,3 ±0,3 ±0,5 ±0,6 ±0,7 ±0,5 ±0,4 ±-0,5о ю <�и в 14,1 10,9 8,7 9,9 43,6 0,9 1,4 0,8 1,7 4,4 1,8 1Д 0,5 1,1а ч С ±2,3 ±2,6 ±1,8 ±1,9 ±6,8 ±0,3 ±0,3 ±0,2 ±0,3 ±0,7 ±0,4 ±0,4 ±0,3 ±-0,4Таблица 28. Показатели поведенческих реакций крыс в тесте «норковая камера» после эндоназальных аппликаций пероксида водорода. II: через сутки после введения препаратов.

Величина пробега Количество стоек Количество норок Й д за 30- 120 с за 30- 120 с за 30- 120 с и мИ СХ и, о СО о чо о 0 о сч о и о о Д о со о чо о 0 о сч о и и о Д о со о чо о 0 о сч о и и о Д я >, а (-4>4 ч О? 9,6, 7,7 6,8 4,4 28,5 2,0 2,5 2,5 1,9 8,9 3,3 4,4 3,8 3,2 14,7 3,1И о ±0,4 ±0,7 ±0,8 ±0,9 ±2,5 ±0,3 ±0,5 ±0,5 ±0,4 ±1,2 ±0,8 ±0,7 ±0,5 ±1,0 ±1,7 ±-1,2И о ю <�и Щ 10,5 8,0 6,6 4,8 29,9 3,0 2,6 2,5 2,1 10,2 4,6 5,4 4,2 3,9 18,1 3,4ей ч с ±0,8 ±0,6 ±0,7 ±0,9 ±1,8 ±0,4 ±0,4 ±0,3 ±0,4 ±1,0 ±0,9 ±0,9 ±0,8 ±1,1 ±2,5 ±-0,8Изменения, зарегистрированные после введения МФТИ представлены в таблицах 29 и 30.

Таблица 29. Влияние эндоназальных аппликаций препарата на основе пероксида водорода на показатели поведенческих реакций крыс в тесте «открытое поле» .II: через сутки после введения препаратов.

Группа Величина пробега за 30- 120 с Количество стоек за 30−120 с ЛП Переходы Груминго СП о ЧО о ОЧ о С<1 1—I о и а> о «о СП о ЧО о о о о и <�и о „I II Суммарн контроль 16,0 ±1,6 10,5 ±1,7 8,6 ±1,3 7,5 ±1,3 42,5 ±4,5 1,2 ±0,2 1,2 ±0,2 1,2 ±0,2 1,0 ±0,2 4,5 ±0,4 2,3 ±0,4 1,1 ±0,3 0,5 ±0,2 1,1 ±-0,3Перекись 1 16,7 ±1,5 10,2 ±1,5 8,3 ±1,9 5,8 ±1,9 41,0 ±4,6 1,5 ±0,4 1,3 ±0,3 1,2 ±0,4 0,8 ±0,3 4,8 ±1,1 3,0 ±0,8 0,7 ±0,3 0,2 ±0,1 0,6 ±-0,3МФТП 10,9 ±2,5 *) 5,3 ±1,5 *) 3,9 ±1,7 *) 3,0 ±0,9 *) 23,1 ±4,9 *) 1,2 ±0,4 0,4 ±0,2 *) 0,5 ±0,2 0,6 ±0,3 2,7 ±0,8 *) 5,0 ±1,7 *) 0,6 ±0,3 0,2 ±0,1 1,5 ±-0,7″ Профи лактика“ 15,9 ±2,2 11,0 ±1,7 7,0 ±1,5 8,2 ±1,6 42,1 ±3,8 1,3 ±0,4 1,1 ±0,3 #) 0,8 ±0,3 1,0 ±0,3 4,2 ±0,7 2,2 ±0,5 0,8 ±0,3 0,4 ±0,2 0,9 ±-0,4″ Лечение» 16,2 ±2,3 #) 7,7 ±1,5 6,1 ±2,0 5,2 ±1,5 35,2 ±4,5 #) 1,4 ±0,4 1,3 ±0,4 0,7 ±0,2 1,0 ±0,4 4,4 ±0,9 1,3 ±0,2 #) 0,7 ±0,4 0,4 ±0,2 0,6 ±-0,3Обозначения: *) р < 0,05 к контролю и") р < 0,05 к группе МФТП.

Как следует из приведенных данных, было показано, что эндоназальная аппликация пероксида водорода как до, так и после инъекции МФТП практически полностью компенсировала изменения двигательной активности и ориентировочной реакции. В частности, в группе крыс, получавших пероксид водорода до введения МФТП, величина пробега и количество стоек в «открытом поле» были достоверно выше, чем в группе с введением нейротоксинааналогичные изменения были отмечены также в тесте «норковая камера».

Введение

пероксида водорода после инъекции МФТП вызывает увеличение пробега и уменьшение латентного периода выхода из центра арены в тесте «открытоеполе», а также увеличение количества обследованных норок в «норковой камере» по сравнению с группой, получавшей только инъекцию нейротоксина.

Таблица 30. Влияние эндоназальных аппликаций препарата на основе пероксида водорода на показатели поведенческих реакций крыс в тесте «норковая камера» .II: через сутки после введения препаратов.

Группа Величина пробега за 30- 120 с Количество стоек за 30- 120 с Количество норок за 30- 120 с Груминго с<" 1 о о о сч т—1 о (-1 1) о т о СП о чо о о сч о (-1 и о т о сл о о о сч о (-1 и о СО Суммарный контроль 10,1 ±0,5 7,9 ±0,5 6,7 ±0,5 4,6 ±0,6 29,2 ±1,5 2,5 ±0,3 2,6 ±0,3 2,5 ±0,3 2,0 ±0,3 9,6 ±0,8 4,0 ±0,6 4,9 ±0,5 4,0 ±0,5 3,6 ±0,7 16,4 ±1,5 3,3 ±-0,7Перекись 9,9 ±1,1 7,4 ±0,8 5,7 ±0,6 5,3 ±0,6 28,3 ±2,4 2,7 ±0,6 2,8 ±0,3 2,2 ±0,6 2,4 ±0,6 10,1 ±1,6 3,8 ±0,5 4,9 ±0,7 4,1 ±0,7 4,3 ±1,0 17,1 ±1,7 1,5 ±-0,4МФТП 8,5 ±1,2 6,5 ±1,8 *) 5,3 ±0,9 *) 3,9 ±1,0 24,2 ±2,4 *) 1,8 ±0,4 1,8 ±0,5 *) 1,9 ±0,4 2,0 ±0,6 7,5 ±1,2 *) 2,7 ±0,6 3,9 ±0,6 *) 3,2 ±0,7 2,5 ±0,9 12,3 ±1,5 *) 1,2 ±0,7 *)" Профилактика" 11,6 ±1,3 8,1 ±1,2 6,0 ±0,6 5,4 ±1,6 31,1 ±3,8 2,7 ±0,4 2,1 ±0,5 2,0 ±0,4 1,7 ±0,5 8,4 ±0,8 3,1 ±0,9 4,6 ±1,0 #) 3,8 ±0,6 3,1 ±0,7 14,6 ±2,4 1,2 ±0,6 *)&bdquo-Лечение" 9,5 ±1,0 7,8 ±1,1 5,2 ±1,2 5,7 ±1,2 28,2 ±2,9 2,4 ±0,5 2,2 ±0,4 2,4 ±0,5 2,9 ±0,7 9,9 ±1,5 4,6 ±0,7 #) 5,2 ±0,9 2,5 ±0,7 2,8 ±0,7 15,1 ±1,9 0,5 ±0,4 *)Обозначения: *) р < 0,05 к контролю и #) р < 0,05 к группе МФТП.

При сравнении двигательной активности крыс «лечебной» и контрольной групп достоверных отличий отмечено не было. Параметры поведения животных «профилактической» и «лечебной» групп достоверно не отличаются, однако в «профилактической» группе несколько больше достоверных отличий от группы животных, получивших только нейротоксин. Следует отметить, что количество умываний в «лечебной» и «профилактической» группах ниже, чем в контроле. Вероятно, введение препарата не полностью компенсирует изменение эмоционального состояния животных, вызванное действием МФТП.

