Генетическая вариабельность вируса гепатита В по PreS1/PreS2/S генам у пациентов с хронической НВ-вирусной инфекцией

В настоящее время проблема гепатита В (ГВ) сохраняет свою актуальность и является одной из социально-значимых инфекций в Российской Федерации. Несмотря на наличие эффективных средств профилактики гепатита В, таких как активная и пассивная иммунизация, противовирусных препаратов, по данным J.M. Pawlotsky (2005) более 350 млн. людей во всем мире хронически инфицированы вирусом гепатита В (ВГВ). Одним из ведущих аспектов проблемы ГВ является генетическая вариабельность возбудителя этого заболевания, которая обусловливает, в ряде случаев, недостаточную эффективность вакцинации, серологической диагностики, а также лечения противовирусными препаратами.

Проблема вариабельности ВГВ становится более значимой для медицинской практики, поскольку частота встречаемости генетических вариантов ВГВ растет, особенно в регионах с высокой заболеваемостью. Принятые и реализуемые национальные и международные программы вакцинопрофилактики ГВ, широкое применение химиотерапевтических средств являются активными селективными факторами, способствующими распространению редко встречающихся и ускользающих вариантов вируса.

Одной из составляющих проблемы генетической вариабельности ВГВ является вариабельность pre-Sl/pre-S2/S генов вируса, кодирующих оболочечные белки вируса. Прошло почти 20 лет с тех пор, как появилось первое сообщение о способности мутантных форм вируса по S-гену ускользать от индуцированного вакциной иммунитета [W.F.Carman et al., 1990]. Последующий период характеризовался накоплением данных о вариантах ВГВ, которые вызывали проблемы в серологической диагностике или лечении инфекции, а также их распространенности в популяции [W.F. Carman, 1997; P.F.Coleman et al., 1999; C. He et al., 2001; M.S.Ho et al., 1998; J. Hou et al., 2001; J.H.Ireland et al., 2000; K.M.Lee et al., 2001; B. Moerman et al., 2004; C.J.Oon et al., 1996; C.J.Oon et al., 1999; L. Roznovsky et al., 2000; S. Seddigh-Tonekaboni et al., 2000]. В России данные об обнаружении различных вариантов ВГВ единичны и недостаточны. В связи с этим представляет интерес изучение распространенности генотипов, субгенотипов и различных вариантов ВГВ среди хронических больных в различных регионах Российской Федерации, характеризующихся различной интенсивностью эпидемического процесса вирусного гепатита В и этническим составом населения.

В настоящее время отсутствуют данные о возможностях иммупоферментных тест-систем (ИФТС), применяемых в Российской Федерации, выявлять HBsAg, принадлежащий различным генотипам и субгенотипам ВГВ, в том числе и известным мутантным формам вируса. Выполнение таких исследований позволит существенно повысить качество серологической диагностики гепатита В.

Изложенное выше послужило основанием для выполнения работы по изучению современных проявлений эпидемического процесса гепатита В на территории Российской Федерации и отдельных федеральных округов, определению структуры генотипов, субгенотипов ВГВ в различных регионах страны, генетической вариабельности pre-Sl/pre-S2/S генов у изолятов ВГВ, выделенных у пациентов с хронической ЫВ-вирусной инфекцией, а также оценки способности современных тест-систем определять HBsAg, принадлежащий различным генотипическим, серотипическим и мутантным формам вируса.

Цель и задачи исследования

.

Цель работы — изучение динамики заболеваемости гепатитом В на территории отдельных федеральных округов РФ, генетического разнообразия циркулирующих изолятов ВГВ, а также оценка диагностических возможностей тест-систем для детекции HBsAg.

Для достижения указанных целей были поставлены следующие задачи:

1. Рассчитать многолетние тенденции динамики заболеваемости регистрируемыми формами гепатита В на территории России, а также.

Центрального, Южного и Дальневосточного федеральных округов за период с 2000 по 2006 годы;

2. Изучить генетическую вариабельность pre-Sl/pre-S2/S генов вируса гепатита В у лиц с хронической НВ-вирусной инфекцией, а также структуру циркулирующих генотипов на территории Центрального, Южного и Дальневосточного федеральных округов;

3. Охарактеризовать диагностические возможности коммерческих тест-систем для детекции HBsAg.

Научная новизна.

