Экспрессия ParaHox-генов в онтогенезе полихеты Nereis virens (Annelida, Polychaeta)

Одной из центральных проблем биологии вообще, и биологии развития в частности, является проблема становления морфологии во всей ее сложности и многообразии, как на уровне отдельного организма, так и на филогенетическом уровне. Современный взгляд на эволюцию, как на процесс, приведший к возникновению морфологического разнообразия жизни, невозможен без понимания ее молекулярного фундамента.

Структурно и функционально консервативные гены, стоящие на вершинах регуляторных каскадов программ развития, в последние два десятилетия стали объектом пристального внимания для исследователей, чьи интересы находятся в сфере молекулярных основ эволюции, генетики и эмбриологии (Акаш. 1995; Carroll. 2001; Davidson, 2001). Регуляторные гены, координирующие развитие Metazoa, принадлежат к ограниченному числу очень древних, консервативных семейств. Их возникновение, эволюция и апцестральные функции заслуживают самого пристального внимания. Такие гены, как Pax, Нох, ParaHox, En. Dll и многие другие регуляторные гены из иных семейств, обладают эволюционно «законсервированной» структурой и функцией, но именно они координируют события, сопутствующие ароморфозам и идиоадаптациям.

Согласно «новой (молекулярной) филогении» (de Rosa, R. ei al. 1999), всех билатеральных животных можно объединить в три филогенетические категории: Denterostomia (хордовые, полухордовые, иглокожие), Ecdysozoa (членистоногие, нематоды, киноринхи, приапулиды и пр.) и Lophotrochozoa (аннелиды, плоские черви, моллюски, сипункулиды, брахиоподы, мшанкп и форониды). Так сложилось, что главными модельными объектами молекулярной биологии оказались представители первых двух эволюционных ветвей — такие например, как мышь, шпорцевая лягушка (Deuterostomia) и дрозофила (Ecdysozoa^). Именно на этих организмах впервые были показаны основные закономерности развития и выявлены ключевые гены регуляторных каскадов. Животные третьей эволюционной ветви (Lophotrochozoa) в основной своей массе морские беспозвоночные. Их исследование затруднено, поскольку содержание и репродукция морского организма в лабораторных условиях — уже сама по себе нетривиальная задача. Те немногие из Lophotrochozoa, что доступны исследователям (пиявки, дождевые черви, наземные и пресноводные моллюски) утратили личиночное развитие и сильно видоизменили многие морфогенетические программы.

Между тем, морские Lophotrochozoa — это колоссальная по уровню морфологического разнообразия группа животных. Без исследования ее типичных, а еще лучше архаичных, наиболее приближенных к анцестральному для Bilateria предку, форм, мы не получим адекватного представления о молекулярных механизмах эволюции.

В основу данной работы положена идея о консерватизме структуры и функции регуляторных генов РагаНох-кластера. РагаНох-кластер традиционно рассматривается, как ¡-¡-аналогичный, т. е. сестринский по отношению к Яо. т-кластеру комплекс, представленный тремя генами: Gsh/Gsx, Xlox/Pdx и Cad/Cdx, расположенными на хромосоме от 3' к 5' концу, соответственно. Предполагается, что гены ParaHox-кластера такие же универсальные пространственные спецификаторы, как и Яох-гены. Они осуществляют осевой паттернинг на своем уровне, отчасти перекрываясь с Лох-генами и пространственно, и функционально.

Экспрессия РагаНох-тъноъ у Lophotrochozoa на сегодняшний день почти не исследована. Присутствие всех трех генов этой группы показано для моллюсков (Barucca et al., 2006), сипункулид (Ferrier, Holland, 2001), олигохет (Park et al. 2006) и полихет (Frobius, Seaver. 2006). Очень не многое пока известно о функции Нох/РагаНох-тенов в репаративных морфогенезах у беспозвоночных. По-прежнему остается загадкой роль, которую играют Нох/РагаНох-комппексы в личиночном развитии Lophotrochozoa. Не прослежена динамика их экспрессии по ходу метаморфоза классической, для этой эволюционной группы, сферической ресничной личинки — трохофоры. Для того чтобы решить эти задачи наилучшим образом, важно не ошибиться в выборе объекта. Эррантная, гомономно-сегментированная полихета Nereis virens, в отличие от уже исследованных представителей Annelida, таких как пиявки и сидячая полихета Chaetopterus — менее специализирована. Кроме того, наличие в онтогенезе Nereis virens трохофоры значительно увеличивает ценность этого объекта для изысканий в сфере молекулярных основ эволюции. Nereis virens — сезонный объект, размножающийся раз в году, но, не смотря на этот недостаток, количество получаемых эмбрионов и личинок от одной самки этого вида позволяет проводить на генетически-однородном, синхронном материале, самые разнообразные исследования.