Содержание дофамина (ДА) и его метаболитов — дезоксифенилуксусной (ДОФУК) и гамма-ванилиновой (ГВК) кислот в стриатуме и в ткани среднего мозга у животных, получавших МФТИ, было достоверно ниже по сравнению со всеми контрольными группами (биохимическое определение дофамина и его метаболитов проведено Б. Коганом). Пероксид водорода в обоих способах применения достоверно компенсировал эти изменения в изученных регионах мозга (таблицы 31 и 32, рис 27).

Таблица 31. Влияние эндоназальных аппликаций препарата пероксида водорода на содержание ДА, ДОФУК и ГВК в стриатуме крыс, получавших нейротоксин МФТП. Значения округлены до целых, М ± т.

Таблица 32. Влияние эндоназальных аппликаций препарата пероксида водорода на содержание ДА, ДОФУК и ГВК в среднем мозге крыс, получавших нейротоксин МФТП. Значения округлены до целых, М ± т.

Группы животных Дофамин ДОФУК ГВККонтроль 474 ± 14 182 ±6 257 ± 12Плацебо 463 ± 17 199 ±9 257 ± 11″ Н202″ 575 ±21 280 ± 12 353 ± 10″ МФТП" 195 1−18**} 100 = б*" 0 110 ±-6**'" Профилактика" 399 ± 10##) 204 ± 19#) 209 ± 10#)" Лечение" 383 ± 22##) 170±9#) 225 ± 11#)Обозначения: = р < 0,001 по сравнению с группой «Контроль» -#) = р < 0,05 и i№) = р < 0,001 по сравнению с группой МФТП.

Морфометрический анализ ткани неостриатума у МФТП-обработанных животных, выполненный М. Аврущенко по методике, описанной в работах Аврущенко (1994), Аврущенко, Волков (1997) и ОитсЬ е1 а1. (1997), показал снижение общей плотности популяции нейронов на 23,5% при одновременном увеличении числа морфологически измененных нейронов на 32,5%. Характерно, что наиболее чувствительными оказались свободные нейроны (снижение на 25,1%, р < 0,005), тогда как популяция нейронов с сателлитной глией не претерпела изменений. &bdquo-Лечебное" применение препарата пероксида водорода полностью предотвращало развитие процессов функционального выпадения и морфологического изменения нейронов неостриатума. Обнаруженное в этой части работы вовлечение нейроглии в нейродегенеративные процессы согласуется с наблюдавшимися нами выраженными дистрофическими изменениями в глии гипофизарной области супероксид-депривированных животных. При &bdquo-профилактическом" применении препарат пероксида водорода проявлял морфологически менее выраженный нейропротекторный эффект, однако и в этом случае повреждения структур были выражены в значительно меньшей степени по сравнению с тем, что было отмечено у животных, получавших только МФТП (рис. 28 — 30).t f-л=и* *.

выводы.

1. Приведены экспериментальные доказательства идентичности общебиологических и физиологических эффектов С>2*~ воздушной среды и отрицательных аэроионов.

2. Разработан генератор отрицательно заряженных газовых ионов кислорода. С применением комплекса общепринятых биофизических и биохимических методов исследования показано, что в условиях первичной ионизации в коронном разряде кислорода и/или азота с последующим выдувом продуктов ионизации в кислород, в пуле отрицательно заряженных газовых ионов содержится продукт, по всем изученным показателям идентичный супероксидному анион-радикалу О2*. Авторские права на способ и устройства для генерации О2 в газовой фазе для исследовательских целей и терапевтического применения защищены двумя патентами.

3. Показано, что экзогенный супероксид обладает физиологической активностью при ингаляционном способе применения. СОД и каталаза, нанесенные на слизистую оболочку носовой полости в сочетании с экзогенным супероксидом, модифицируют эти физиологические ответызамена О2″ пероксидом водорода воспроизводит физиологическую активность супероксидного радикала. Физиологическая активность О2 и пероксида водорода при эндоназальных аппликациях проявляется на основных регуляторных системах организма, включая ВНД, нейротрансмиттерные системы мозга, эндокринную и иммунную системы.

4. Показано, что экзогенный супероксид проявляет адаптогенные свойства, повышая устойчивость организма к действию экстремальных интенсивностей различных физических и химических факторов. Адаптогенное действие О2*- реализуется на физико-химическом, биохимическом и физиологическом уровнях, включая процессы перекисного окисления липидов, механизмы антиокислительной защиты, моноаминэргические системы мозга, эндокринную регуляцию.

5. Впервые обнаружено, что О2* и Н2О2 при эндоназальном воздействии i) угнетают активность моноаминоксидаз МАО-А и МАО-B в гипоталамусе и базальных ганглиях мозга, активируя дофаминэргическую и серотонинэргическую нейротрансмиттерные системы и уменьшая уровень эндогенного окислительного стресса в этих структурах мозгаii) обладают нейропротекторным действием в моделях паркинсонизма, таких как нейролептическое действие резерпина и нейротоксическое действие МФТП и 111) активируют антиноцицептивные механизмы ЦНС, усиливая болеутоляющее действие анальгетиков различной природы.

6. Показано, что в условиях непрерывной депривации атмосферного супероксида у экспериментальных животных развиваются патологические нарушения в подкорковом гипоталамо-гипофизарном комплексе, обнаруживаемые в форме структурных изменений в нейрои аденогипофизе и являющиеся причиной нарушения физиологических функций и гибели животных. Патогенное действие депривации может быть предотвращено введением в воздушную среду экзогенного Ог*. Эти данные подтверждают нашу гипотезу о жизненно важной роли атмосферного супероксида для реализации основных жизненных функций у млекопитающих в норме.

7. В клинических исследованиях впервые показана терапевтическая активность эндоназальных воздействий Ог" - и Н2О2 у человека: г) при лечении болезни Паркинсона и лекарственного паркинсонизма- 11) в модели экспериментальной боли и 111) при лечении атопической формы бронхиальной астмы. Первые два способа защищены патентами.

8. Выдвинута гипотеза о роли Ог*" и Н2О2 абиотического происхождения в эволюции клетки, а также изложены новые представления о роли рецепторов слизистой оболочки носовой полости в рецепции и реализации на уровне организма регуляторного действия этих активированных форм кислорода.

IV. МЕТОДИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РАБОТЫ.

Решение поставленных задач потребовало привлечения широкого набора современных экспериментальных методов биофизики и биохимии, модернизации и существенного дополнения ряда из них, а также разработки принципиально новых методов исследования. Для исследования физико-химических свойств и биологической активности экзогенного супероксида возникла необходимость в разработке специальных методов, позволяющих достаточно избирательно и стабильно генерировать радикал 0-i~ в газовой фазе. В диссертационной работе приведено описание устройства и параметры разработанной и изготовленной нами инжекционной ячейки для генерирования и исследования химической активности О2*- газовой фазы, а также описание и принцип работы ингалятора — генератора супероксида для медико-биологических исследований.

Для исследования биологической роли и жизненной потребности в естественных уровнях атмосферного супероксида были разработаны и изготовлены специальная депривационная камера для животных с электростатическим улавливанием и нейтрализацией электрически заряженных частиц из вдыхаемого воздуха и однотипная по конструкции камера для контрольных животных, обеспечивающая сохранение нормальных уровней атмосферных газовых ионов. Мониторинг аэроионов осуществляли с помощью анализатора аэроионов САИ-ТГУ-ббмдля определения содержания аммиака и СО2 внутри камер применяли соответствующие газоаналитические трубки и прибор «Pump-Automat accuro 2000» фирмы Drager (Германия).

Были существенно усовершенствованы методы оценки биофизических и физиологических показателей экспериментальных животных. В частности, были разработаны и изготовлены высокочувствительный хемилюминометр, электронные приборы и устройства для определения суммационно-порогового показателя и автоматической регистрации поведенческих реакций, барокамера для экспозиции мелких лабораторных животных при избыточном давлении (до 4 ати) кислорода, электростатически нейтральные «домики» для проведения индивидуальных ингаляций супероксида у крыс и выносные электроды — источники супероксида для воздействия на животных в группе. Специальные устройства были изготовлены также для проведения исследований на микроорганизмах.

