Диагностическое значение сывороточных белков для ранней диагностики рака яичников

Злокачественные опухоли (30) в большинстве экономически развитых стран мира занимают второе место в структуре смертности населения после болезней сердца и сосудов. Однако существующая тенденция роста заболеваемости 30 дает возможность предположить, что в ближайшие десятилетия они станут основной причиной смертности населения планеты.

Рак яичников (РЯ) остается одной из наиболее распространенных злокачественных опухолей у женщин. Проблема диагностики и лечения РЯ является одной из самых сложных в онкологии. Около 80% больных поступает в стационары при III-IV стадиях заболевания.

Пятилетняя выживаемость при 1 стадии -80%, 2 стадии-60%, 3 стадии-25%, 4 стадии-15%. Общая пятилетняя выживаемость 39%. После проведенного, казалось бы адекватного лечения, до 20% больных с 1 стадией рака яичников умирают в дальнейшем от рецидивов заболевания [202, 208]. Причина поздней диагностики объясняется длительным бессимптомным периодом болезни и сложностью дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных опухолей яичников. Ранняя диагностика РЯ трудна, так как до настоящего времени не существует специфических диагностических тестов, позволяющих выявить опухоль на начальных этапах её развития.

Одной из задач, направленных на снижение смертности от злокачественных новообразований яичников, является разработка эффективных методов диагностики доклинических форм рака или доброкачественных и пограничных форм опухолей яичников.

Оценка информативности методов ранней диагностики рака яичников направлена на разработку селективного скрининга опухоли с помощью иммунологических, иммуногенетических, биохимических тестов, а также морфологических и эхографических исследований.

В связи с этим, в последние годы ведется интенсивная работа по поиску специфических опухолевых маркеров для ранней диагностики рака яичников.

В нашей стране на базе ГУ НИИБМХ им. В. Н. Ореховича РАМН создан первый в России Центр ггротеомных исследований. Программа исследований Центра предполагает использование различных протеомпых технологий необходимых для выявления маркеров онкологических заболеваний.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: Выявление белковых и пептидных маркеров опухолей яичников для разработки диагностических и прогностических тестов, контроля за проводимой терапией.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Дать клиническую характеристику изучаемых больных опухолями яичников.

2. Построение протеомных карт сыворотки и плазмы больных опухолью яичников для выявления маркерных белков, которые в дальнейшем можно использовать в диагностических целях, в частности, для ранней диагностики опухолей яичников.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА:

Впервые в России созданы иротеомные карты сыворотки и плазмы больных злокачественными и доброкачественными образованиями женских половых органов. Данные карты позволят выявить группы риска по развитию опухолевого процесса и диагностировать заболевания на ранних стадиях.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ:

Выявление новых маркеров рака яичников, относящихся к «молчащим опухолям», может улучшить раннее выявление больных раком яичников. Это в свою очередь позволит снизить процент летальных исходов и улучшит эффективность лечения.

ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. В группе больных раком яичников концентрация а2 гаптоглобиновой цепи значительно больше, чем в остальных исследуемых группах.

2. Концентрация al и а2 цепи гаптоглобина значительно возрастает в сыворотке больных раком яичников, что может быть использовано в качестве дополнительного маркера для ранней диагностики рака яичников.

3. Снижение уровня транссеритина в сыворотке крови больных раком яичников также может служить маркером этого заболевания.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ:

Предложенная методика внедряется в практику работы гинекологического отделения ГКБ № 55, женской консультации родильного дома № 10 и Онкологического научного центра им. Н. Н. Блохина.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ:

Работа изложена на 111 страницах. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, клинической характеристики больных, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Диссертация иллюстрирована 5 таблицами и 18 рисунками.

выводы.

1. Все больные с опухолями различных локализаций имеют выраженные отклонения в содержании белков по сравнению со здоровыми женщинами.

2. Совокупность изменений неспецифических белков имеет характерный для каждого вида опухоли профиль и может быть использован для ранней диагностики рака различной локализации.

3. У больных раком яичников наблюдаются наиболее выраженные изменения в продукции белков, что может быть использовано в качестве диагностического теста для ранней диагностики:

• снижение уровня транссеритина по сравнению с контрольной группой (0,926±0,145 и 1,378±0,318 соответственно).

• повышение уровня а2 гаптоглобина (2,947±0,86 и 0,804±0,654 соответственно).

4. У больных раком молочной железы по сравнению со здоровыми донорами имеется незначительное повышение продукции транссеритина, что может быть использовано в качестве маркера злокачественного процесса (1,632±0,354 и 1,378±0,318 соответственно).