Для того чтобы оценить, какие из функций консервативного регуляторного гена можно назвать исходными, проще всего ретроспективно оценить его паттерны у представителей всех трех ветвей Bilateria. В этом случае, мы сможем сказать, что в его функциях является общим, и, следовательно, древним, а что — частным новоприобретением или коопцией (Arenas-Mena et al. 2000).

Цель и задачи исследования

Основная цель представленной работы — как можно более полно охарактеризовать экспрессию генов РагаНох-кластера у полихеты Nereis virens, чтобы дать сравнительную характеристику общим и частным закономерностям экспрессии этих регуляторов у типичного представителя ветви Lophotrochozoa Эти данные позволят говорить об особенностях Рага/7ох-экспрессии на уровне большой таксономической категории — Eumetazoa и помогут лучше представить гипотетического предка всех Bilateria.

Были поставлены следующие задачи:

1. Выявить паттерны экспрессии РагаНох-генов на разных стадиях ларвального и постларвального онтогенеза Nereis virens.

2. Провести сравнительный анализ особенностей ларвальной и постларвальной экспрессии.

3. Исследовать характер экспрессии РагаНох-тенов, на предмет возможной осевой упорядоченности.

Обзор литературы.

1. История вопроса.

Идея о том, что для понимания морфологической эволюции необходимо идентифицировать гены, которые управляют морфогенезами, выглядит вполне очевидной. Анализ изменений в этих генах в ходе эволюции животных, позволяет приблизится к пониманию причин морфологических нововведений. Полагается, что морфологическую эволюцию, большею частью, определяют модификации в структуре и функции генов, контролирующих развитие. Первые гены, контролирующие развитие, были обнаружены в лаборатории Томаса Моргана (Bridges, Morgan, 1923, пит. по Papageorgiou, 2007) обнаружены еще в первой четверти XX века., однако, после того, как в 1932 году Томас Хант Морган опубликовал свое знаменитое обращение «Восход генетики», эволюцию долго рассматривали, как изменение аллельного состава популяции. И конечно, макроэволюционные изменения (появление крыльев у насекомых, конечностей у тетрапод, совершенство и многообразие оптических систем и многое другое) этим не объяснялись. В начале 80-х годов, Гулд (Gould, 1972) постулировал механизмы, способные дать гомологичные структуры и, в то же время обеспечить быстрые морфологические изменения: гетерохрония (изменение относительного времени событий развития) и аллометрия (дифференциальный рост частей) (цит. по Гилберт и др., 1997). Ко времени, когда Гулд говорил о гомологии морфологической, становилась очевидна гомология молекулярная — были открыты первые генные семейства с выраженной гомологией у разных групп организмов. Фитч (1970г.) вводит в молекулярную биологию два понятия, заимствованных из зоологии: a) Серийная гомология (или паралогичность), — явление гомологии последовательностей в пределах одного индивида (например множественные последовательности ^/-семейства, глобиновые гены, гены иммуноглобулинов, паралогические группы 7/ох-генов) b) Специфическая гомология (или ортологичность), — межвидовая гомология последовательностей (вышеуказанные примеры генных семейств у разных видов).

Согласно гипотезе Бриттена и Коэна (Britten, Kohen, 1968; циг. по Гилберг и др., 1997), тандемные семейства идентичных последовательностей ДНК возникают в результате «скачкообразной репликации» неповторяющейся «архетипической» последовательности. Затем эти дуплицированные копии могут подвергаться независимым мутациям" и отбору. В 1940;х гг. такие гены были обнаружены. Понятие морфологической и молекулярной гомологии увязались между собой самым удивительным образом. Удача улыбнулась Уоддингтону и Гольдшмидту которые идентифицировали у насекомых мутации, при которых сегмент одного типа трансформировался в сегмент другого типа. У некоторых из описанных мутантов части антенны были заменены гомологичными частями ноги, например, кончик антенны был заменен коготком. У других мутантов вся антенна была заменена ногой. Некоторые мутанты вместо гальтер (жужжальца мухи на третьем грудном сегменте) имели крылья, приобретая, таким образом, сходство с более примитивными четырехкрылыми насекомыми. Мутации такого рода были описаны еще в позапрошлом веке, а сам термин «гомеозис» (от греческого homoiosisуподобление, подобие) введен Уильямом Бэтсоном (William Beatson) в 1894 году: «Превращение антенны насекомого в ногу, глаза ракообразного — в антенну, лепестка — в тычинку и тому подобное — все это примеры одного рода. Поэтому я предлагаю термин „гомеозис“, поскольку главное здесь не в том, что произошло некое изменение, а в том, что одно, изменившись, приобрело сходство с чем-то другим» (цит. по Рэфф, Кофмеп, 1986). Уоддингтон и Гольдшмидт полагали, что такие «гомеозисные мутанты» — ключ к пониманию отношений между генетикой, эмбриологией и эволюцией (цит. по Гилберт и др., 1997).