Выявлена значительная территориальная неравномерность по уровню заболеваемости регистрируемыми формами гепатита В (суммарные показатели) по трем федеральным округам Российской Федерации. В Дальневосточном округе уровень заболеваемости гепатитом В при использовании метода сигмальных отклонений определен как высокий. Наиболее благополучными являются Центральный и Южный федеральные округа, уровень заболеваемости ГВ в которых квалифицирован как низкий и ниже среднего.

Установлены различия в структуре циркулирующих генотипов ВГВ па исследуемых территориях: в Центральном и Южном округе с наибольшей частотой обнаружен генотип D (87%), тогда как в Дальневосточном округе генотипы, А и D составляют по 44% и генотип С — 12%.

Впервые на основании широкомасштабных молекулярно-генетических исследований изолятов ВГВ, циркулирующих на различных территориях Российской Федерации, установлено, что в pre-Sl/pre-S2/S области генома ВГВ, наиболее вариабельными участками оказались область pre-S2/S промотора у изолятов генотипа D (до 31% нуклеотидных замен), 5'- конец pre-S2/S генов у изолятов генотипа С (до 54%) и 3'- конец S-гена у изолятов генотипа, А (до 28%). При этом область S-гена, соответствующая главному гидрофильному региону (MHR) была менее вариабельной (до 25% нуклеотидных замен у изолятов генотипа А).

Положения, выносимые на защиту.

В результате проведенного эпидемиологического анализа рассчитаны многолетние тенденции заболеваемости регистрируемыми формами гепатита В на территории Российской Федерации, Центрального, Южного и Дальневосточного федеральных округов в период с 2000 по 2006 годы: а) для совокупного населения установлено:

— выраженное снижение заболеваемости острым гепатитом В и носительства ВГВ ('Тсниэ1сения=>-5,%), стабильный уровень заболеваемости хроническим гепатитом В (Т снижения — -1%) — б) для детей до 14 лет установлено:

— выраженное снижение заболеваемости острым, хроническим гепатитом В и носительства ВГВ (Тснижения — >-5,1%).

Для изученных изолятов ВГВ, циркулирующих на территории трех федеральных округов, показана более высокая генетическая вариабельность областей pre-Sl, pre-S2 генома, по сравнению с участком S-гена, соответствующего главному гидрофильному региону (MHR).

Зафиксированы существенные различия в чувствительности четырех коммерческих тест-систем для детекции HBsAg — при определении HBsAg, принадлежащего генотипам D и, А они достигали 44 и 40 раз соответственно.

Различия в диагностических возможностях тест-систем для детекции HBsAg не всегда обусловлены наличием замен в «а"-детерминанте главного гидрофильного региона HBsAg.

Практическая значимость.

Оценка диагностических возможностей четырех тест-систем для детекции HBsAg на примере изученных изолятов ВГВ показала, что тест-системы «Roche Elecsys HBsAg» (основана на хемилюминесцентном методе детекции) и «Abbott AxSYM HBsAg (V2)» (основана на методе флюоресцентно-поляризационном иммунном анализе) являются более чувствительными тестами в отношении генотипических (генотипы, А и D) и мутантных форм (М133Т, P120S) HBsAg. Отечественная тест-система — «ДС.

ИФЛ-HBsAg" продемонстрировала сравнительно более низкие диагностические возможности при детекции HBsAg, особенно в отношении некоторых изолятов генотипа, А (серотип ad) и мутантных форм HBsAg.

Выявленные различия в диагностических возможностях разных тестов при детекции HBsAg с установленными генотипами, субтипами и мутантными формами обосновывают необходимость создания экспертных панелей, содержащих образцы с наличием HBsAg различных генотипических, субтиповых и мутантных форм принадлежности.

Внедрение полученных результатов.

Материалы диссертационной работы использованы при разработке приказа Министерства здравоохранения Республики Саха (Якутия) № 01−8/4289 от 31.05.2006 г. «Об обследовании беременных на перинатальные инфекции в PC (Я)».

Научные положения, выводы и практические рекомендации, вытекающие из результатов диссертационной работы, используются при чтении лекций и проведении семинарских занятий на кафедре вирусологии Московской Медицинской академии им. И. М. Сеченова.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на: VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вирусные гепатиты — проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 2007 год) — XV международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Крым, Гурзуф, 2007 год).

Апробация диссертации состоялась 22 мая 2008 года на заседании Ученого совета отдела вирусологии ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

.