Из серийных приборов и устройств в работе использовали спектрофотометры Hitachi 150−20, Shimadzu UV-2101 PC, Beckman-35, фотоэлектроколориметр Model 257 (Ciba-Corning), ЭПР спектрометр РЭ 1307, Randall-Selitto анальгезиметр (Ugo Basile), аппарат ламинарного потока воздуха Hera Safe (Heraeus instruments), аппарат для мониторинга атмосферного воздуха DCH 24 Т (Air Flow, Germany), электронный микроскоп JEM IOOK, гелий-неоновый лазер с полосой испускания 632,8 нм. В клинических исследованиях для исследования параметров дыхательной функции у человека использовали аппараты Pneumoscreen (Erich Jaeger) и Spiro 501 (Bosch).

Объектами исследований служили лабораторные крысы (беспородные и линии Вистар), мыши (беспородные, С57ыаск: и СЗН), морские свинки, а также штаммы микроорганизмов Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, E. coli, Bacillus subtilis, Bacillus mesenthericus, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoneae, Pseudomona aeruginosa, Salmonella typhimurium, Candida albicans. В медико-биологических исследованиях принимали участие практически здоровые добровольцы обоего пола, а также больные с симптомокомплексом паркинсонизма и бронхиальной астмой.

В биохимических и физиологических исследованиях использовали широкий набор реактивов и методов для генерации и ингибиторного анализа супероксида и синглетного кислорода (СОД, каталаза, тетранитрометан, цитохром с, ксантиноксидаза, ксантин, нитросиний тегразолиевый, хлорофиллы, каротиноиды, эозин, азид натрия, 1,4-диазобицикло{2,2,2}октан) и исследования перекисного окисления липидов (определение ТБК-активных продуктов, диеновых конъюгатов), а также лекарственные и биологически активные вещества (фенобарбитал, закись азота, элеутерококк, наркотические и ненаркотические анальгетики, ниаламид, налоксон, резерпин, нейротоксин 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин и др.).

Далее в этом разделе приведены подробные описания методов, разработанных специально для целей данного исследования, а также описанных в литературе и измененных нами в соответствии с поставленными задачами и условиями проведения экспериментов. Методы, использованные без изменений, приведены в виде ссылок.

Затравка животных экзогенным супероксидом. Воздействие экзогенным газообразным супероксидом на лабораторных животных (крысы, мыши) осуществляли путем ингаляции.

В токсикологических экспериментах животные каждой группы были размещены в закрытых стеклянных сосудах объемом 250 л. Подача газов — экзогенного супероксида или кислорода — осуществлялась через несколько отверстий в крышках камерскорость подачи газов составляла 100 мл мин" 1. Выход газов из камеры происходил естественным путем через вентиляционные отверстия. Для удаления водяных паров и избытка углекислоты использовали поглотители. Скорость генерирования экзогенного супероксида, измеренная по восстановлению нитросинего тетразолиевого и цитохрома с составляла во всех экспериментах 0,2 — 0,3 мкМ мин" 1. Животные размещались на приподнятом основании камеры, максимальное расстояние от источника супероксида до головы животного составляло 5 — 8 см. Образование озона, измеренное с применением аналитических трубок 6 733 181 фирмы Эгадег (Германия) не превышало во всех случаях 0,05 ррт мин" 1.

Для исследования токсичности экзогенного супероксида при ингаляционном способе воздействия были использованы следующие методы:

1. Оценка общего вида и состояния животных, изменений массы тела.

2. Исследование поведенческих показателей в «открытом поле».

3. Исследование суммационно-порогового показателя.

4. Для характеристики дыхательной функции, состояния легких, верхних дыхательных путей и носоглотки регистрировали частоту дыхания, исследовали качественный и количественный состав лаважа из верхних дыхательных путей. Анализ клеточного состава смывов из дыхательных путей проводили по методу, описанному в работе Комовникова и Быковского (1970).

5. Функциональное состояние печени оценивали по показателям активности аланини аспартатаминотрансфераз (набор «Ьас1гета» Чехия), коэффициенту де Ритиса, содержанию щелочной фосфатазы, холестерина, глюкозы (наборы фирмы «Копе», Финляндия), тимоловой пробы (набор фирмы «Ьас1гета», Чехия), общий белок рефрактометрическим методом, белковые фракции — альбумины, бетаи гаммаглобулины (см. Каспаров, Саноцкий, ред., 1986), гексеналовой пробы (Елизарова, 1971).

6. Функциональное состояние почек оценивали по показателям 24-часового диуреза, рН мочи, содержания мочевины в моче и сыворотке крови, а также кетоновых тел, восстанавливающих веществ, уробилиногена, глюкозы и белка (наборы «Ьас1гета» Чехия).

7. Параметры и тесты оценки функционального состояния нервной системы: СПП (Сперанский, 1975), спонтанная горизонтальная и вертикальная активность и безусловный норковый рефлекс, эмоциональная лабильность, груминг (Метод. Указания, 1984), ректальная температура (измерена термометром ТЕМП-4).

8. Иммунологический статус исследовали по показателям массы и коэффициента массы иммунокомпетентных органов (тимус, селезенка), числа Т-лимфоцитов в тимусе и в селезенке, числа Влимфоцитов в селезенке.

9. Исследование параметров периферической крови включало следующие показатели: число лейкоцитов, дифференциальная картина крови, число эритроцитов, уровень гемоглобина, осмотическая устойчивость эритроцитов (Неменова, 1972).

10. После третьего месяца воздействия часть животных была декапитирована и было проведено микрои макроскопическое патолого-анатомическое исследование внутренних органов (трахея, бронхи, сердце, легкие, тимус, печень, селезенка, надпочечники, мозг, а также роговая оболочка глаза, и слизистая оболочка носа. Было проведено также определение массовых коэффициентов внутренних органов. Статистическая обработка проведена с применением 1>теста по Стьюденту.

В остальных экспериментах, если это не описано особо, животных размещали индивидуально в лабораторных «домиках», к головной части которых подводился экзогенный супероксид или неионизированный кислород. Во избежание нейтрализации заряда на поверхности «домиков», последние были изготовлены из дерева (фанеры). Скорость подачи газа составляла обычно 100 мл мин" 1, расстояние от сопла до носа животного составляло 1,5−2 см.

Затравка животных отрицательными аэроионами. Затравочные камеры и «домики» не отличались от описанных выше. Отрицательные аэроионы генерировали в серийных аэроионизаторах (ионизатор «Визма» и др.) или в аэроионизаторе собственного изготовления. Основные отличия бытовых ионизаторов от генераторов супероксида заключались в применении общепринятой конструкции катода, в ионизации воздуха и в отсутствии выведения из зоны ингаляции побочных продуктов ионизации газов.

Исследование токсичности пероксида водорода в хроническом эксперименте.

Целью исследования явилось изучение параметров хронической токсичности антипаркинсонического средства на основе перекиси водорода в концентрации 10″ 5 М при эндоназальном введении белым беспородным крысам в течение двух месяцев. Препарат вводили в суточных дозах 50, 500 или 1000 мкл/кг массы тела животных. При этом минимальная суточная доза для крыс превышала эквитерапевтическую в восемь раз, максимальная — в 160 раз.