1. Построение протеомных карт у пациенток группы риска по развитию онкологических заболеваний может явиться активным выявлением этих заболеваний в доклинической стадии.

2. Создание протеомных карт в дальнейшем может явиться паспортом для любого пациента, с целью прогнозирования и диагностики различных заболеваний.

3. Учитывая высокий риск развития рака яичников в постменопаузе и сложность дооперационной диагностики, необходимо создать лаборатории, в которых будет проводиться анализ белка для построения протеомных карт, с целью выявления маркерных белков.

ГЛАВА V.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Злокачественные новообразования яичников до настоящего времени являются одним га наиболее сложных разделов клинической онкогинекологии.

По данным литературы рак яичников занимает по частоте второе место среди онкогинекологических заболеваний и шестое место среди всех других злокачественных опухолей человека.

Проблема рака яичников является одной из самых сложных в онкологии. Общая пятилетняя выживаемость при III стадии рака яичников составляет -25%, при IV стадии — 15% (202). После проведенного, казалось бы, адекватного лечения, до 20% больных с I стадией рака яичников умирают в дальнейшем от рецидивов заболевания.

В настоящее время заболеваемость раком яичников продолжает нарастать и, несмотря на применение хирургических вмешательств, новых схем химиотерапии, лучевой и гормонотерапии, существенного улучшения отдаленных результатов лечения не наблюдается. По-прежнему остается недопустимо высокий удельный вес далеко зашедших форм этой локализации. 75−80% больных с III-IV стадией процесса, выявляются как первичные опухоли (112). Улучшение результатов лечения во многом связано с выявлением рака яичников в ранних стадиях, что непосредственно зависит от улучшения диагностических возможностей.

Существующие маркеры, используемые в диагностике рака яичников на ранних стадиях, не обладают достаточной специфичностью, или достоверностью. В связи с этим, поиск новых маркеров, на основе которых можно создать новые диагностические наборы, остается одной из важнейших задач.

Идентификация биомаркеров различных опухолей необходима для ранней диагностики, мониторинга их прогрессировать, а также адекватной терапии опухоли.

В настоящее время, в связи с развитием протеомики, разрабатываются и осваиваются новые методы поиска высокоспецифичных маркеров для различных опухолей.

Данная работа посвящена выявлению маркеров опухолей яичников для разработки диагностических и прогностических тестов, а также контроля за проводимой терапией.

Комплексное клинико-лабораторное обследование женщин включало: сбор анамнезаобщий осмотр- .двуручное влагалищно-абдоминальное исследованиепроведение лабораторных исследований крови и мочиопределение онкомаркера CA 125- ультразвуковое исследование в динамике, а также патогистологичсское исследование тканей.

Нами было обследовано 160 женщин. Первую группу или контрольную составили 30 практически здоровых женщин (здоровые доноры). Вторую группу составили 30 женщин с доброкачественными опухолями яичников. Третья группа (основная) представлена 30 женщинами с диагнозом рак яичников. Четвертую группу составили 30 женщин с доброкачественными опухолями матки. Пятая группа была представлена 30 женщинами с раком эндометрия. Шестая группа — 10 женщин с раком молочной железы.

При изучении данных клинического обследования основной группы обращает на себя внимание высокая частота различных заболеваний в анамнезе, что указывает на пониженную резистентность организма. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что наиболее часто экстрагенитальная патология наблюдалась у женщин основной группы, тогда как в контрольной группе сопутствующие заболевания встречались гораздо реже. Наиболее частое сочетание заболеваний в основной группе — заболевания органов кровообращения в 40% случаев и желудочно-кишечного тракта в 66,6% случаев. Детские инфекции и ОРВИ в анамнезе отмечены у 20% и 50% соответственно, что может также косвенно указывать на сшЕженный иммунитет в течение жизни.

Помимо экстрагенитальной патологии, имели место и гинекологические заболевания. Самый высокий процент воспалительных заболеваний отмечен у пациенток основной группы 40%, что соответствует литературным данным от 50 до 68% (195, 198). Это находит свое подтверждение в ряде исследований, которые показывают, что при сочетании бластоматозного роста с хроническим воспалением придатков матки неоплазма растет и развивается значительно быстрее, чем в организме, не ослабленном хроническим воспалением.