Поиск, клонирование и секвенирование последовательностей, ответственных за гомеозисные трансформации, осуществлялся независимо, тремя группами ученых в Калифорнии, Индиане и Базеле (Bender et al., 1983; Garber et al., 1983; Scott et al., 1983 — цит. по Papageorgiou, 2007). Работы производились на дрозофиле. Оказалось, что все эти гены — серийно гомологичны и кодируют транскрипционные факторы с очень характерным консервативным ДНК-связывающим доменом, который договорились называть гомеодоменом, а кодирующий его нуклеотидный фрагмент из 180 пар оснований — назвали гомеобоксом. Сами гомеозисные, гомеобокс-содержащие гены фигурируют в литературе под аббревиатурой — //ох-гсны (от homeotic и homeobox). Оказалось, что они собраны у дрозофилы в кластер, или генный комплекс, то есть, линейно сцеплены. Кроме того, выяснилось, что экспрессируются они упорядоченно вдоль передне-задней оси и в согласии со своим положением на хромосоме, то есть первый ген (на 3 ' конце ДНК) экспрессируется в передней части эмбриона, а последний (на 5' конце ДНК) в задней его части. Поскольку #ах-гены включены в установление сегментной специфичности вдоль основной оси тела, можно было предположить, что именно они, а вернее изменения.

— 9 В их структурных или регуляторных частях, приводят к наблюдаемым различиям в морфологии членистоногих. По сути, с этого момента, в руках у исследователей оказался инструмент, которым «управляется» морфологическая эволюция.

Льюис (Lewis, 1978) выдвинул первую молекулярную модель морфологической эволюции у насекомых. Согласно его гипотезе, эволюция плана тела у насекомых — целиком зависит от появления новых Лох-генов. Эти новые Нох-гены возникали путем дупликации, а затем дивергировали, что и приводило к появлению новых сегментных структур. К тому, чтобы сделать такое предположение были палеонтологические, эмбриологические и зоологические предпосылки. Тем не менее, Льюис оказался не прав, потому что вскоре аналогичный набор Яох-генов нашли у позвоночных (Fibi et al. 1988; Ranginib et al., 1989; Godsave et al. 1994; Burke et al. 1995; lloegg, Meyer, 2005), причем мутации этих генов тоже приводили к пространственным сдвигам в структурах, лежащих вдоль оси тела.

Вскоре выясиилось, что уровень специфической гомологии у Нох-последовательностей так высок, что в некоторых случаях можно было компенсировать мутантный фенотип дрозофилы гомологичной последовательностью мыши или человека (Awgulewitsch, Jacobs, 1992; Malieki et al., 1992). Стало очевидным, что /fax-гены появились очень давно, во всяком случае, еще до разделения Bilateria на первичнои вторичноротых, которое произошло примерно 600 млн. лет назад. Диверсификация сегментов не могла определяться появлением новых Яох-генов.

Открытие этих и многих других эволюционно-консервативных генных семейств, имеющих стереотипный паттерн экспрессии, породило целый ряд новых вопросов. Одна из таких загадок получила название — «//аг-парадокс» (Wray, 2002). Суть парадокса в том, что несравнимая по уровню морфологического разнообразия совокупность билатеральных животных, использует один и тот же набор регуляторов для построения принципиально разных тел. Разрешить этот пародокс возможно, если предположить, что основная вариабельная «часть» программ развития приходится на гены, находящиеся в регуляторной иерархии выше («upstream») и ниже («down-stream») по отношению к Нох-кластеру.

Антонио Гарсиа-Беллидо (Antonio Garcia-?ellido. 1975) выдвинул идею о том, что Лох-гены — селекторы (переключатели), которые делают выбор между альтернативными состояниями детерминации на уровне метамера. Универсальность и удивительная консервативность Яох-генов становится вполне объяснимой, если предположить, что эти регуляторные гены работают, как устойчивые бинарные переключатели. Такие гены могут быть только «включены» или только «выключены» в каждом конкретном метамере, потому что любые другие варианты приводят к гомеозисным трансформациям, которые у высокодифференцированных членистоногих несовместимы с жизнью. Если это так, то эволюция касалась только Лох-подчиненных генов, то есть генов-ннтерпретаторов Нох-кода. Великолепные экспериментальные работы Шона Кэрролла (Sean В. Carroll), вышедшие во второй половине 90-х, наглядно показывают селекторную функцию Лох-генов и их эволюционную роль в диверсификации планов тела у артропод. В частности, Кэроллу удалось доказательно продемонстрировать то, каким образом шла эволюция придатков тела у насекомых (Carroll et al., 1995; Carroll et al., 2001 — Galant. Can-oil, 2002; Carroll, 2005).