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения, выводов и указателя литературы, состоящего из 125 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, включает 24 таблицы и 14 рисунков.

выводы.

1. Эпидемиологический анализ многолетней динамики (2000;2006 годы) заболеваемости гепатитом В совокупного населения в Российской Федерации показал наличие выраженных тенденций снижения заболеваемости ОГВ, носительства ГВ (Т снижения—>-5,1%) и стабилизации заболеваемости ХГВ (Т снижения = -1%.)3 тогда как, для детей до 14 лет выраженные тенденции снижения заболеваемости отмечаются для всех трех регистрируемых форм ГВ (Т сню1сения->-5,1%).

2. Выявлены значительные различия в интенсивности эпидемического процесса гепатита В в отдельных федеральных округах Российской Федерации в период с 2000 по 2006 годы: в Дальневосточном ФО зафиксирована стабильно высокая заболеваемость ГВ (суммарные показатели), в Центральном и Южном — ниже среднего и низкая. Различия между максимальными и минимальными показателями в анализируемый период составляли от 2,1 до 2,5 раз.

3. Показано, что на территории Российской Федерации циркулируют три генотипа ВГВ — А, С, D. На территории Центрального и Южного федеральных округов доминирует генотип D — 87%, удельный вес генотипов, А и С составляет 11% и 2% соответственно. На территории Дальневосточного федерального округа генотипы, А и D обнаружены в 44% каждый и доля генотипа С составила 12%.

4. Впервые для изолятов ВГВ, циркулирующих в различных регионах Российской Федерации, установлена высокая генетическая вариабельность области pre-S2/S промотора у изолятов генотипа D (до 31% нуклеотидных замен pre-Sl/pre-S2/S участка), 5'- концов pre-S2/S генов у изолятов генотипа С (до 54%) и 3'- конца S-гена у изолятов генотипа, А (до 28%) при меньшей вариабельности участка S-гена, соответствующего главному гидрофильному региону HBsAg (до 25% у изолятов генотипа А).

5. Среди изолятов ВГВ, циркулирующих на территории Российской Федерации, гетерогенность генотипа D, представленного тремя субгенотипами (Dl, D2, D3), более выражена, по сравнению с генотипами, А и С, представленными только субгенотипами А2 и С2 соответственно.

6. Выявлены существенные различия в диагностических возможностях четырех тест-систем для детекции HBsAg вируса гепатита В, принадлежащего генотипам, А и D, а также его мутантных форм (замены М133Т, P120S), которые достигали 40−44 раз.

Заключение

.

Таким образом, было показано, что из четырех коммерческих тест-систем для детекции HBsAg наибольшие диагностические возможности проявляют тесты «Roche Elecsys HBsAg» и «Abbott AxSYM HBsAg (V2)» как в отношении генотипических (генотипы A, D), серотипических (серотипы ay, ad) различий, так и в отношении мутантных форм HBsAg (мутации М133Т, P120S).

Отечественная тест система «ДС-ИФА-HBsAg» демонстрирует низкие возможности при детекции HBsAg, особенно в отношении некоторых изолятов генотипа, А (серотип ad) и мутантных форм HBsAg. Это, по-видимому, связано с тем, что в отечественных тестах преимущественно используют моноклональные и/или поликлопальные антитела, направленные на эпитопы HBsAg серотипа ау (генотип D), наиболее распространенного (до 90%) на территории РФ.

Помимо этого, нами получены данные, что не только замены в пределах MHR и «а"-детерминанты HBsAg обеспечивают различия в диагностических возможностях различных тест систем, но возможно и аминокислотные замены в PreSl, PreS2, N-, Сконцах S белка, что в разное время и в разных странах было показано рядом авторов [62, 67, 103].

ГЛАВА 6.