В анамнезе у пациенток основной группы доброкачественные опухоли яичников встречались в 20% случаев, а также отмечен высокий процент заболевания молочных желез (26,7%), что является предрасполагающим фактором для развития рака яичников. По нашим данным гинекологические заболевания практически не встречались в контрольной группе, или процент их встречаемости оставался на шоком уровне.

По данным литературы рак яичников встречается чаще среди наций, у которых традиционным является ограничение рождаемости. Среди нерожавших женщин риск возникновения рака яичников в 5 раз больше чем у беременевших до 20 лет (134), что подтверждается и нашими данными.

На основании приведенных данных можно предположить, что в основной группе отмечено снижение репродуктивной функции, что косвенно является предрасполагающим фактором, приводящим к развитию рака яичников.

Больные с доброкачественными заболеваниями яичников предъявляли значительно меньше жалоб, чем в основной 16,6%, против 33,3%, причем результаты отличаются статистически достоверно от контрольной группы 88,5% (р<0,1). Жалобы на слабость встречались у больных с доброкачественными опухолями яичников в 16,7%, тогда как больные с раком яичников данные жалобы предъявляли в 33,3% случаев. Боли в животе у больных с доброкачественными заболеваниями яичников встречались в 40%, тогда как, у пациенток основной группы этот показатель составил 44,2%, а в контрольной 4,2%. Увеличение живота в объеме наблюдалось в основной группе у каждой третьей пациентки, тогда как у больных с доброкачественными заболеваниями яичников в 6 раз реже. Можно отмстить, что похудание было выявлено только у больных в основной группе (у каждой 5). На остальные жалобы отводится небольшой процент, и они распределялись примерно одинаково.

При обращении в течение первых 4 месяцев правильный диагноз у больных с доброкачественными заболеваниями яичников установлен раньше, чем у больных основной группы (78,2%, против 57,4%). К тому же у больных раком яичников в 2 раза чаще ставился ошибочный диагноз. Это подтверждает тот факт, что рак яичников зачастую имеет бессимптомное течение заболевания на ранних стадиях и при гинекологическом исследовании достоверность клинического метода крайне ншка, а частота диагностических ошибок составляет от 33 до 42% (26, 27, 28).

Известно что, СА-125 не является специфичным онкомаркером, для рака яичников, т.к. его показатели повышаются и при других гинекологических заболеваниях, а также и при экстрагенитальной патологии (циррозе печени, экссудативном плеврите и т. д.).

Аналшируя показатели онкомаркера СА-125 у больных раком яичников можно отметить, что наибольший процент СА-125 от 100 до 1000 Ед/л выявлен у 61,4% больных, тогда как, показатель СА-125 от 35 до 100 Ед/л наблюдался у 38,6% больных. Показатель СА-125 от 100 до 1000 Ед/л выявлен у 10% больных раком эндометрия, тогда как в 73,8% обнаружен у больных раком яичников. В контрольной группе СА-125 в 100% случаев был в пределах нормы, и его величина в среднем составила 12,4 Ед/л.

Учитывая недостаточную информативность данного метода, возникла необходимость в разработке новых неинвазивиых биохимических методов исследования, которые позволили бы не только проводить скришшговую диагностику опухолей яичников, но и определить пролиферативный уровень специфических белков в организме характерный только для рака яичников.

5.1 Обсуждение результатов полученных при помощи протеомпых технологии.

Подсчет экспрессии пятен позволил определить в термостабильпой фракции сыворотки крови белки, уровень которых существенно варьировал в группах исследуемых нами пациентов. Всего было обнаружено 6 таких белков: альфа-1 кислый гликопротеид (поле 1), кластерин (аполипопротеинApoJ) (поле 2), транссеритин и его шоформы (поле 3), аполипопротеин A-I и его шоформы (поле 4), аполипопротеин A-IV (поле 5 и 6) и, а цепь гаптоглобина (поле 7).

Хорошо известно, что аполипопротеин A-I (Ano A-I) синтезируется в печени и в тонком кишечнике. Он является главным структурным белковым компонентом липопротеннов высокой плотности, и служит кофактором для лецитин-холестерол ацилтрансферазы — фермента участвующего в этерификации холестерола. Ano A-I играет важную антиатерогенную роль путем усиления обратного захвата холестерола. Ншкий уровень Ano A-I связан с увеличением риска возникновения атеросклероза. И, наоборот, высокий уровень предотвращает появления этих заболеваний. Кроме того, в нескольких исследованиях показано, что уровень Ano A-I коррелирует с изменением функций гепатоцитов. Уменьшение его количества отмечается при различных заболеваниях печени: гепатиты и гепатоцеллюлярная карцинома. Возможно, что токсины появляющиеся при клеточном некрозе в центре опухоли могут разрушать гепатоцнты, что может привести к уменьшению его синтеза (117). С другой стороны мы наблюдали отсутствие изменений синтеза предшественника Ano A-I. Это может свидетельствовать в пользу того, что функция гепатоцитов не нарушена. На основании этого можно предположить, что снижение уровня Ano A-I связано с увеличением его потребления. Хорошо известно, что быстрорастущие опухолевые клетки нуждаются в материале для строительства своих мембран.

