Диагностика вирусных инфекций на примере вируса табачной мозаики с помощью лазерной спектроскопии

Для сельского хозяйства всех стран мира встала проблема борьбы с болезнями культурных растений с применением самых разнообразных способов. Известно, что в современной экологической обстановке ущерб от вредных организмов значителен. В Африке потери от вредителей, болезней и сорняков достигают 44% от потенциального урожая, в Юго-Восточной Азии — 43%, в Латинской Америке — 35% (Помазков, 2000). По данным ФАО (2003) потери от заболевания растений в различных странах наносят колоссальные убытки экономике. В Западной Европе они составляют миллионы долларов, в Азии — более 200 млн., Южная и Северная Америкаболее 500 млн., в России эта цифра близка к 20−25 млн. долларов. Таким образом, мировой ущерб, наносимый сельскому хозяйству различными заболеваниями растений близок к цифре в 1 млрд. долларов.

В связи с этим борьба с наиболее распространенными болезнями требует больших затрат и усилий. В настоящее время потери сельскохозяйственной продукции обусловлены воздействием антропогенных, стрессовых факторов и приемов, используемых при интенсивных технологиях. В результате организмы активируются и переходят в разряд вредоносных, у патогенов повышается вредоносность и устойчивость к фунгицидам.

Одной из распространенных форм заболеваний и трудно поддающейся диагностике являются вирусные. Вирусы, микоплазмы, вироиды поражают все живые организмы, часто являются причиной массовых заболеваний, приводящих к тяжелым последствиям. В настоящее время известно около 700 возбудителей вирусной этиологии и их количество постоянно пополняется (Келдыш, Помазков, 2003).

Широкое распространение вирусных заболеваний, отсутствие приемов массового оздоровления в полевых условиях требует затрат на производство оздоровленного посадочного материала. Для ограничения распространения и снижения вредоносности вирусных заболеваний требуется осуществление целого комплекса мероприятий: использование приемов ранней диагностики, карантина и сертификации посадочного материала, контроль за источниками инфекции, селекция устойчивых к заболеванию сортов и гибридов (Келдыш, Помазков, 2003).

Возникает потребность в разработке новых методов диагностики, для быстрого мониторинга заболеваний и оздоровительных мероприятий. Разработка теоретических предпосылок и внедрение методологических подходов для различных систем защиты растений от болезней создает основу для разработки физических, биофизических, физиологических и других методов исследований.

Еще К. А. Тимирязев указывал, что, электрофизиологические методы перспективны для определения «степени жизнеспособности организма растений». Широко используют частотную дисперсию импеданса, динамику электрических потенциалов для диагностики устойчивости и эффективности использования пестицидов при защите растений (Горчаков, 1992). В других работах эти методы использовали при анализе водного режима, обеспеченности элементами питания, степенью заболевания (Мелещенко, 1959; ОгеепИеш дХ а1., 1972; Горчаков, 1994). Другие исследователи (Тарусов, Китляев, 1974) показали, что электрофизиологические параметры несут информацию о генетической программированное&tradeи являются интегральными показателями сложных физиолого-биохимических процессов при воздействии на растение факторов внешней среды.

Ценность полученной информации подчеркивается строго количественными измерениями параметров, воспроизводимостью полученных результатов. Другой особенностью метода является информационность в определении ответных реакций организма на действие факторов среды и стрессовые воздействия, адаптационные возможности растительного организма. Применительно к сельскому хозяйству использование метода позволит определять устойчивость к неблагоприятным факторам среды, например, недостатку питания и воздействию возбудителей болезней (ВТМ).

В последние годы во многих странах мира среди биофизических методов большое внимание уделяется интенсивному внедрению лазера в биологические исследования. Уникальное свойства лазера открыло широкие возможности его применения в различных областях диагностики. Эффективность лазерного сканирование широко известно в области медицины (Dougherty, 1982; Странадко, 1997, Мюллер, 1997), микробиологии, биохимии (Москаленко, Прилуцкий, 2000; Лебедев, Левчук, Ломакин, Носкин, 1987; Губин, 1987; Рис, Стернберг, 1988).