Работы Томаса Кофмана (Thomas С. Kaufman), и Майкла Эйкема (Michael Akam), прекрасно иллюстрируют богатство и одновременно универсальность механизмов морфологической эволюции (Akam et al. 1994; Akam, 1995: Abzhanov, Kaufman, 2000aHughes, Kaufman, 2002aHughes, Kaufman, 2002b). В последние годы вышли работы, в которых строгая метамерная селекторность Лох-генов не подтвердилась (Akam. 1998a, bAkam. 2000). Эти гены способны к значительно более пластичной регуляции, и являются бинарными переключателями, скорее, на уровне отдельных клеточных клонов, а не метамеров в целом. Важно, что при удивительном консерватизме кодирующей части (хотя, и здесь есть интересные примеры модификаций), основным инструментом морфологической эволюции является тонкая игра на уровне сложно организованных, модульных регуляторных зон самих Лох-генов и их мишеней, во всех плоскостях регуляторной иерархии. Это наглядно подтверждено в исследованиях Дэвида Стерна (David L. Stern) (Stern, 2003), который изучал тонкие аспекты экспрессионной активности одного из Лох-генов у нескольких видов рода Drosophila и показал, что некоторые морфологические различия между этими видами — напрямую связаны с незначительными вариациями в активности данного гена, а это, в свою очередь, обусловлено дивергенцией его регуляторных сайтов.

Важное обобщение, проистекающее из консерватизма структуры и функции Лох-генов, сделал Слэк (Slack et al., 1993). Он ввел понятие «зоотипа» и «филотипической» стадии, которую проходят в своем развитии все билатеральные животные и которая характеризуется пространственно-колинеарной экспрессией Лох-генов. Такое принципиальное сходство легко объяснить общностью происхождения современных билатеральных животных от единого предка, который тоже использовал Яох-гены для регионализации тела вдоль передне-задней оси. Анализ аминокислотной последовательности гомеодоменов и фланкирующих гомеодомен участков, у животных из разных эволюционных ветвей, сильно изменили устоявшуюся филогению билатеральных животных (de Rosa el al. 1999). Оказалось, что эволюционное древо билатеральных животных делится у основания на два больших ствола (рис. 1): BTopH4HopoTbie=Deuterostomia (хордовые, полухордовые, иглокожие) и riepBH4HOpoTbie=Protostomia, которые, в свою очередь, подразделяются на Lophotrochozoa (брахиоподы, немертины, аннелиды, моллюски, плоские черви и др.) и Ecdysozoa (артроподы, онихофоры, нематоды, приапулиды и др.) (de Rosa et al. 1999). Сами термины — Ecdysozoa и Lophotrochozoa, не нашли пока синонимов в русском языке. Термин Ecdysozoa — происходит от греческого слова «ecdysis» — линька, поскольку все представители ветви Ecdysozoa животные линяющие, покрытые жёсткой кутикулой. Их рост сопровождается периодическими линьками, когда старые покровы сбрасываются, и животное быстро растёт, или, скорее, «расправляется» пока новые покровы не отвердели.

Fruit fly Onychophorari Н Nematode^jgh Priapulid ¦ о а®

4Bt.

Pc*~ РслРаь PeoPe*.

ЧГ й ES m ® ??i.

1М-Й pattSJ из ra.

Poivchaete.

NrfIY"™ N* NnNn-Btxl odasшna? b.

Ш7 LorG Lixt20 LoxS Lot2 Loxi r" j ra? ? ra.

Lt.

LMial Lgtart I. HW Ho, 7 Hax? UHaD.

— NemerteanTP? П Ш? ?

Фг m pntu Ut atxxG a OtvtC Oi OftmC OttxxF г i 3 toiB IWI ЬахЛ Рта S (ш£ fj"7 ftxHfji Ь.

Я— Fia (worms Щ Ш СО аШИШ Э.

Pw~ лLF. ftОft" — fu.

Sastead ТГ Ж m § ffi tt вшьтм1&tradew Siiii ir «er.

Moitse Amphioxus.

Sp Sp.

Sea urchin.

Sp Sp Sp Sp Sp Sp Sp.

B^ag gg Н'-ч^ n^VIQ Нс^ицз* Ha^u^t.

Рис. 1. Новая «молекулярная» филогения Bilateria. В — BilaieriaDDeuterostomiaР — ProtostomiaL — LophotrochozoaE — Ecdysozoa. В красной рамке — полный набор (комплемент) Нох-генов Lophotrochozoa, найденный у Nereis virens (из de Rosa ct al., 1999).

Термин Lophotrochozoa — произошёл от двух других зоологических терминовLophophorata и Trochophora. Lophophorata — группа животных, которая неожиданным образом вошла в состав Protostomia, а раньше рассматривалась как самостоятельная группа, у которой был недавний общий предок с вторичноротыми животными. Trochophora — ресничная сферическая личинка, характерная для большинства Lophotrochozoa.