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Проблема вирусных гепатитов с парентеральным механизмом передачи остается серьезной и актуальной для здравоохранения России. Эпидемиологическая ситуация в отношении НВ-вирусной инфекции в Российской Федерации сохраняя напряженность, претерпевает существенные изменения. В последние шесть лет (2000;2006 годы) отмечается постоянное снижение суммарного показателя заболеваемости гепатитом В. Необходимо отметить, что суммарный показатель заболеваемости гепатитом В в 2006 году самый низкий за все время регистрации. Снижению заболеваемости гепатитом В способствовал комплекс широкомасштабных противоэпидемических и профилактических мероприятий, направленных на предупреждение распространения НВ-вирусной инфекции. Основными из приоритетных направлений являются включение в Национальный календарь (2001 год) вакцинации против гепатита В, положившее начало, в масштабах страны, формированию популяции, обладающей протективным иммунитетом, и значительное повышение качества иммуноферментных тест систем, что обусловило более точную диагностику гепатита В. Но, несмотря на это, в разных регионах страны закономерности, характеризующие заболеваемость регистрируемыми формами гепатита В, выражены в различной степени, что обусловлено особенностями регионов России. К особенностям, влияющих на развитие эпидемического процесса гепатита В следует отнести снижение качества оказания медицинской помощи, усиление миграционных потоков, широкое распространение наркомании. Сочетание различных медико-социальных факторов, присущих той или иной территории, приводит к отличиям, иногда весьма существенным, в динамике заболеваемости, структуре путей передачи возбудителя,, а также в возрастной структуре заболевших гепатитом В.

Целью настоящей работы было проведение сравнительного эпидемиологического анализа заболеваемости гепатитом В на примере трех федеральных округов (Центрального, Южного и Дальневосточного) с одновременным изучением молекулярно-генетических свойств изолятов ВГВ, выделенных на территории указанных округов.

Одной из задач работы являлось проследить динамику и структуру суммарного показателя заболеваемости регистрируемых форм гепатита В на территории Российской Федерации, а также изучить многолетние тенденции, характеризующие динамику заболеваемости гепатитом В на территории Российской Федерации и отдельных федеральных округов среди совокупного населения и детей до 14 лет. Использование суммарного показателя позволяет наиболее полно охарактеризовать динамику заболеваемости гепатитом В. Это подтверждают и исследования И. Л. Шаханиной в соавт. (2003), Л. И. Шляхтенко (2003) [22, 26, 27]. С этой целью был проведен анализ динамики показателей заболеваемости регистрируемыми формами гепатита В в целом по РФ (20 002 006 годы) и в Центральном, Южном и Дальневосточном федеральных округах (2000;2006 годы) среди совокупного населения и детей до 14 лет.

Полученные данные позволили дать объективную оценку эпидемиологической ситуации и заболеваемости гепатитом В в трех федеральных округах РФ. В результате выполненной работы выявлены различия в динамике суммарного показателя заболеваемости регистрируемых форм гепатита В, как среди населения в целом, так и у детей до 14 лет.

В многолетней динамике заболеваемость ОГВ в России среди совокупного населения в период 2000 по 2006 годы характеризовалась снижением в 6,1 раза. Наибольший уровень абсолютного снижения (-15,6 на 100 тысяч населения) и максимальный темп убыли (44,2%) имел место в 2002 году. В последующие годы темп убыли снизился и в 2006 году зафиксирован самый низкий показатель заболеваемости ОГВ — 7,0 на 100 тысяч населения. Многолетняя (2000;2006 годы) тенденция заболеваемости ОГВ среди совокупного населения характеризуется выраженным снижением — Т сниэ/сения =>-5,1%.

В 2001 году отмечен максимальный показатель заболеваемости ХГВ среди совокупного населения за период наблюдения, при котором темп и показатель абсолютного прироста имели наибольшие значения +12,7% и 1,8 на 100 тысяч населения соответственно. В последующие (2002;2003) годы уровень заболеваемости ХГВ снизился и ее показатели сопоставимы — 15,0−14,9 на 100 тысяч населения. В 2004 году вновь отмечено повышение уровня заболеваемости ХГВ, однако, темп роста (+4,0%) ниже аналогичного показателя периода 2000;2001 годов. В 2005 году последовало снижение показателя заболеваемости ХГВ до 13,9 на 100 тысяч населения, при темпе убыли -10,3%, что является наибольшим значением в анализируемый период времени. В 2006 году отмечено повышение показателя заболеваемости ХГВ, составившего 14,0 на 100 тысяч населения. Вариабельность динамики показателя заболеваемости ХГВ отражена в многолетней тенденции (2000;2006 годы), которая характеризуется стабилизацией заболеваемости ХГВ: Т снижения = -1%.