Затравка животных в условиях депривации. Для обеспечения максимально возможной деионизации воздуха, нами была разработана и изготовлена экспериментальная камера объемом 210 л с непрерывной элиминацией всех заряженных частиц из поступающего извне воздуха и внутренней воздушной среды. Для достижения наиболее полной элиминации заряженных частиц, образующихся внутри камеры за счет неустранимых естественных источников ионизации, все элементы экспериментальной камеры (корпус, кормушка и др.) были изготовлены из сильно поляризующегося материала (органическое стекло). Электростатический способ нейтрализации зарядов был также использован для элиминации аэроионов из поступающего в камеры воздуха. В этих целях элементы крышки камеры (две перфорированные пластины и расположенные между ними лопасти вентилятора) также были целиком изготовлены из органического стекла. Для животных контрольной группы использовали камеру аналогичных размеров и конструкции, изготовленную из обычного стекла с подвижными частями (кормушка, и т. д.) и крышкой из дерева. Для обеспечения идентичности минорных компонентов среды, в камеру для контрольных животных был помещен отсек, содержащий стружку органического стекла. Обе камеры располагались на заземленной поверхности на одинаковом расстоянии от пола и стен. Объем воздуха, нагнетаемого в каждую из камер, составлял 1,5 л •мин" 1. Все манипуляции по уходу за животными, чистка камер и удаление трупов погибших животных осуществлялись без доступа в камеры необработанного атмосферного воздуха. Пары воды, углекислота и избыток аммиака удалялись через вентиляционные отверстия в корпусе и поглотителями, контроль за их содержанием осуществляли с помощью полуаналитических трубок фирмы Ога§ ег (Германия). Температура воздуха и относительная влажность в камерах составляли, соответственно, 21 ± 2 °C и 75% - 80%. Спустя двенадцать часов после размещения животных в камерах, концентрация СОг стабилизировалась на уровне 0,16 ± 0,03 об% в камере из органического стекла и 0,17 ± 0,04 об% в камере из силикатного стекла (среднее значение из 5 экспериментов). Соответствующие значения для аммиака составили 7,2 ± 0,6 ррм и 7,2 ± 0,7 ррм. Все показатели оставались на протяжении всего эксперимента практически неизменными. Контроль аэроионного состава осуществлялся спектрометром ионов САИ-ТГУ-ббм (производство Тартусского госуниверситета, Эстония). Спустя четыре часа после размещения животных, в камере из органического стекла отрицательные ионы не детектировалиськонцентрация «медленных» («тяжелых») положительных воздушных ионов, а составляла 77 ± 18 см". В камере из силикатного стекла концентрации аэроионов о составляли, соответственно, 482 ± 128 и 660 ±148 см" и незначительно отличались от соответствующих значений окружающего воздуха. В нескольких независимых сериях экспериментов было использовано около 160 беспородных мышей и 42 крысы (беспородные и Вистар). В экспериментах одномоментно в каждой камере содержались не более 14 мышей или 7 крыс. При определении продолжительности жизни в условиях депривации животные из клеток не изымались на протяжении всего эксперимента. В других случаях, например при исследовании физиологических параметров, изъятых животных обратно в клетки не возвращали.

Определение суммационно — порогового показателя (по С. В. Сперанскому, 1975). Суммационно — пороговый показатель (СПП) является высокочувствительным интегральным методом исследования функционального состояния ЦНС. Метод нашел широкое применение в биомедицинских исследованиях, особенно в токсикологических исследованиях веществ, действующих на ЦНС. При определении СПП используется линейно нарастающий импульсный ток с частотой следования 2 импульса в секунду. Пределы напряжения лежат от 0 до прибл. 30 вольт. Для исследования СПП были использованы в первоначальных сериях исследований серийный импульсатор ИСЭ-1 или, в последующих экспериментах, специально разработанный и изготовленный компактный генератор импульсов с автоматическим нарастанием подаваемого напряжения и упрощенной регистрацией рефлекторной реакции.

Порядок определения СПП заключается в размещении животного (мышь, крыса) на горизонтальные металлические обернутые марлей и обильно смоченные физиологическим раствором электроды в свободной (без фиксации) позе таким образом, что обе передние лапы находятся на одном электроде, а обе задние — на другом. После успокоения животного включают импульсатор и регистрируют величину напряжения (в вольтах) в момент отдергивания одной из передних лап. В каждый опыт брали по 5 животных, что при небольшой продолжительности каждого измерения (около 15 сек) позволило уменьшить влияние интервала времени между окончанием ингаляции и измерением показателя у последнего животного. Отбор обработанных животных для измерений во всех случаях был случайным, при этом сотрудник, непосредственно проводящий измерения, не был ознакомлен со схемой маркировки животных, что значительно уменьшало субъективный момент в оценке реакции.

Методы определения болевой реакции.

Исследования на животных. а) Тест давления на заднюю лапу (тест Рандалл-Селитто: Khasar et al., 1995; Ouseph, Levine, 1995). В тесте определяется величина критического давления (ВКД) на заднюю лапу крысы. Метод был применен в следующей модификации: Определения проводили с помощью анальгезиметра фирмы «Ugo Basile» (Италия). При проведении теста заднюю лапу животного помещают на небольшую подставку-диск. Сверху на лапу (в центре стопы) опускают пластмассовый конус, жестко связанный с направляющим стержнем прибора. На стержень нанесена шкала, деления которой служат для измерения ВКД в относительных единицах. После включения прибора по направляющему стержню начинает перемещаться грузик с равномерной скоростью 1 деление/секпри этом давление вершины конуса на поверхность лапы равномерно нарастает. В момент возникновения болевых ощущений животное отдергивает лапу. Момент отдергивания лапы регистрируется оператором в единицах условной шкалы. Во всех экспериментах на животных, описанных в этой работе, 1 условная единица длины соответствовала увеличению давящей нагрузки на 20 г. Для определения исходной ВКД проводили 3 измерения ноцицептивной реакции у каждого животного с интервалом 5−10 минут, затем полученные данные усредняли по каждому животному отдельно. В ходе эксперимента измерение болевой чувствительности проводилось каждые 30 минут в течение 3−3,5 часовмомент первого измерения отмечен на графиках.

Оценка результатов: Процент изменения болевой чувствительности рассчитывали по формуле:

ВКД э, j — ВКД э, о) — (ВКД к, i — ВКД к, о) / ВКД к, j х 100%, где ВКДэ, о и ВКДк, о — исходные значения ВКД, соответственно, в экспериментальной и контрольной группахВКДЭ, 1 и ВКДК1 — ВКД в этих группах в i-й момент времени. При статистическом анализе оценивались средние значения и стандартные отклонения в каждой временной точке для каждой группы отдельно. Затем определялась значимость изменений ВКД в той или иной группе по отношению к собственному исходному уровню, а также по отношению к изменениям ВКД в других группах и в контролях с использованием соответствующих непараметрических методов (Манна-Уитни, Фишера). б) Формалиновый тест (впервые описан Dubuisson, Dennis, 1977; с модификациями по Abbott et al., 1995). Представляет собой один из наиболее широко используемых тестов сильной продолжительной соматической боли. Оценка реакции в этом тесте осуществляется по отдельным поведенческим показателям болевой реакции (поднятие, облизывание и прижимание поврежденной лапы к телу, и др.) или по их комбинации. В наших исследованиях в качестве параметра уменьшения болевой реакции до переносимого уровня использовали период времени от введения болевого агента (3%-ный раствор формалина субплантарно) до опускания лапы, регистрируя первый момент соприкосновения поврежденной лапы с полом клетки. В наших условиях вариабельность этого показателя без применения анальгетиков составляла 7,6 ± 3,3%. Каждое животное подвергалось тестированию только один раз. При статистическом анализе оценивались средние значения и стандартные отклонения для каждой группы отдельно. Затем определялась значимость изменений продолжительности болевой реакции в той или иной группе по отношению к изменениям в других группах и в контролях. в) Метод исследования висцеральной боли (корчи) описан в работах Tsang et al. (1998) — Sheardown et al. (1997). Метод использован без видоизменений.

Исследование на добровольцах.

Исследование проведено по двойной слепой методике с применением плацебо-препаратов и плацебо-ингаляторов. Работа выполнена на 12 добровольцах мужского и женского пола (6/6) в возрасте от 20 до 49 лет. Источником экзогенного супероксида служил медицинский ингалятор pro-inhal® (Германия). Скорость генерирования супероксида, измеренная на расстоянии 2 см от электрода, составляла 0,25 ± 0,06 мкМ мин" 1 при 18−20°С и относительной влажности воздуха 65−70%. Болевой стимул создавали дозированным сдавливанием мизинца левой руки. Болевую чувствительность измеряли анальгезиметром фирмы «Ugo Basile» (Италия). Определяли величины порога появления болевых ощущений (ППБО) и порога переносимости боли (ППБ), о достижении которых испытуемый устно сообщал экспериментатору. Значения порогов оценивали в условных единицах прибора. В этих исследованиях 1 условная единица была равной увеличению давящей нагрузки на 60 г.