Эта новая «молекулярная» филогения, совпала с выстроенной ранее, но не принятой всерьез филогенией по 18s рДНК (Field et al., 1988) и, несколько позже, по митохондриальной ДНК (Cohen et al. 1998b). Сравнительный анализ последовательностей Яодг-генов свидетельствовал, что общий предок билатеральных животных, находящийся в основании этих трех эволюционных ветвей, уже обладал, по меньшей мере, семью //ox-генами (de Rosa et al., 1999) и тремя ParaHox-тенши (Jimenez-Guri et al. 2006). Как выглядел этот общий предок, какие процессы вели к его возникновению и чем вызвана беспрецедентная радиация его потомковвопросы, составляющие парадигму современной науки об эволюции Metazoa.

За последние пять лет, механизмы, лежащие в основе морфологической эволюции, стали в значительной степени понятны. Появились замечательные экспериментальные подходы, позволяющие тонко настраивать работу интересующего гена, выключать его в нужный момент развития или стимулировать его эктопическую экспрессию. Появились новые модельные объекты — такие, как представители эволюционной ветви Lophotrochozoa (моллюски, полихеты, плоские черви), которые, в отличие от традиционных (дрозофила, нематода, мышь) менее специализированы, а потому более ценны для понимания анцестральных функций ключевых генов развития. Вероятно, благодаря молекулярно-генетическим исследованиям этой группы животных, в ближайшее десятилетие основополагающие этапы морфологической эволюции Bilateria, будут доступны для теоретической реконструкции на молекулярном, то есть базовом, уровне.

выводы.

1. Метаморфоз несегментированной личинки Nereis virens — трохофоры — в сегментированную метатрохофору сопровождается пространственно-колинеарной экспрессией генов РагаНох-кластера в пищеварительной и нервной системах.

2. Ларвальная экспрессия трех Nvi-ParaHox-генов в пищеварительном тракте полихеты ассоциирована с четко дифференцируемыми отделами трехчастной дефинитивной кишки и может осуществлять осевую регионализацию зачатка.

3. Постларвальная активность Nvi-РагаНох-геков в нейроэктодерме, колинеарна в пределах каждого нейромера, а не целого организма, и затрагивает единичные клеточные группы вдоль передне-задней оси каждого постларвального нейромера.

4. Ларвальная экспрессия Нохи РагаНох-генов Nereis virens отличается от их постларвальной экспрессии, подтверждая теорию первичной гетерономности сегментов.

5. Nvi-Cad важный участник гаструляционных топологических преобразований и эта функция ортологов cad консервативна для Bilateria.

6. Все гены РагаНох-кластера демонстрируют индивидуальные (не колинеарные) паттерны экспрессии, и эти паттерны эволюционно консервативны.

HpiLio.weiiue 1 Nvi-Gsh ga gag tgt ccg aat ggt cta gaa gtg acc cac tta gta tgt aga ecpnglevthlvcr tgg ccg att att caa cgc att tgg aaa taa cag ccc ttt att gag wpiiqriwkoqpfie taa att agc gca caa aaa aag gga tat ttt tgc ggc att tcc cac oisaqkkgyfcgish ctc ggt ggc cta ctg aac aga aac tca gag gtt gta gag gtt ggc lggllnrnsevvevg tct tct gag atg ttt tag tgt ctg gga agg gag tga agg ggt ctt ssemfbclgrejrgl cag aat ggt caa taa ttt ggc tat ttt ggg qngqofgyfg.

HHTpOH 177 n. O, taaatgatacagggagcaaat tt gttgt tatgagatct tacatacacct taaaacat t cgagctcagcaagacatcatatcctgaatggacagaagttaccgtattcatccccctg atctcttgatggcctaattgtgcaaaatttttaattgatgaatttatttgtctctttt gca ggg ggt gca cca gtt act aac gca gac ata gaa gat gct aac ggc ggapvtnadiedang aaa aga atc cgc aca gct ttc acc agc acc caa cta ctc krirtaftstqll gag tt e gaa aga gaa ttt tcc agc aac atg tac tta tcc aga ctc aga BS e r e f s s n m y l s r l r r lata gaa atc gcc acc tat ctc aat cta tcg gaa aaa cag gtc x e i a t y l n l s tac e aag k aag Q gaa V ggt k gtc.

Iatc tgg ttc caa aat cgt cgc gtg aagI i w f q n r r v k y k K e g V acg gat tct cgc gat aaa tgc cga tgt ttg cgc acg tgc tca tca t D s R D K c R c L R t c S S tca cgt ggt agc aag aga tca act tcc cct agc gag tgt tcc atg s R g S K R S T s p S E c s M aac tac gaa ggt cac aga cat agc gat gag gag gac att gtt ctg.

N Y E g H R H S D E E D I V L acg gaa act gac tct aaa gaa att aac gta gaa gac gac act gac t E T D S K E I N V E D D t D cat aat gtc act tgt cca caa agc ttt tcg cca tga.

H N V t c P Q S F S p stop.