В период 2000 по 2006 годы показатель носительства вируса гепатита В на территории Российской Федерации снизился в 2 раза, с 95,5 на 100 тысяч населения (2000 год) до 47,7 на 100 тысяч населения (2006 год). Максимальный показатель абсолютного снижения составил 15,5 на 100 тысяч населения (2002 год). Темп убыли не превысил -18,4% (максимальное значение, 2005 год). Многолетняя (2000;2006 годы) тенденция показателей носительства ВГВ характеризуется выраженным снижением — Т снижения =>-5,1%.

В период с 2000 по 2006 годы суммарный показатель заболеваемости ГВ, включающий все три регистрируемые формы гепатита В, среди совокупного населения снизился с 152,4 до 68,7 на 100 тысяч населения, характеризуясь снижением в 2,2 раза, что свидетельствует о значительном снижении уровня заболеваемости гепатитом В (суммарный показатель) в целом по России. В структуре суммарного показателя заболеваемости гепатитом В среди совокупного населения удельный вес ОГВ снизился с 27,9% (2000 год) до 10,2% (2006 год). Доля ХГВ за тот же период времени увеличилась с 9,3% до 20,4%, а удельный вес вирусоносительства гепатита В составил, не менее, 62% с увеличением доли до 70,5% (2004 год), с последующим снижением до 69,4% (2006). На территории Центрального, Южного и Дальневосточного федеральных округов также зафиксировано снижение суммарного показателя заболеваемости гепатитом В, при этом в Дальневосточном округе отмечено стабильное превышение суммарного показателя заболеваемости в сравнении со среднероссийским за весь период наблюдения, тогда как в Южном округе суммарный показатель превысил среднероссийский уровень в 2003, 2004 и 2006 годах.

Необходимо отметить, что многолетняя динамика заболеваемости ОГВ, ХГВ и вирусоносительства гепатита В у детей до 14 лет, в анализируемый период, характеризовалась выраженной тенденцией к снижению. Начиная с 2000 года и до 2006 года, отмечено устойчивое снижение заболеваемости ОГВ детей до 14 лет — показатель 2006 года (1,2 на 100 тысяч населения) ниже в 8,3 раза, чем в 2000 году. Наиболее интенсивное снижение заболеваемости ОГВ отмечено в 2006 году, когда показатель абсолютного снижения составил 0,7 на 100 тысяч населения, а темп убыли — 36,8%. Общая многолетняя динамика заболеваемости ОГВ детей до 14 лет имела выраженную тенденцию сниженияТ снижения—>-5,1%.

С 2000 года отмечалось стабильное снижение заболеваемости ХГВ с достижением минимального уровня в 2006 году — 1,9 на 100 тысяч населения. Многолетняя динамика заболеваемости ХГВ детей до 14 лет на территории России характеризуется выраженной тенденцией снижения — Ташжения= >-5,1%.

Помимо этого, с 2000 года имело место стабильное снижение вирусоносительства гепатита В с наибольшим расчетным темпом убыли (.

26,3%), выявленном в 2003 году. Общее снижение в период с 2000 по 2006 годы уровня вирусоносительства гепатита В составило 2,9 раза — до 7,9 на 100 тысяч населения в 2006 году. Расчет многолетней тенденции свидетельствует о выраженном снижении уровня вирусоносительства гепатита В у детей до 14 лет на территории России — Тснижения= >-5,1%.

В период с 2000 по 2006 годы суммарный показатель заболеваемости гепатитом В среди детей до 14 лет снизился в 3,4 раза с 37,5 до 11,0 на 100 тысяч населения, тогда как среди совокупного населения в 2,2 раза, что связано с различиями в многолетних тенденциях заболеваемости. Существенное влияние на более интенсивное снижение суммарного показателя заболеваемости гепатитом В, в том числе формированию общей тенденции заболеваемости ОГВ, ХГВ и вирусоносительства гепатита В среди детей до 14 лет, оказала иммунопрофилактика гепатита В [7, 8, 9].

Рассчитанные тенденции многолетней динамики показателей на территории Центрального, Южного и Дальневосточного федеральных округов показали также выраженное снижение заболеваемости ОГВ, ХГВ и вирусоносительсва гепатита В у детей до 14 лет — Тс//ш/сешш=>-5,1%.

Необходимо отметить что, несмотря на снижение заболеваемости ОГВ, ХГВ и вирусоносительства гепатита В у населения в целом и детей до 14 лет, уровень носительства превышает как показатели заболеваемости ОГВ, так и ХГВ. Поэтому, можно констатировать, что ведущую роль, определяющую интенсивность эпидемического процесса гепатита В, как у населения в целом, так и у детей до 14 лет, играет носительство вируса гепатита В, формирующее общие тенденции в динамике заболеваемости ГВ [1, 2, 3, 6, 22, 29].