Современное развитие исследований в области воздействия излучения с веществом характеризуется многофункциональностью, привлечением многих разделов физики для интерпретации получаемых результатов, практической ценностью, необходимостью создания новых информационных, промышленных и медицинских технологий (Аграфонов, Балахчи, Бирюлина и др, 2004).

Традиционный подход к диагностике заболеваний растений включает в себя визуальное наблюдение за состоянием растения: проявлением внешних признаков заболевания. Как правило, в такой момент, заболевание принимает хронический характер, и борьба с ним становится затруднительной. Существенно и то, что, внешние признаки заболевания не всегда являются специфичными. Препаративные же методы диагностики заболеваний растений продолжительны по времени и дорогостоящи.

Актуальность данной работы связана с возможностью использования лазерной диагностической аппаратуры для определения болезней растений на ранней стадии. Этот метод позволяет: определить болезни растений на ранней стадии развития и проводить диагностику растений в режиме реального времени (on line). Преимуществом данного метода является возможность проводить исследования бесконтактным способом — не повреждая растение (Пискарёв, 2004).

В России лазеры применяются уже более 30 лет. Лазеры могут испускать свет в узком спектральном диапазоне в виде направленного сфокусированного, высококогерентного, монохроматического, поляризованного пучка электромагнитных волн (Физика: энциклопедический словарь, 1991).

В зависимости от характера взаимодействия лазерного излучения с биологическими тканями различают три вида фотобиологических эффектов, которые могут быть использованы для диагностики: фотодеструктивное воздействие, при котором тепловой, гидродинамический, фотохимический эффекты света вызывают деструкцию тканей. Этот вид лазерного излучения взаимодействия используется в лазерной хирургии;

— фотофизическое и фотохимическое воздействие, при котором поглощённый живыми тканями свет возбуждает в них атомы и молекулы, вызывает фотохимические и фотофизические реакции. На этом основывается принцип биолюминесценции — люминесценции организмов, связанная с процессами из жизнедеятельности. Наблюдается у бактерий, грибов, простейших, насекомых, растений;

— невозмущающее воздействие, когда живой объект не меняет своих свойств в процессе взаимодействия со светом. Это такие эффекты, как рассеивание, отражение и проникновение. Этот вид также используют в лазерной спектроскопии.

Фотобиологической активностью свет обладает в ультрафиолетовой, видимой и инфракрасной областях спектра. Фотобиологические процессы достаточно разнообразны и специфичны (Фёдоров, 1988).

В настоящей работе нами поставлена цель — показать возможность и практическую осуществимость применения современных лазеров для диагностики вирусных заболеваний. В процессе реализации поставленной цели выполнялись следующие задачи:

1. Разработка концепции диагностической системы, основанной на использовании метода лазерной фотолюминесценции;

2. Сборка, наладка и калибровка диагностического лазерного стенда для отработки методики фотолюминесцентного анализа болезней растений на ранних стадиях;

3. Проведение экспериментов со здоровыми растениями и растениями на ранней стадии заболевания вируса табачной мозаики с целью разработки методики фотолюминесцентного анализа с использованием импульсно-периодического эксимерного лазера.

4. Выделение общих критериев для определения заболевания вирусом табачной мозаики на основе сканирования с помощью импульсно-периодического эксимерного лазера.

Научная новизна работы заключается в следующем:

1. Впервые для диагностирования заболевания ВТМ овощных растений была использована установка, сконструированная на основе эксимерного лазера, показавшая преимущества дистанционного диагностирования.

2. Показано, что увеличение длины волны фотолюминесценции растений является признаком заболевания ВТМ после предварительного облучения ультрафиолетом с длиной волны света 308 нм.

3. Установлено, что растения, испытывающие недостаток азотного питания, но имеющие визуальные признаки ВТМ, характеризуются более короткой волной фотолюминесценции, чем растения в благоприятных условиях питания.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

выводы.