3' UTR 464 n.o. caatttgccgcagttgtaaacaaatgggacacttgcttaactgttgtacgagacgaga aagacaatac caag t acat t aat g at gct agaat catcgacat taa t t t g aag t gaca tgtttaaccattaccattgacctgaccaccaaatatgatgtgcttatatacataatat gtgcttaaactgtaggctcaatcaacatttgtgaaagtttgtaattttgatttttaaa at cag tatctttctatgatcattactgttgcattc cacc c t g t gat aagcaataac aa atttacttacacaccaatcaacacatcaatcaaatcacttgattcaatcaaatatcac ttgattcaatcatctatcacttgattccctacgtgtcttgcaataacattgtgcctgt g cat tatattatat tacat ta cat t gaaaac attttacctgtatttgtattttgatgt aaatactttattgttattta.

Nvi-XIox.

Интрон 571 и.о.

ATCCTCCTGGGGCGAGAGATGATAAAAAGGCAAAGAAAAAAGACTGGATCTCCACCAAAC AAAGAAAA TAAT TACGACTCTA TAAGAAAAATAG T T G G С T T TAnCC СAAAGAATAAGA TATA AGAAATAGT T TCAAAGCAGTTTTTGCACTTTTTGTGCAGTTTTTATATTTTTTTGTGCAGTT TTTATACTTTGTGTGCAGTTTTTATАСТАТTTGTGCAGTTTTTATACTTTTTGTGCATAAAA CTGGCTGTTTGCATGTATGTG TGAACGC TAAAAG GTT TCAT CGT С АС С СAAAG ТСАТТАТСТ GTTCTGTTCTGTGCAAAATGCCACGTTCACCTTTGCTTTGAAACATTATCAGGATTTTCCAG СATG TCAC CATCATGGGCCTGTGTAG TAGACA T СAC TGCA T G CAC GACAT ТС СААССАССАА T T G T GATAAA СAAAT T G С ACAAC T AAAACAAG TCCACACATATCACAGGTAT СACAGG T AC A С T G T T GGAG GGACGGATCCACT CAGT TCC GAT TTTGATATCTGTTACCC AAAT TATAAT TTC AATAT TTTAATT ТСA.

GGA GCC AAC CTG GAC TTC ACT GAC GA GANLDFTDE h AAC AAG CGC ACG AGG n к r t r t gcc tac act cgc tct cag ttg a y t r s q l.

GAG TTG J.

ШШ ¦

2*1 в.

AAA GAA TTC CAT TTT AAC AAA TAC АТС TCT CGC CCC AGG AGG АТС GAj Я К H n К s Е.

CTG GCT ТСС ATG СТА AGС ТТА АСС GAA AGG CAC АТС s M Е H aaa att tgg ttc ca i к i w f q g aat cga aga atg aaa tgg aaa aag gac gaa gca aag cga cgg ccg cgc с n r r mkwkkdeakrrpr ct ctc tcg gaa tca gac gac aac aaa gat тсс тсa gat gct ggc gac атс plsesddnkdssdagdi.

TCG TGT АСА AAA CAA GAA GTG CCG GAT AAG GAC AAT GAT GAG AAT GGC AA SCTKQEVPDKDNDENGN.

С AGT GCT CTT GAG AAC AAA AAT GAC AGС AAA GGT GAA CGC ATT GAT GCA A SALENKNDSKGERIDA at gaa cag gac ttt tcg аса gaa gac aga gtt tca cca gac tct gca tat neqdfstedrvspdsay tca gaa gac atg аса aag aga gga cag gat тсс cct tca cct gat aaa ac se dmtkrgqdsps pdkt.

G AGA ACT GTG TGA CTT CCT GTA AAT ATT GAA CCT TAA TTC TCA АТС AGT T RTVJLPVNIEPOFSIS.

CA GAG TCT GCA AAA CTC ATT GTG CAA AGA ACA GTC TAA АСС TTG GTG CAT SESAKLIVQRTVOTLVH.

TAA CAT TTT TCA TTA GAT TTT CAT GTA GCC TTA CTT ATT GTT CAC TTT GA OHFSLDFHVALLIVHFD с tta tat gtt cag cat caa tta agt agc aaa gaa taa taa aag tga aaa g.

LYVQHQLSSKE Stop 3' UTR 382 и.о. acttcagt cgaaaaataac ac tac t atagat gaact at tacatatag tgacctact gag gcaat tata ttttctcttaattaaacaatgtaagaaaaatataatcagtgccataactcaggagatattggataatt t t t t с t t taat gaatасс сaaagag gcaacgacac с gag g gaaagggcaat gcttcactt gtaaaatg gctggtgggtcttgttaatttttcattgatgcaatttatgtaatcatgcaatgtttgaaaatgttatt ttcattcgactttgtgttgataatcattgtaaataaataacaaaatcacaatcagaaaaaaaaaaagc ttgtcatagctgtttcctg ^ç-ctatactgagtcgtatтлеa.

Nvi-Cad.

AGT CGG AAA ATT TCT CAG CTT GTT ТСС TTC ATA ACA TAC АТС GTC TGC SRKISQLVSFITYIVC.