Важно отметить, что выявленное снижение суммарного показателя, по-видимому, не может быть расценено как существенное снижение интенсивности эпидемического процесса гепатита В среди детей до 14 лет в трех рассматриваемых федеральных округах. С помощью метода сигмальных отклонений выявлена территориальная неравномерность по уровню суммарной заболеваемости гепатитом В среди детей до 14 лет в этих федеральных округах. Эффективность использования этого метода в проведении эпидемиологического анализа была показана ранее И. Л. Шаханиной с соавт. (2003) [22]. Так, было установлено, что Дальневосточный округ можно квалифицировать как регион с высоким уровнем заболеваемости гепатитом В среди детей до 14 лет. Тогда как в Центральном округе имеет место, преимущественно, низкий уровень заболеваемости гепатитом В среди детей до 14 лет, а в Южном округе — уровень ниже среднего. Отсутствие существенных изменений в уровне распространенности суммарного показателя гепатита В среди детей до 14 лет на территории Южного и Дальневосточного федеральных округов обусловлен, по-видимому, недостаточной охватом своевременной вакцинацией, что является сдерживающим фактором дальнейшего снижения заболеваемости гепатитом В.

Изучение молекулярно-генетических характеристик изолятов вируса гепатита В, выделенных на территории различных регионов Российской Федерации показало, что имеет место циркуляция трех генотипов ВГВгенотипы А, С, D. На территории Центрального и Южного федеральных округов преимущественным генотипом ВГВ является генотип D — 87,1%, доля генотипа, А и С составляет 11,3% и 1,6%, соответственно. Иная ситуация на территории Дальневосточного федерального округа, в Республике Саха (Якутия), где генотипы, А и D представлены в равном соотношении по (43,75%) и большее значение по сравнению с Центральным и Южным округами приобретает генотип С, доля которого составила (12,5%). Полученные данные о циркулирующих генотипах и их структуре в целом отражают тенденцию распространения генотипов ВГВ в странах Восточной Европы [48, 111, 119] и на территории центральной и восточной части России [61].

Генотип D на изученных территориях РФ был представлен большим количеством субгенотипов — Dl, D2, D3, по сравнению с генотипами, А и С, которые были представлены только субгенотипами А2 и С2, соответственно.

Тем самым, можно констатировать, что гетерогенность генотипа D более выражена по сравнению с генотипами, А и С, что также было показано в работе [68]. В структуре генотипа D на территории г. Москвы субгенотипы Dl, D2, D3 составили 11,54%, 19,23%) и 69,23%) соответственно. На территории республики Саха (Якутия) структура генотипа D была следующей — D2 (14,3%), D3 (85,7%). Таким образом, можно говорить, что субгенотип D3 является доминирующим в структуре генотипа D на территории исследованных регионов.

Анализ аминокислотной последовательности главного гидрофильного региона (MHR) HBsAg у изученных изолятов HBV показал наличие следующих аминокислотных замен: Q101R, L109Q, L109R, I110L, G112R, S113T, Т114К, Т118А, V118A, V118T, P120S, Р127Т, A128V, М133Т, M133I, Y134N, Y134 °F, G159A. Наиболее вариабельными позициями MHR оказались 109, 118, 133 и 134. При этом замена P120S была описана С. J. Oon el al. 1999 [70] у вакцинированных против гепатит В детей, рожденных от матерей с носительством ВГВ. Также замена P120S в комбинации с заменой S143L в работе J.H.Ireland et al. (2000) [107] были введены в рекомбинантный HBsAg и при детекции подобного HBsAg с помощью семи коммерческих иммуноферментных тест-систем были получены расходящиеся результаты, свидетельствующие о влиянии этих замен на иммунодоминантную область HBsAg. Замены Ml331, Y134N и М133Т были описаны в литературе как вызывающие проблемы при детекции HBsAg с помощью различных иммуноферментных тест-систем [37, 50, 103].