Ano A-IV — гликопротеин, синтезируемый в тонком кишечнике. Ano A-IV входит в одно семейство с Ano A-I. Ano A-IV играет роль в образовании хнломикронов, а также секреции и катаболизме липидов низкой плотности. Он требуется для активации липопротеин-липазы — фермента Ano C-II. Кроме того, он важный активатор лецитин-холестерол ацетил трансферазы. Ano A-IV является также главным компонентом липидов высокой плотности и хнломикронов. Было предположено, что он играет важную роль в предотвращении возникновения атеросклероза, а также в модуляции функции кишечника. Пониженный уровень Ano A-I обнаружен при воспалительных процессах, при острой фазе гепатитов и циррозе (120). Поводимому, в нашем .'случае снижение или исчезновение Ano A-IV и его изоформ также может быть связано со строительством мембран быстрорастущих раковых клеток.

АполипопротеинApoJ — (кластерин) в основном синтезируется в печени. Наибольшее его количество связано с липопротеинами высокой плотности. Известно, что ApoJ экспрессируется в различных тканях и, по-видимому, способен связывать клетки мембраны и гидрофобные белки. Было показано, что ApoJ является ингибитором NF-kB (фактор некроза опухоли) посредством стабилизации IkBs (фактор, разрушающий NF-kB) и эта активность может приводить к подавлению подвижности опухолевых клеток. ApoJ связан с программой клеточной смерти (апоптоз). Концентрация этого белка очень сильно изменяется при воспалении, при апоптозе и различных опухолевых заболеваниях. Несмотря на интенсивное изучение, его биологическая роль остается непонятна. В нескольких статьях было показано увеличение экспрессии этого гена в клетках опухоли яичников, но не было найдено данных об уровне этого белка в крови при различных онкологических заболеваниях (126). Уменьшение уровня ApoJ в термостабилыюй фракции онкологических больных возможно связано с повышением его захвата опухолевыми клетками для строительства мембран. Необходимо отметить, что снижение уровня ApoJ у больных с опухолями молочной железы намного выше, чем при другой патологии. Этот феномен можно в будущем использовать, для дифференциальной диагностики рака молочной железы.

Уросубмукоид (альфа-1 кислый гликонротеид) принадлежит к семейству липокаинов. Он экспресспруется в печени и секретируется в плазму. Физиологическая роль этого белка не ясна. Известно, что уросубмукоид может связывать и транспортировать многие фармакологические вещества и гормоны, а именно такие вещества как: пропранолол, гуанпдин, а также определенные антибиотики и стероиды. Уросубмукоид участвует в поддержании отрицательного заряда основных мембран — гломерул в почках. In vitro показано, что уросубмукоид обладает регуляторной функцией. Поводимому, он модулирует активность иммунной системы при острой фазе воспаления. В ранней острой фазе воспаления уровень в крови его возрастает. Молекула уросубмукоида содержит одиночную полипептидную цепь, состоящую из 183 аминокислот и 5 аспарагинов, через которые происходит гликозилирование этого белка. Нативная форма уросубмукоида в плазме не гомогенна. Помимо гетерогенности глнкозилирования, белковая часть этого комплекса генетически полиморфна. Молекулярная масса составляет 41 000 — 43 000 кДа. Углеводная часть этого комплекса составляет 45% молекулярного веса (126) На 2D электрофорезной карте тотальной сыворотки, после MS модификации, эта точка, которая представляет уросубмукоид, обозначена у нас в таблице под № 6. Ее позиция полностью совпадает с таковой на «референс карте» опубликованной в базе данных SWISS -2D PAGE. Этот белок был идентифицирован в той же позиции на протеомной карте в термостабилыюй фракции.'Тем не менее, нами было идентифицировано одно пятно, которое после MS идентификации также было классифицировано как уросубмукоид, но оно располагалось на двухмерной карте выше. Его молекулярный вес приблшителыю составляет двойной вес пятна идентифицированного как уросубмукоид на двухмерной карте сыворотки. И это пятно, по-видимому, представляет димер уросубмукоида. Возможно, этот димер уросубмукоида становится видимым на двухмерной карте термостабильной фракции благодаря насыщению в этой фракции глико и липопротеинами. Существуют данные, указывающие на повышение концентрации уросубмукоида в плазме больных раком молочной железы, эндометрия и раком яичников, но наши исследования свидетельствуют об уменьшении концентрации димерной формы уросубмукоида. Возможно, что процесс генерализации нарушается у больных раком яичников, раком эндометрия и раком молочной железы, а также доброкачественными опухолями яичников. Кроме того, снижение уровня димерной формы уросубмукоида намного выше, чем при других патологиях. Дальнейшее изучение этого феномена может лежать в основе исследования новых маркеров для рака молочной железы.