В начале каждого тестирования у испытуемого определялся исходный уровень ППБО и ППБ. Затем начинали ингаляцию, продолжавшуюся 30 минут. В середине этого периода испытуемый перорально получал один из анальгетиков или соответствующее плацебо. Расчетные дозы препаратов составляли приблизительно 0,5 от анальгетически активных разовых доз, назначаемых при болевых синдромах. Сразу после окончания ингаляции возобновлялись измерения ППБО и ППБ, продолжавшиеся далее в течение 3-х часов с интервалом в 30 минут. Тестирование каждого испытуемого проводилось не чаще 1-го раза в неделю. Статистическая обработка результатов осуществлялась аналогично описанной для данного теста выше.

Поведенческие реакции животных. Исследовали с применением методов, описанных в Методических указаниях по изучению поведенческих реакций. М., 1984.

Морфометрический метод гистологического исследования мозга крыс в условиях воздействия МФТП и препарата на основе пероксида водорода проводили по методике, описанной в работах Аврущенко (1994) — Аврущенко, Волков (1997), Gurvitch et al. (1997).

Электронно-микроскопические исследования гипофиза депривированных крыс исследовали по методу, описанному в работе Arshavskaya-Popovich et al. (1985).

Биохимические и физико-химические методы.

Содержание дофамина и продуктов его метаболизма в подкорковых структурах мозга определяли с применением высокоэффективной хроматографии с добавлением ион-парного компонента в подвижную фазу (гептансульфоновая кислота) в концентрации 0,5 — 2 мМ. Для разделения кислых метаболитов катехоламинов использовали высокоэффективный жидкостной хроматограф: насос модели 880PS фирмы Jasso (Япония), колонка-сферисорб ODS-2, длина 15 см, внутр. диаметр 4,6 мм, размер частиц — 5 нм, фирмы Alltech (США), электрохимический детектор LC-48 BAS. Время выхода ДА — 7,2 — 7,8 минут, ДОФУК — 8,3 — 8,6 минут, время выхода ГВК от 9 до 12 минут. Скорость протока фазы 1,6−1,8 мл/мин.

Исследование продуктов перекисного окисления липидов (МДА, конъюгированные диены) определяли по методам, описанным в работе Aust (1987).

Обмен глутатиона в тканях (кровь, мозг) исследовали с применением методов, описанных в работах Hudges et al. (1990), Carlberg, Mannervik, 1985; Gunzler, Flohe, 1987.

Супероксиддисмутазную активность крови и плазмы крови определяли по методам, описанным в работах Marklund (1990) Geller, Wink, 1983; Fridovich (1987).

Каталазную активность крови определяли по Aebi (1984).

Продукты восстановления нитросинего тетразолиевого определяли по методам, описанным в работах Auclair, Voisin, (1987а, б).

Активность моноаминоксидаз тканей мозга определяли по методу, описанному в работе Балаклаевского (1976).

Статистическая обработка результатов проводилась с применением программ SPSS (версия 6.1 для Microsoft Windows) и STATISTIKA. Основные методы статистической оценки включали t-тест Стьюдента, U-тест Манна-Уитни, тест Фридмана, %2 — тест, определение коэффициентов корреляции по Пирсону.

III.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

И ВЫВОДЫ.

Существование заряженных газовых частиц, ответственных за электрическую проводимость атмосферы, было предсказано лордом Kelvin в 1860 году и обнаружено Elster, Geitel в 1899 г. и Wilson в 1900 г. Первые систематические и обширные исследования биологической активности атмосферных газовых ионов (аэроионов) были проведены Чижевским (1919 — 1960). Им была впервые продемонстрирована роль заряда иона и доказано биологически и терапевтически благоприятное действие отрицательных аэроионов. В середине 30-х годов Чижевским и Васильевым была выдвинута гипотеза «органического электрообмена», призванная объяснить биологическую активность аэроионов, в первую очередь несущих отрицательный заряд, их электрическим взаимодействием с рецепторами поверхности тела, а также через легочную ткань с клеточными и коллоидными структурами крови (Васильев, Чижевский, 1933). Эти представления были впоследствии положены в основу &bdquo-теории органического электрообмена", в которой главная роль в биологических эффектах аэроионов отводилась исключительно заряду этих частиц. Позднее справедливость этой теории многократно подвергалась обоснованным сомнениям, и она, в конечном итоге, была признана несостоятельной для объяснения большинства известных и продолжавших накапливаться новых экспериментальных данных (Скоробогатова, 1991). Продолжающиеся в течение последующих десятилетий исследования в этой области имеют чисто эмпирический характер и не объединены общими физико-химическими представлениями о природе действующего начала биологически благоприятных отрицательных аэроионов. Остаются также малоизученными биохимические и физиологические механизмы взаимодействия этих частиц с биологическим субстратом. Серотониновая гипотеза (Krueger, Smith, 1960), являющейся рабочей гипотезой по настоящее время, не в состоянии объяснить ни одного из эффектов аэроионов, наблюдавшихся у низших животных, микроорганизмов и растений, а также значительную часть наблюдений на млекопитающих и человеке. В то же время, в этих представлениях было впервые обращено внимание на вовлечение обмена нейромедиаторов в ответ на воздействие ионизированным воздухом.

Рассмотрение физических моделей процессов генерирования отрицательных аэроионов в атмосфере и отрицательных ионов в коронном разряде в кислороде позволило нам сделать предположение о том, что основным биологически активным продуктом, формирующимся в этих условиях, может быть анион-радикал кислорода С>2~. Проведенный цикл исследований физических, физико-химических и биохимических характеристик продукта ионизации кислорода, азотно-кислородных смесей и воздуха подтвердил идентичность свойств основного продукта ионизации этих газов в коронном разряде со свойствами супероксидного радикала кислорода, генерируемого специфическими ферментативными системами и возникающего гп vivo в процессах метаболизма. Эти результаты позволили нам обосновать вывод о газообразном супероксиде атмосферного воздуха как основном биологически активном действующем начале отрицательных аэроионов.

Биологическая значимость атмосферных аэроионов естественного происхождения неоднократно подвергалась сомнениям. Этому способствовали неудачные попытки обнаружения изменений метаболизма, а также нервных, эндокринных и других физиологических реакций при воздействии искусственными газовыми ионами в концентрациях, близких к встречающимся в естественных условиях и/или у практически здоровых организмов с устойчивым гомеостазом. Для ответа на этот вопрос нами был проведен цикл исследований влияния на экспериментальных животных полной, непрерывной и продолжительной депривации аэриоионов. Было показано, что у животных, помещенных в практически не содержащую электрических зарядов «безионную» среду, развиваются резко выраженные нарушения нейро-эндокринной регуляции в системе гипоталамус-гипофиз, являющиеся причиной гибели животных. Биологическая «запрограмированность» потребности организма млекопитающих в атмосферном супероксиде может облегчить понимание причин апоптоза, признаки которого были обнаружены нами в аденоцитах гипофиза депривированных животных. Кратковременное восстановление естественной воздушной среды, равно как обогащение воздуха газообразным супероксидом, предпринятые в первые сроки депривации, тормозили развитие необратимых изменений в нейрои аденогипофизе и предотвращали гибель животных. Эти результаты, полученные впервые в условиях строго контролируемого научного эксперимента, подтвердили наблюдения Чижевского в отношении отрицательных аэроионов и позволили сделать обоснованный вывод о жизненно важной роли газообразного супероксида атмосферного воздуха.

В ряде сравнительных исследований нами было показано, что воздействием на животных газообразным супероксидом и/или продуктом его дисмутации пероксидом водорода могут быть воспроизведены результаты, идентичные ранее описанным в исследованиях отрицательных аэроионов. В ряде случаев этот вывод был подтвержден прямыми сопоставлениями физиологических эффектов этих факторов. Далее, нами было показано, что как экзогенный супероксид, так и пероксид водорода при эндоназальной аппликации в состоянии активировать механизмы антиокислительной защиты и центральные механизмы нейроэндокринной регуляции. Этим можно объяснить установленное в работе адаптогенное действие ингалируемого супероксида, предотвращение или ослабление повреждающего действия физических и химических факторов (гипербарический и нормобарический кислород, аэроионная депривация, ксенобиотики, закись азота). Было показано, что ингаляции газообразного супероксида вызывают типичные для действия таких известных адаптогенов, как женьшень или элеутерококк, неспецифические общефизиологические реакции. К ним могут быть отнесены гипоталамус-зависимая активация надпочечников, такие ЦНС-зависимые ответы, как СПП и ориентировочно-поведенческие реакции. Впервые было показано, что ингалируемый супероксид при воздействии, предшествующем или совпадающем с действием других стрессоров, удлиняет стадию резистентности, обеспечивая более продолжительную и устойчивую жизнедеятельность в условиях действия стресс-агентов. Было также показано, что эти биологические ответы зависят от типологических характеристик животных, существенно различаясь у «активных» и «пассивных» особей. Был также обнаружен эффект уменьшения цитохром-Р-450-активности микросомной фракции печени крыс после повторных ингаляций супероксида, что может объяснить описанное ранее (Васильев, 1962) уменьшение токсичности ряда ксенобиотиков, развивающееся в после воздействия отрицательными аэроионами.