Установка для определения фотолюминесценции растений с использованием эксимерного лазера показала работоспособность, высокую чувствительность, стабильность получаемых результатов и их воспроизводимость в сравнении с существующими методами диагностики вирусных заболеваний растений.

Результаты экспериментов свидетельствуют о возможности диагностики растений, заражённых ВТМ на ранней стадии в режиме реального времени (on-line).

Экспериментально доказано, что исходной для диагностики ВТМ и отличия ВТМ от азотного голодания растения является УФ-область излучения с установленной длиной волны (X) равная 308 нм. На других длинах волн зондирующего излучения сигнал фотолюминесценции практически не регистрируется.

Растения томатов и огурцов заражённые ВТМ, характеризуются фотолюминесценцией с длиной волны света, превышающей длину волны света здоровых растений: УФ часть спектра для здоровых растений и длинноволновая часть спектра для больных:

Торбей F1: первый пик — 414,0нм/426,4нм, второй пик — 429,4нм/440,2нмПолфаст F1: первый пик — 423,6нм/433,0нм, второй пик — 434,6нм/445,6нмБенитио F1: первый пик — 423,8нм/433,8нм, второй пик — 443,3нм/467,2нм;

Амур Б1: первый пик — 3 80,6нм/417нм, второй пик — 420,6нм/435нм;

Адам: первый пик — 410,2нм/425нм, второй пик — 421,8нм/434,6нм;

Атлантис Б1: первый пик — 416,2нм/426,8нм, второй пик — 425,8нм/438,6нм.

Статистический анализ показывает, что различия длины волны пиков фотолюминесценции у гибридов томатов и огурцов статистически достоверны. Заражение растений ВТМ вызывает статистически достоверное увеличение длины волны света по сравнению с контрольными растениями:

— для огурцов, первый пик фотолюминесценции: среднее по фактору, А НС^р 1,22- среднее по фактору В НС1^Л, 95- второй пик фотолюминесценции: среднее по фактору, А НС5у= 1,59- среднее по фактору В НС^= 1,95;

— для томатов, первый пик фотолюминесценции: среднее по фактору, А НС^= 0,88- среднее по фактору В НС^= 1,08- второй пик фотолюминесценции: среднее по фактору, А НС^,= 1,01- среднее по фактору В НО^р.1,24;

У гибрида огурца Калунга Б1, испытывающего недостаток азота, пики фотолюминесценции проявляются в коротковолновой части спектра на длинах волн 342 — 367 нм, в то время как при полноценном питании пики спектров фотолюминесценции наблюдаются в длинноволновой области спектра: 405−422 нм. Недостаток азота сдвигает спектр излучения в коротковолновую УФ часть спектра для первого пика на +63 нМ и на +55 нМ для второго пика. Статистически это подтверждено: первый пик HCPooi = 12,6- второй пик HCPooi = 12,09.

7. Усиление люминесцентного сигнала в полосе 425−480 нм достоверно коррелирует с развитием ВТМ.

8. Установлено, что лазерное излучение с длиной волны 308 нм позволяет диагностировать растение, не повреждая его.

9. Основными показателями при диагностике ВТМ являются первые два пика люминесценции, с максимальной амплитудой по высоте и ширине спектра, аналогичные показатели установлены для растений испытывающих азотное голодание.

10. Лазерная фотолюминесценция в сравнении с другими методами диагностики вирусных заболеваний имеет ряд преимуществ:

1. Во времени получения результата: 15 минут или on-line;

2. Высокой достоверности: 85−90%;

3. Меньшей трудоёмкости: не требует значительных физических усилий при калибровке, настройке и запуске аппаратуры;

4. Не требовательна к выбору образца для анализа: достаточно использовать инфицированную часть растения, например, лист;

5. Не высокой стоимости анализа: 0,5 евро один тест.

5.

Заключение

.