TAC TGC GCA CAG TAT TTT CAT AAC AGС TTC ACT CTG rGC TGT CAA CTC YCAQYFHNSFTL? CQL tac att ttg aaa ggc aaa aag gca gtc aat agc aaa att tat cac ста y i l к g к к a v n s к i y h l ctt cag ctc taa tct tgg gga aaa aaa ttc att cg a gtg ttt act tgt l q l 0 s v) g к к f i r v f t с gga ata ctt tga cag tca ctg ttc ttt gat gtt ata tcg taa cac ttt g i L j q s l f f d v i s 0 h f ccg ttt cgt gtc gtc ctt ata att ata att ctt tat gat cca ttg tcg p f r v v l i x i i l y d p l s ttg gtc aaa aat tcc ttt aac gtc att aga gat ttt tga tgt аса tcc l v к n s f n v i r d f a с t s ggc tga ttt att tat ttt атс ttt gat gtt aat gtt ttt aat ttt ttt g J f i y f i f d v n v f n f f ttg ggt cgt cca cca ttt gtg act ttg att gtt tta tta aaa cgt ttg l g r p p f v t l i v l l к r l аса ttt att ttt tca gga aag аса aga аса aag GAC AAA TAC AGA GTC t f i f s g к t r t к D к Y R V.

GTT V TAC Y ACT t GAT D CAT H CAG Q AGA R ictg gag ttg gag aaa gaa ttc cat tacl.

L E L E К E F H Y.

Itca aga tac att аса at с aga aga aaa gct gag ctt gct cag aac CTCl s R Y I T I R R К A E L A Q N L aat ctg tca gaa aga caa gtc aag att tgg ttc cag aac agg cgt gct1.

N X. S E R Q V К X W F Q N R R A.

SE к нитрон 274 п.о.

G ТААТ ТACATATAAAG Т ТAT G GАААСATАА Т Т С Т Т С ТААААА Т Т АААТA GGCC ТAAG Т Т G TCTAGGCCTAATCCGGAATGTAATTTAATCCATCCAGCTGGATATGAAGCAATTATAATG GGTCTATATAGACCCTAATATTAATAAAGCTATTTTAATGAACAAATGTTGAAAATTGAG TGGGTTAGTGTGTTAATAGAGTCAACTACGCCTGTAGACACGTTAATTGTTAAATGATTA TTTTCTAACAAATATTTTTCCATTTTAATTTTAG.

GAA CGC AAA CAG AAC AAG aaa cgg gaa gat ggt atg caa gga gcc gga erkqnkkredgmqgag.

AGC GGC GCC GTC AAC GTC AAG ACG GAA CTT TCG CCA GGA ACG TCA GGA SGAVNVKTELSPGTSG.

AGC AGC GTC ACG TCA CCA ACG CCA AAT TTG ACG TCA CCA GGC ATG GCA SSVTSPTPNLTSPGMA.

CAC CCT ATG GGC CCG TCA CCG H P M G P S P.

И ь ^ «Ч «ь.

32И.

С — • • 1* (*¦ щ 9 ". Г'.

34Ь.

11 ! I / у т к ш.

5(Ж.

Заключение

.

Идея о возникновении «мегакластера», состоящего из NK-, Нох-, и ParaHox-кластеров, каждый из которых на заре становления Triploblastica паттернировал один из трех зародышевых листков, отчасти подтверждается нашей работой. Действительно, гены ParaHox-кластера Nereis virens демонстрируют раннюю, по сути эмбриональную, экспрессию в зачатке пищеварительной трубки и такая экспрессия наглядно колинеарна. Это первые данные, подтверждающие гипотезу Питера Холанда (Holland, 2001), о ключевой роли ParaHox-кластера в аксиальной регионализации пищеварительного тракта. Однако, это не единственная функция.

Nvi-РагаНох-генов. Все они заняты в спецификации судеб отдельных клеток брюшного нервного ствола. Nvi-Gsh и Nvi-Xlox экспрессируются в эписферной (головной) нервной системе. Участие РагаНох-теноъ в нейральных дифференцировках показано для большинства исследованных Bilateria, поэтому, эта их функция может оказаться не менее древней. Кроме того, очень древними выглядят функции Nvi-Cad, связанные с процессами гаструляции и сегментации.