Представленные в диссертационной работе данные свидетельствуют о мультипотентности биологических эффектов газообразного супероксида. Это свойство присуще также эндоназально апплицируемому низкодозированному пероксиду водорода иобусловлено, в значительной мере, центральными механизмами действия этих факторов. К ним относятся, в первую очередь, активация допаминэргической и серотонинэргической нейромедиаторных систем, а также других нейрогуморальных и гормональных механизмов. В нескольких независимых сериях экспериментов были приведены физиологические и биохимические доказательства угнетения активности моноаминоксидаз регионов гипоталамуса и базальных ганглиев мозга. Здесь просматривается известная аналогия с центральным действием других ингибиторов МАО. Так, например, паргилин, известный ингибитор МАО, применяемый в качестве гипотензивного средства, является одновременно нейропротектором, защищая крыс от нейротоксических эффектов ГБО (Zhang, Piantadosi, 1991). Аналогичный защитный эффект мы наблюдали в условиях прекондиционирования животных экзогенным супероксидом. Более того, аналогично тому, как это неоднократно описано в литературе в отношении отрицательных аэроионов, ингаляции экзогенного супероксида проявляют выраженный гипотензивный эффект у больных с артериальной гипертензией (Goldstein etal., 1997).

В работе были также подтверждены представления о вовлечении и закономерностях изменений окислительного статуса и антиокислительных систем живых организмов, индуцированных различными стрессорами, а также показана возможность индукции антиокислительной защиты ингалируемыми активированными кислородными интермедиатами. Последнее нашло подтверждение в исследовании механизмов адаптогенного действия экзогенного супероксида у экспериментальных животных, а также в клинических исследованиях у больных бронхиальной астмой.

Общеизвестно, что эндогенные активированные формы кислорода обладают значительным повреждающим действием и могут быть вовлечены в этиологию и патогенез самых различных заболеваний (Halliwell, 1988). В этой связи закономерен вопрос о токсическом действии назально апплицируемого газообразного супероксида, а также первого стабильного продукта его дисмутации — пероксида водорода, проявляющего при эндоназальной аппликации сильно разбавленных растворов аналогичную биологическую активность. Ответ на этот вопрос мог иметь также первостепенное значение для принятия решения о проведении клинических исследований с целью сопоставления терапевтической эффективности газообразного супероксида и отрицательных аэроионов. Токсикологические исследования газообразного супероксида и низкодозированного переоксида водорода при их назальной ингаляции и/или аппликации не выявили признаков общетоксического, а также выраженного раздражающего действия на слизистые носовой полости, дыхательных путей и конъюнктиву глаза. Эти результаты могут найти объяснение с позиции известных данных о хорошей защищенности слизистых, вступающих в прямой контакт с окружающей воздушной средой. Так, слизистая оболочка носовой полости содержит значительные количества восстановленного глутатиона (Peden et al., 1991), проявляет высокую Cu, Zn-COfl, МпСОД (Sakai et al., 1993), а также каталазную (Halliwell, 1988) активности, что, в частности, может отражать эволюционно обусловленное приспособление к обитанию в супероксид-содержащей воздушной среде.

Терапевтическое применение отрицательных аэроионов наиболее подробно было исследовано у больных бронхиальной астмой. В большинстве случаев авторы сообщают о высокой эффективности этого лечебного фактора (Булатов, 1962; Palti et al. 1966; Jorde, Schata, 1979). Принимая во внимание воспалительную природу гиперреактивности бронхов у астматиков, а также с учетом выявленных нами адаптогенных свойств супероксида, реализуемых, в частности, путем восстановления нормального баланса окислительных и антиокислительных процессов, обнаружение терапевтической эффективности газообразного супероксида у больных бронхиальной астмой могло не только служить подтверждением общности воздействующего в обоих случаях фактора, но также найти применение в целенаправленном развитии и/или совершенствовании приборов и методов для лечения этого заболевания. В работе была выявлена однотипность позитивных клинических изменений у больных бронхиальной астмой, получавших ингаляции газообразного супероксида с описанными в литературе результатами, полученными при ингаляциях отрицательных аэроионов. Было также показано, что улучшение общего состояния, легочных функций и клинических показателей крови у больных бронхиальной астмой после курсовых ингаляций супероксида может являться следствием нескольких механизмов. Один из них может быть связан с тренировкой окислительного статуса больных. Основная роль здесь может принадлежать электрически нейтральному пероксиду водорода, ничтожно малые количества которого, образующиеся в результате спонтанной дисмутации супероксида, могут проникать в глубокие отделы бронхиального дерева. Этот же продукт может стимулировать выведение из регионального кровотока медиаторов воспаления. Принципиальная возможность вовлечения в этот процесс клеток АР1ГО-системы бронхо-легочного отдела была продемонстрирована в исследованиях на животных. Наконец, в работе была показана активация газообразным супероксидом центральных нейрогуморальных регуляторных механизмов, следствием чего является активация эндогенных противовоспалительных механизмов, в частности, увеличение продукции эндогенного кортизола. Выявленная в этих исследованиях более высокая выраженность клинического улучшения у больных с исходно более значительными нарушениями дыхательной функции может найти корректное объяснение с позиций продемонстрированного нами в экспериментальных разделах работы адаптогенного действия ингалируемого супероксида.

Вовлечение центральных нейрогуморальных регуляторных механизмов в биологические ответы на эндоназальные аппликации газообразного супероксида и аэрозоля низкодозированного пероксида водорода было продемонстрировано на примере впервые обнаруженных явлений потенцирования антиноцицептивного действия анальгетиков. При обсуждении основных механизмов, вовлеченных в эти процессы на уровне ЦНС, на первый план могут быть выдвинуты активирование пула адренокортикотропоцитов аденогипофиза. Одним из возможных следствий этого может быть усиление мощности эндогенной антиноцицептивной опиоидной системы, например, за счет продукции Р-эндорфинов, а также вовлечение нейротрансмиттерных допаминэргической и серотонинэргической систем. Последнее может быть также использовано для объяснения нейропротективных эффектов и защиты структур базальных ганглиев от повреждающего действия нейротоксина МФТП эндоназальными аппликациями пероксида водорода. Хорошая клиническая эффективность ингаляций супероксида и пероксида водорода у больных, симптоматика паркинсонизма у которых вызвана длительным приемом нейролептиков, может служить указанием на вовлечение также других, прямо не зависящих от активности моноаминоксидаз, процессов, в частности, функциональной компенсации вызванной нейролептиками блокады допаминэргических рецепторов в стриатуме. Речь здесь может идти о дофаминэргических Д2 рецепторах, локализованных преимущественно в клетках нигростриарной и мезокортиколимбической систем и чувствительных к наномолярным концентрациям галоперидола и других нейролептиков (Ашмарин и др., 1996). В пользу этого предположения может свидетельствовать угнетение продукции функционального антагониста дофамина — пролактина, обнаруженное нами методами электронной микроскопии аденогипофиза животных, получавших повторные ингаляции газообразного супероксида. Здесь следует подчеркнуть факт, что нигростриарный и мезокортиколимбический регионы мозга, где развиваются основные события повреждения нейронов нейротоксином МФТП и у больных с симптомокомплексом паркинсонизма, связаны нервными герминалями с гипоталамусом — первым регуляторным центром, в который поступает информация от рецепторов носовой полости.