Проведенные эксперименты показали, что лазерная установка перспективна для диагностирования заражения овощных культур ВТМ. Установка показала стабильность параметров волны света, примененной для облучения растений. Подобные установки использовали in vivo для диагностики таких заболеваний, как рак и неоплазия (образование опухолей) рядом исследователей (Anidjar, Cussenot, Avillier and others, 1998; Qu, MacAuley, Lam and Palcic, 1995; Ramanujam, Folien Mitchell, Mahadevan, Thomsen and others, 1996; Turner, Ramanujam, Ghosh and others, 1998; Zeng, Weiss, Cline and others, 1998).

Успешно использовали данный метод в биохимии для диагностирования белковых соединений in vivo, которые синтезируются при формировании ответной реакции на внешнее воздействие (Richards-Kortum, 1995) и определения начальной стадии паранекроза и границу его распространения (Москаленко, Прилуцкий, 2000), что было нами заимствовано.

В работе Qiyin Fang, Thanassis Papaioannou, Javier A. Jo, Russel Vaitha, and Kumar Shastry (2003) авторы подтверждают принципы использования современного оптоволоконного лазерного оборудования на биологических объектах in vivo. Система позволяет использовать различные световые источники и оптоволоконные провода для выборочного и дистанционного возбуждения света в режиме доставка/сбор информации, которые используются в различных биологических задачах. Положительные результаты получены при диагностике различных заболеваний в области медицины (Dougherty, 1982; Странадко, 1997, Мюллер, 1997), микробиологии, биохимии, устойчивости к воздействиям факторов внешней среды (Москаленко, Прилуцкий, 2000; Лебедев, Левчук, Ломакин, Носкин, 1987; Губин, 1987; Рис, Стернберг, 1988).

Это подтверждает применение установки для диагностирования заболевания растений ВТМ. В результате облучения различных растений были получены результаты, позволяющие точно характеризовать состояние растений: повреждение ВТМ, недостаток азотного питания. Однозначный ответ также был при облучении воды, показавший отсутствие ответной реакции (см. стр. 84).

В ходе проведённых экспериментов были выявлены значительные различия показателей фотолюминесценции у растений инокулированных вирусом ВТМ и растений не подвергшимся заболеванию. Установлено, что у растений зараженных вирусом табачной мозаики появляются 2 пика фотолюминесценции, характеризующиеся возрастанием длины волны света. В большинстве экспериментов этот показатель превысил 10 нм и является существенной величиной. Основные показатели снимались по первым двум пикам фотолюминесценции, которые приходились на длину волны от 380 до 460 нм. Необходимо отметить, что все пики фотолюминесценции больных растений сдвигались в длинноволновую (красную) область, тем самым, являясь характерным диагностическим показателем.

У растений, испытывающих недостаток азота, пики фотолюминесценции проявляются в коротковолновой части спектра на длинах волн 340 — 360 нм, в то время как при полноценном питании пики спектров фотолюминесценции наблюдаются в длинноволновой области. Эти различия также существенны.

Применение лазера в диагностике патологических процессов у растений основывается на оптическом зондировании тканей. При этом в полной мере используются уникальные свойства лазерного излучения: монохроматичность, когерентность, поляризованность, направленность, возможность генерации от непрерывного излучения до сверхкоротких импульсов. Оптическое зондирование тканей позволяет получить информацию как о структурно-пространственных параметрах объектов (молекул, клеток и органов в целом), так и о состоянии жизнедеятельности (Козлов, 1996), что было подтверждено нами в проведённых экспериментах у заражённых и здоровых растений.

Фотолюминесценция растений, прежде всего, связана с изменением направленности метаболических процессов, вызванных внешними факторами. Так, в экспериментах (Москаленко, Прилуцкий, 2000) с экстрактами из тела светящегося рачка СурйсНпа установлено, что на этой модели для люминесценции необходимы вода, кислород и окисляющее вещество — в данном случае липопротеид люциферин, окисляемый ферментом люциферазой с выходом конечного продукта реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ) в виде липоперекиси. Наиболее сильная люминесценция (первичная и (или) вторичная) в деградирующих тканях отмечается на стадии необратимой денатурации с модификацией сульфгидрильных (8Н2) групп белковых молекул в дисульфидные мостики (Б-Б), т. е. при потере водорода и одного электрона на каждую сульфгидрильную группу и при увеличении «жёсткости» молекулярной конструкции. На основании перечисленных данных можно сказать, что в биологических объектах в общем случае усиление люминесцентного свечения сопряжено с потерей определёнными молекулярными комплексами или радикализированными атомами электродонорных свойств с превращением их в агенты электроакцепторного действия (радикализация биологических молекул).