Механизмы, интегрирующие РагаНох-кластер в единую векторную систему, часто теряются по ходу эволюции. Следствием такой утраты является «разорванность» кластера, его «не полность», когда отдельные гены просто элиминируются из генома, или, утратив базовые функции, дивергируют до неузнаваемого состояния. Очевидно, что такие структурные перестройки сопутствуют функциональным. За исключением шс/-ортологов, которые практически не «теряются» и заняты в очень ранних морфогенезах, остальные ParaHox-тены не участвуют в разметке общего плана тела. Ранняя осевая экспрессия Nvi-РагаНох-тенов в пищеварительной трубке, показана нами впервые. Мы наблюдаем её у примитивной полихеты, вероятно близкой к общему предку Annelidae, а по мнению ряда авторов (Raible, Arendt, 2004; Arendt, 2005; Raible et al., 2005; de Rosa et al., 2005; Steinmetz et al., 2007), и к предку всех Bilateria. Возможно, функция осевой регионализации была утрачена РагаЯох-кластером еще на ранних этапах эволюции Bilateria, но примитивные Lophotrochozoa сохранили в своем онтогенезе стадию, когда эта функция еще востребована. Если это так, то механизм, координирующий раннюю экспрессию Нохи РагаНохгенов — общий, он продиктован единством происхождения этих кластеров и был заложен в предковом ProtoHox-кластере. Сравнительный анализ экспрессионного паттерна РагаНох-генов позволяет лучше представить гипотетического общего предка билатеральных животных — Urbilateria. По всей видимости, этот предок использовал кластер РагаНох-тепов для осевой регионализации пищеварительного тракта. Кроме того, экспрессия, по крайней мере, двух генов из трех — xlox и cad, была важна для более поздних процессов спецификации, а в дальнейшем, для поддержания этой спецификации в клетках дефинитивной кишки. С очень высокой вероятностью, ген cad был интегрирован у Urbilateria в программу гаструляции. Разница в молекулярных механизмах сегментации у позвоночных, членистоногих и полихетвелика, но, во многих случаях, ген cad внедрен в программу субтерминального роста, следовательно, он мог быть причастен к аналогичному процессу у общего предка Bilateria. Ранняя экспрессия гомологов gsh в зачатке головного мозга отмечена абсолютно у всех исследованных билатеральных животных. Очевидно, что такая функция очень древняя и унаследована от общего предка. Возможно, xlox так же был причастен к паттернированию головного мозга Urbilateria, поскольку гомологи xlox экспрессируются в эмбриональном мозге у крысы (Percz-Willamil et al. 1999; Schwartz et al., 2000) и полихеты Nereis virens. Вопрос об анцестральной экспрессии РагаНох-т&ноъ в туловищной мезодерме (эндомезодерме) остается не ясным. Для Nvi-РагаНох-гсноь экспрессия в мезодерме не показана. Однако, у хордовых, некоторых аннелид (Tubifex, Capitella и, возможно, Platynereis) и моллюсков (Patella) мезодермальная экспрессия гомологов cad имеет место. Возможно, Nereis virens утратил эту анцестральную функцию гена cad относительно недавно. Вопрос о первичных и вторично-приобретенных функциях кластера РагаНох-тенов не решается простым сравнением исследованных паттернов. За редким исключением (экспрессия гомолога cad в головном мозге и глотке у Capitella) домены экспрессии этих генов эволюционно консервативны, то есть, отмечены в гомологичных структурах у представителей всех трех эволюционных ветвей Bilateria. Возможно, базовая функция РагаНохг-кластера была связана с регионлизацией пищеварительной трубки. Однако, немногим позже, или одновременно с этим, РагаНох-гены стали участниками других важных морфогенетических программ, отчасти связанных с аксиальной спецификацией (экспрессия cad и xlox в дефинитивной кишке), или не связанных с ней вовсе (ранняя эмбриональная экспрессия cad при гаструляции, экспрессия gsh в головном мозге). Этот сценарий вероятен, если мы придерживамся «классического» взгляда на происхождение РягаЯо. г-кластера, как паралога кластера Яох-генов. В этом случае, все гены РагаЯолг-кластера появились одновременно, унаследовав от предкового комплекса такой способ регуляции экспрессии, который сразу интегрировал их в единую систему (Brooke et al., 1998; Garcia-Fernandez, 2005(b) — Kourakis. Martindale, 2000). Альтернативный сценарий предполагает последовательное, «Яох-независимое» возникновении одного или даже двух генов ParaHox-кпастера (Garcia-Fernandez, 2005; Ryan et al., 2007). В этом случае, «частные» функции отдельных генов могут оказаться древнее общей функции осевой регионализации. Последняя могла возникнуть, а вернее «проявиться» уже после того, как РагаНохг-кластер стал трехгенным. Однозначный выбор между этими сценариями пока невозможен. Чтобы «первичное» отсутствие последовательности не принималось за ее «вторичную» утрату, и наоборот, необходимо иметь четкое представление о порядке отхождения эволюционных ветвей примитивных таксонов от общего ствола филогенетического древа Ешп^агоа.

Наши данные недостаточны для широких эволюционных обобщений, поскольку их трудно сравнивать — примитивные представители других крупных таксонов пока не исследованы в отношении осевой экспрессии РагаНох-генов. Кроме того, серьёзные рассуждения о функции любого гена предполагают проведение функционального теста, который пока не сделан. Очевидная польза этой работы в том, что она направляет и уточняет пути, по которым можно двигаться дальше, при решении некоторых фундаментальных проблем эволюционной биологии развития.