Возвращаясь к вопросу о вовлеченных рецепторах можно, в принципе, представить взаимодействие эндоназально апплицируемых реактивных форм кислорода с каждой из трех групп известных в настоящее время рецепторных структур слизистой носовой полости — обонятельными рецепторами, свободными окончаниями тройничного нерва и рецепторами вомероназального органа. Нами было высказано предположение, что именно последние могут играть основную роль в восприятии сигнала газообразного супероксида. Изложенные в разных разделах работы ссылки на вомероназальный орган как первичную рецепторную систему, способную опосредовать регуляторные эффекты экзогенного газообразного супероксида и/или пероксида водорода, возникли, не в последнюю очередь, благодаря анализу современных данных литературы о наличии, строении (Meisami, Bhatnagar, 1998), формировании в онтогенезе и анатомических нервных связях этого образования с другими подкорковыми отделами мозга (Wysocki, Meredith, 1987; Monti-Bloch, Grosser, 1991; Larriva-Sahdet et al., 1993; Mendoza, 1993;

Lanuza et al., 1997; Monti-Bloch et al., 1998; Meredith, 1998). Участием ВНО в анатомо-физиологическом ансамбле и нейрогуморальных регуляторных симпатических (Zanzanato et al., 1997) механизмах могут быть объединены изученные нами, и на первый взгляд мало взаимосвязанные физиологические ответные реакции на апплицируемые на слизистую носовой полости активированные кислородные интермедиаты. Так, принимая во внимание результаты нейрофизиологических и клинических исследований последних лет, где было показано что дополнительная обонятельная система, представленная ВНО и дополнительной обонятельной луковицей (bulbus olfactorius accessorius) и морфологически связанная с гипоталамусом и гипофизом, способна активировать также мезолимбическую допаминэргическую систему (Mitchell, Gratton, 1992), и что проекции передней обонятельной луковицы способны активировать тубероинфундибулярные допаминэргические нейроны аркуатного ядра, а также учитывая вовлечение базальных ганглиев в процесс передачи ноцицептивной соматосенсорной информации (Chudler, Dong, 1995), можно предстваить, каким образом стимуляция рецепторов слизистой носа может вести к последовательному вовлечению подкорковых центров нейро-эндокринной регуляции физиологических функций.

Представленные в данной работе результаты доказывают также роль свободнорадикальной природы супероксида, в его взаимодействии с рецепторами слизистой носовой полости, в реализации биологических эффектов экзогенного супероксида. Так, поскольку супероксид является единственным известным субстратом СОД, усиление эффекта потенцирования анальгетиков добавлением СОД было расценено в работе как указание на преимущественную роль радикальной природы супероксида в наблюдаемых явлениях. Известно, что анион-радикал супероксида с различной скоростью, в зависимости от pH среды, способен проникать через анионные каналы мембраны эритроцита (Lynch, Fridovich, 1978), немодифицированные и модифицированные бислойные липидные мембраны (Гуськова и др., 1980; Гуськова, 1982; Rubin et al., 1984; Иванов, 1986). В наших экспериментах предшествующее ингаляции супероксида нанесение на поверхность слизистой оболочки носа раствора СОД значительно усиливало антиноцицептивный ответ, тогда как после добавления каталазы было отмечено исчезновение физиологической реакции. Эти обстоятельства могут свидетельствовать в пользу вовлечения пероксида водорода в возбуждение вовлеченных рецепторов.

Приведенные в нашей работе данные свидетельствуют о существовании в окружающей среде экзогенного супероксида, входящего в состав естественных атмосферных газовых ионов. Нами было также показано, что элиминация супероксида из вдыхаемого воздуха гибельна для организмов, тогда как ингаляция искусственного супероксида и повышенных, по сравнению с естественным уровнем, концентраций отрицательных аэроионов вызывают ряд адаптивных ответов организма, развивающихся на физиологическом и биохимическом уровнях. На первый взгляд, эти данные противоречат устоявшимся и поддерживаемым большинством исследователей взглядам на супероксид как повреждающий фактор, эндогенное возникновение которого лежит в основе нарушений клеточного метаболизма и гибели клетки. Попыткой разрешения этого противоречия является разработанная нами гипотеза эволюционной роли экзогенного супероксида, основные предпосылки и положения которой будут кратко сформулированы ниже.

Относительное постоянство концентрации внутриклеточного (метаболического) супероксида и многообразие его внутриклеточных источников могут отражать жизненную потребность клетки в этом радикале (МсСог<3, 1995). Эволюционные предпосылки формирования этой потребности трудно объяснить исключительно с позиций биогенного и/или внутриклеточного происхождения супероксида. Некоторые их существующих в этой связи противоречий кратко сформулированы ниже.

В последние годы установлено, что метаболический супероксид вовлечен в регуляцию практически всех клеточных функций, в первую очередь основной из нихклеточного деления (МсСогё, 1995). Если исходить из вполне логичной предпосылки о первичности возникновения механизмов клеточного деления перед фотосинтезом и аэробным метаболизмом, правдоподобное объяснение происхождению супер оксидного контроля над клеточным делением представляется затруднительным, если вообще возможным.

Принято считать, что цианидустойчивые Мп-СОД и Бе-СОД являются эволюционно более древними ферментами, по сравнению с медь-цинковой Си-, 2п СОД, и по своим функциям, локализации в клетке и, возможно, происхождению являются преимущественно ферментами защиты от внеклеточного супероксида (Е^Шег, 1990). В этом контексте следует также рассматривать митохондриальные супероксиддисмутазы, с учетом симбиотического происхождения этих органелл и длительности их совместной эволюции в составе эукариотической клетки. Такое преимущественное распределение и функции Мп-СОД и Бе-СОД не нашли, на наш взгляд, удовлетворительного объяснения с позиций эволюционного детерминизма. Аналогично сказанному, не находит объяснения также цианидустойчивость этих ферментов.

Для разрешения перечисленных и, на наш взгляд, основных, противоречий, ниже будут сформулированы ключевые положения гипотезы об эволюционной роли экзогенного супероксида, образование которого могло предшествовать возникновению аэробной атмосферы и формированию аэробного метаболизма.

Нами выдвигается предположение о том, что вовлечение супероксида и пероксида водорода в клеточный метаболизм могло иметь место в &bdquo-докислородном" этапе эволюции, и что переход к окислительной атмосфере клетки встретили, будучи преадаптироваными к действию активных кислородных интермедиатов. Возникновение экзогенного супероксида абиотического происхождения и его роль можно рассмотреть на примере эволюции супероксиддисмутаз и митохондрий.

Известно, что образование кислорода в естественных водных средах происходит в процессах радиолиза, фотолиза и электролиза, которые предшествовали биологической эволюции и сопровождают ее до настоящего времени. Энергию для этих процессов поставляют физические источники, такие как космические лучи, радиоактивные источники литосферы и атмосферы, а также электрические разряды и световое облучение. В качестве примера можно указать на установленные факты фотолитического происхождения супероксида и пероксида водорода в поверхностных слоях вод. Стационарные концентрации этих продуктов могут достигать в современных д п условиях, соответственно ЫО' и 5.10″ М (Уое1кег, БесИак, 1995). Количество электрической энергии (в тепловом эквиваленте), освобождаемой на поверхности Земли и частично реализуемой в процессах электролиза воды, оценивается величиной 0 1.

4 кал"см" «год» (Марголис, 1983; Фолсом, 1982). Это значительно выше аналогичных оценок энергетического вклада от распада радиоактивных элементов в гранитных породах на примитивной Земле (0,8 калвсм'^год" 1- Марголис, 1983). Принято считать, что все эти источники, но в первую очередь электрические разряды, сыграли основную роль в абиогенном синтезе органических соединений. Как нами отмечалось выше, те же факторы, но преимущественно электрические разряды и радиоактивные источники энергии, участвуют в образовании атмосферного супероксида в современных условиях в природе.

АБИОГЕННЫЕ СУПЕРОКСИД И ПЕРОКСИД ВОДОРОДА МОГЛИ ПРИСУТСТВОВАТЬ В ВОДАХ И В АТМОСФЕРЕ ЗАДОЛГО ДО ПОЯВЛЕНИЯ И НАКОПЛЕНИЯ В АТМОСФЕРЕ БИОГЕННОГО КИСЛОРОДА.