Упомянутыми авторами также установлено, что при облучении разнообразных образцов тканей и жидких белковых сред организма млекопитающих (облучение УФ лазером, X = 308 нм) усиление люминесцентного сигнала в полосе 400 нм достоверно коррелирует с развитием некробиоза на уровне необратимого повреждения клеточных мембран и белковых коллоидов. Данный эффект хорошо воспроизводится при действии сильных факторов перекисного (радикального) окисления и автолиза, но отсутствует при действии слабого окислителя типа формальдегида. Эффект усиления флюоресценции при некробиозе практически универсален и отражает процессы перекисной деградации липидов, разрушение клеточных оболочек, потерю противоокислительных электродонорных свойств, связанных, в частности, с диеновыми связями С=С, образование жёстких макромолекулярных структур, «армированных» предположительно дисульфидными мостиками S-S.

В работе Jonathan D. Pitts и Mary-Arm Мусек (2001) были получены спектры фотолюминесценции с разницей в 3 нм, что было достаточно для определения широкого спектра частот биологических флюороворов.

Малов А.Н., Малов С. Н., Чёрный В. В., (1997) отмечают селективность лазерного воздействия (изменения индуцируются только в больных биосистемах, на здоровые воздействие не сказывается) и то, что эффект наблюдается при очень малых интенсивностях и поглощаемых энергетических дозах. Экспериментально было установлено, что лазерное излучение действует как на биологические клеточные структуры, так и на отдельную клетку.

В тканевой лазерной спектроскопии, свет используется для зондирования эндогенных биологических флуорофоров, таких как коллаген, эластин, никотинамидадениндинуклеотид и триптофан. Так как ткани являются неоднородной средой, сигналы флуоресценции, измеренные in vivo отражают, морфологическую и оптическую абсорбцию ткани, а также разрушенные места, как местная биохимия (Richards-Kortum, 1995). Поэтому эти сигналы, полученные безвредным путём, являются ценным источником детальной информации о микросреде и заболевании ткани.

В своих работах Гужов Ю. Л., Фукс А., Валичек П. (2003) отмечают перспективность использования лазера в селекции сельскохозяйственных растений, показано, что при непрерывном воздействии лазерного излучения видимой области спектра можно получить высокий выход мутантных форм.

Настоящая экспериментальная работа позволяет в режиме реального времени определить начальную стадию развития ВТМ на растениях томата и огурца, а также отличить вирусное происхождение инфекции от азотного голодания. Работа основана на регистрации спектра люминесценции под действием УФ излучения лазера исследуемых здоровых и заражённых образцов, в которых происходили некротические процессы или возникал риск развития некроза. Для сравнения использовали образцы растений, в которых заведомо отсутствовали явления некроза. Для проведения экспериментов был создан стенд, где использовалась лазерная установка на базе ХеС1 эксимерного лазера, а измерения проводились на длине зондирующего излучения X — 308 нм. На других длинах волн зондирующего излучения сигнал фотолюминесценции практически не регистрировался.

Для увеличения точности измерений и получения надёжных временных характеристик фотолюминесценции в подсистему детектирования был включён осциллограф ТекйошсБ, что увеличило разрешающую способность спектра с АХ= 0,91 нм до ДА,=0,23 нм и увеличило точность измерений. Лабораторные измерения спектров фотолюминесценции для объекта ВТМ обеспечили возможность изучения характерных пиков спектров фотолюминесценции, тонкую структуру в районе этих пиков, значения сигналов фотолюминесценции как функцию концентрации и временные характеристики сигналов фотолюминесценции, соответствующих спектральным пикам.