Транссеритин (преальбумин) — синтезируется в печени. Транссеритинтетрамерный белок, содержащийся в плазме человека и известный транспортер тироксина и ретинола. Он, возможно, транспортирует тироксин ю сыворотки крови в мозг. Кроме того швестно, что возникновение семейной амилоидной полинейропатии связано с мутацией, которая дестабилширует транссеритин и облегчает агрегацию внеклеточных амилоидных волокон, преимущественно в периферической нервной системе и тканях сердца. Кроме того, транссеритин известен как белок острой фазы воспаления. При этом было выявлено уменьшение его концентрации при различных воспалительных заболеваниях печени. И наоборот, у больных с болезнью Альцгеймера уровень транссеритина возрастает (126, 127). Нами было отмечено что, уровень всех изоформ транссеритина в сыворотке исследуемых групп не изменяется, кроме пациентов с раком яичников, где его концентрация меньше чем в контроле.

Интактный гаптоглобин является гликопротеином, который в основном синтезируется в клетках печени в ответ на различные стимулы и затем попадает в плазму. Помимо печени гаптоглобин может синтезироваться в различных клетках и тканях: включающие опухолевые клетки, в тонком кишечнике, а также в эндометрии. Гаптоглобин совместно со свободным гемоглобином плазмы предотвращает потерю железа через почки, и защищает почки от разрушения гемоглобином путем образования комплекса, который становится доступным для ферментов, участвующих в его деградации. Но полный спектр его биологических функций при различных заболеваниях еще недостаточно известен. Помимо его функции, которая заключается в удалении продуктов деградации, а также в ответе на острую фазу воспаления было показало, что гаптоглобин вовлечен в трансформацию эпндермальных клеток, иммуносупрессию опухолевых клеток и ангиогенез. Гаптоглобин состоит из гаптоглобина al, а2 субъединиц, которые связаны с Р цепыо через дисульфидные мостики. Существуют работы, указывающие на повышение гликозилированной формы интактного гемоглобина в сыворотки больных раком яичников. Недавно было показано, что концентрация гаптоглобина, а именно al и а2 цепи, а не Р цепи значительно возрастает в сыворотке больных раком яичников и это повышение возможно происходит благодаря специфическим ферментам пли специфическим белково-белковым компонентам (117, 127). Наши наблюдения полностью подтверждают эти данные. Концентрация, а цепи гаптоглобина возрастает в термостабильной фракции всех пациентов, но в группе больных раком яичников это повышение значительно больше, чем в других группах.

Сывороточный амилоид, А является известным белкОхМ острой фазы воспаления. Уровень данного аполипопротеина в плазме повышается при различных патологиях. Среди прочих, имеются сообщения о повышении уровня SAA при раке легких и почечно-клеточной карциноме (142).

Нами дополнены эти данные тем, что уровень SAA1 в плазме повышается также при раке яичников. На первый взгляд, применение маркерных свойств этого воспалительного белка ограничено вследствие его ншкой специфичности. Но при недостатке для большинства злокачественных опухолей специфичных маркеров, оценка уровня нескольких воспалительных белков может привести к разработке диагностической панели, обеспечивающей неинвазивное определение стадии злокачественной опухоли, прогноза и т. д.

Анализируя полученные результаты необходимо отметить, что все изменения относятся к белкам, которые не являются специфическими маркерами изучаемых нами опухолей, но панель их изменений характерна для каждой патологии. Будущие работы в этом направлении, возможно, будут лежать в основе создания биочипов для ранней диагностики различных заболеваний, в том числе и злокачественных опухолей.