В отсутствие биогенной продукции кислорода, примитивная атмосфера и воды Земли могли содержать лишь следовые количества супероксида и пероксида водорода.

Этого, однако, могло оказаться достаточным как для вовлечения этих продуктов в клеточный метаболизм, так и для формирования разнообразных механизмов защиты. Защитную функцию могли иметь соединения, сходные с производными порфиринажелезосодержащими коферментами каталазы и пероксидазы, синтез которых мог осуществляться фотосинтезирующими микроорганизмами задолго до появления первых автотрофов, выделяющих кислород (Маргулис, 1983). Способность примитивных клеток к катализу реакций кислород-содержащих соединений можно также рассматривать в качестве аргумента в пользу присутствия в среде этих соединений до появления фотосинтеза и биогенного кислорода.

ВОЗДЕЙСТВИЕ НА ПРОТОБИОНТЫ СУПЕРОКСИДНОГО РАДИКАЛА, ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА И ДРУГИХ АКТИВИРОВАННЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА МОГЛО ИМЕТЬ МЕСТО ЗАДОЛГО ДО УСТАНОВЛЕНИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ АТМОСФЕРЫ И ПРИ ПАРЦИАЛЬНОМ ДАВЛЕНИИ КИСЛОРОДА, ЕЩЕ НЕДОСТАТОЧНОМ ДЛЯ ФОРМИРОВАНИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО МЕТАБОЛИЗМА.

Наличие даже следовых количеств активированных кислородных интермедиатов в среде могло послужить основой для формирования механизмов адаптации к этим продуктам. Эти механизмы могли развиваться по нескольким взаимонеисключающим путям. Один из них мог заключаться в вовлечении этих продуктов в клеточный метаболизм, включая процессы клеточного деления. В настоящее время известно, что супероксидный радикал и пероксид водорода являются факторами, способными побуждать нормальную клетку к делению (ссылка). Можно также полагать, что возникновение основных механизмов редупликации наследственного материала у протопрокариот предшествовало аэробному метаболизму. Одной из предпосылок для вовлечения этих продуктов в процессы деления клетки является доступность экзогенных активированных форм кислорода для реакций, протекающих во внутреннем объеме клетки, что на обсуждаемом этапе клеточной эволюции облегчалось отсутствием сложных внутриклеточных мембранных структур. Клетки, способные использовать доступный фактор среды для своего размножения, приобретали в эволюции селективное преимущество (Маргелис, 1983).

АБИОГЕННЫЙ ПО ПРОИСХОЖДЕНИЮ РАДИКАЛ СУПЕРОКСИДА И ДРУГИЕ АКТИВИРОВАННЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА МОГЛИ СЛУЖИТЬ ПОСТОЯННЫМИ ВНЕШНИМИ СТИМУЛАМИ КЛЕТОЧНОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ.

Известно, что любой биологически важный процесс подвергается регуляции. Адаптация клеток к экзогенным активированным формам кислорода должна была включать формирование механизмов контроля за поступлением супероксида и пероксида водорода в клетку. На рассматриваемом этапе эволюции функция потока этих продуктов в клетку могла выполняться относительно простыми молекулами, такими как глутатион или ферредоксин (Мерзляк, 1989), и даже ионами, например Мп++ (ТпсктсЬ,.

1979). Значительно эффективнее эту функцию стали выполнять локализованные в плазматической мембране ферменты. У большинства исследованных форм современных прокариотов таким ферментом является Fe-СОД. В частности, это было показано для Е. coli, у которой Fe-СОД периплазматического пространства защищает клетки от внеклеточного супероксида (Фридович, 1979). Аналогичную функцию могла выполнять МпСОД у прокариот — предшественников митохондрий. Таким образом, установленные в последние годы феномены стимуляции деления клеток и транскрипции генов супероксидом и пероксидом водорода (Rao, 1994; Bae et al., 1999; Sattler et al., 1999), а также супероксиддисмутазный контроль этого процесса могут найти удовлетворительное объяснение.

Известна точка зрения, что возникновение протобионтов в первобытных водоемах могло происходить одновременно с продолжающимся образованием органических соединений (Фолсом, 1982). Легкодоступным источником энергии для абиосинтезов служили электрические разряды. Устойчивыми промежуточными соединениями, локально образующимися в электрических разрядах в восстановительной атмосфере, были цианистый водород, цианамид и цианацетилен. Все эти соединения участвовали в процессах абиогенного синтеза аминокислот и азотистых оснований (Брода, 1978, Маргелис, 1983). В условиях наличия в среде этих продуктов, осуществление ферментами каталитических функций могло быть реализовано при сохранении ферментативной активности в цианид-содержащей среде. Подобная реконструкция последовательности событий позволяет дать объяснение цианидустойчивости современных изоформ Feи Мп-СОД, — свойству, не находящему адекватного применения в современных условиях. В дальнейшей эволюции эти ферменты могли найти конструктивное применение у простейших фотосинтетиков, а также у клетокпредшественников митохондрий. Это, в определенной мере, обосновывает давнее предположение Fridovich (1979) о сходстве эволюции этих супероксиддисмутаз у предков современных прои эукариот.

ПЕРВОНАЧАЛЬНАЯ РОЛЬ Мп-СОД И Fe-СОД В КЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССАХ МОГЛА ЗАКЛЮЧАТЬСЯ В РЕГУЛЯЦИИ ПОСТУПЛЕНИЯ В КЛЕТКУ ЭКЗОГЕННОГО АБИОГЕННОГО СУПЕРОКСИДА, А ТАКЖЕ В РЕГУЛЯЦИИ УРОВНЯ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА В ОБЛАСТИ КЛЕТОЧНОЙ МЕМБРАНЫ.

Можно также предположить, что сформировавшаяся эволюционно зависимость протоклеток от экзогенного супероксида была сохранена в эукариотических клетках. В этом случае существование эукариотической клетки, характеризующейся высокой степенью компартментализации внутреннего объема, должно было обеспечиваться адекватной продукцией эндогенного супероксида при сохранении контроля за уровнем активных кислородных интермедиатов. Представляется возможным, что функцию основного и относительно стабильного внутриклеточного источника супероксида стали выполнять митохондрии. Таким образом, постулируется, что в митохондриях клетка приобрела не только «энергетическую машину», но и внутренний источник супероксида и пероксида водорода. В процессе эволюции митохондрии «научились» очень тонко и изящно регулировать соотношение этих двух процессов (Скулачев, 1996). Здесь можно проследить известную аналогию с поддержанием клетками на определенном уровне других факторов внутренней среды — рН, концентрации ионов, осмотического давления, и др. Одновременно, и также с участием митохондрий, клетка приобрела механизм самоуничтожения — апоптоз. Митохондрии — не единственный внутриклеточный источник супероксида. Помимо других структурных компонентов, наиболее показательным примером здесь может служить фермент ксантиндегидрогеназа, конвертирующаяся в условиях гипоксии в ксантиноксидазу, катализирующую образование супероксида. Аналогичным образом можно показать также возможную роль экзогенного супероксида в формировании других основных функций клетки, таких как раздражимость, защита, движение.

Известное кредо молекулярной биологии гласит «Что применимо к Е. соН, применимо и к слону». Потребность в экзогенном супероксиде сохранилась у большинства исследованных Мекагоа. Источниками экзогенного супероксида являются воды Мирового океана и атмосфера. Атмосферный супероксид обладает выраженной биологической активностью в отношении наземных животных с различным уровнем организации — от насекомых, до млекопитающих и человека (Анисимов, 1975; ОИуегеаи, 1976). Свидетельством существования филогенетически сформированной потребности в атмосферном супероксиде может послужить гибель животных в условиях аэроионной депривации, показанная в нашей работе. В рецепции экзогенного супероксида, а также, возможно, растворенного в водах пероксида водорода, основная роль может принадлежать сенсорным нейронам слизистой оболочки носовой полости, в частности, интенсивно изучаемому в последнее время вомероназальному органу. Можно предположить, что вомероназальный орган действительно выполняет функцию «перископа промежуточного мозга»^уБосЫ, 1979), воспринимая и передавая в регуляторные центры информацию о качестве внешней среды (ВагЧоэЬик, Веаис1штр, 1994), в том числе информацию о содержании в среде жизненно важных супероксида и пероксида водорода.