В результате сравнительной оценки четырех тест-систем для детекции HBsAg, нами было установлено, что наибольшие диагностические возможности проявляют тесты «Roche Elecsys HBsAg» и «Abbott AxSYM HBsAg (V2)» как в отношении генотипических (генотипы A, D), серотипических (серотипы ay, ad) различий, так и в отношении мутантных форм HBsAg (мутации М133Т, P120S). Отечественная тест-система «ДС-ИФА-HBsAg» продемонстрировала сравнительно более низкую возможность при детекции HBsAg, особенно в отношении некоторых изолятов генотипа, А (серотип ad) и мутантных форм HBsAg. Это, по-видимому, связано с тем, что в отечественных тестах преимущественно используют моноклональные и/или поликлональные антитела, направленные на эпитопы HBsAg серотипа ау (генотип D), наиболее распространенного (до 90%) на территории РФ.

Выявленные различия в возможностях обнаружения HBsAg этими тест-системами при использовании стандартных образцов ОСО свидетельствуют о необходимости разработки и аттестации независимых экспертных панелей, с целью получения объективной оценки качества иммуноферментных тест систем, применяемых в диагностике НВ-вирусной инфекции на территории Российской Федерации.

Некоторые образцы сывороток давали значительные расхождения в диагностических возможностях четырех тест-систем. При анализе аминокислотной последовательности «а"-детерминанты и MHR HBsAg этих образцов было показано, что их последовательности были идентичны некоторым изолятам ВГВ, которые не проявляли существенных различий в этих четырех изучаемых тест системах. В ряде работ [62, 67, 103] указывалась возможность влияния на детекцию HBsAg изменений генома ВГВ не только в рамках MHR и «а» -детерминанты S гена, но и в PreSl/PreS2 генах, 5'- и 3'-концах S гена.

При анализе нуклеотидных замен на участках генома вируса, соответствующих PreSl/PreS2/S генам, у изолятов ВГВ, выделенных на территории г. Москвы, г. Череповца и Республики Саха (Якутия), было установлено, что нуклеотидные замены в основном сосредоточены в PreS2/S промоторном участке, 5'- концах PreS2/S и в 3'- конце S-гена. Участок S-гена, соответствующий главному гидрофильному региону (MHR) HBsAg у большинства изолятов являлся менее вариабельным по сравнению с другими участками оболочечных генов ВГВ. По данным J. Hou et al. (2001) [101] и K.M.Weinberger et al. (2000) [67] при доказанной виремии ВГВ, только 43%.

57% случаев отрицательного результата обнаружения HBsAg, объясняются заменами в главном гидрофильном регионе (MHR). Отрицательные или сниженные результаты детекции HBsAg являются следствием не только структурных изменений иммунодоминантной области HBsAg. Все чаще дискутируются причины, которые приводят к нарушению процессов синтеза вирусных белков, сборки и секреции из клетки зрелых вирионов и субвирусных частиц, изменения в участке оболочки вируса, взаимодействующей с клеточным рецептором, а также интерферирование коинфецирующими вирусами [33, 35, 95, 41, 114, 59, 65, 60].

В задачи нашего исследования входило также изучение PreSl и PreS2 областей генома ВГВ, чтобы оценить, как вариабельность этих участков влияет на HBsAg в свете его детекции иммуноферментными тест-системами. В N-конце PreSl белка располагается участок, который взаимодействует с клеточным рецептором, и при высокой его вариабельности у вируса снижается способность инфицировать гепатоцит [33, 59]. Нами были обнаружены аминокислотные замены в этом участке PreSl белка у ряда изолятов ВГВ — 3 (Q18LA28SN29DТ40РD43G), К (Т40Р), 26 (F14S), 19 (A28V), 30 (D16E), 333 (D27E), 12 (T40S). Кроме того, у изолята 13 имелась делеция в PreSl — 5264 аа, в пределах участка необходимого для инициации инфекции, но дистальнее основного участка (9−18 аа), взаимодействующего с рецептором клетки. Однако оценить роль этих замен в процессах связывания вируса с клеточным рецептором и проникновении в клетку в рамках данного исследования не представлялось возможным.

Как уже упоминалось выше, PreS2/S промоторная область у исследованных изолятов ВГВ оказалась наиболее вариабельной по сравнению с другими изученными участками генома ВГВ. Наиболее значимым элементом PreS2/S промотора является ССААТ мотив. У изолята 23 в ССААТ элементе была выявлена двойная мутация — ССССТ, однако сыворотка крови, в которой был выявлен изолят 23, была позитивной на HBsAg, хотя ряд авторов утверждал, что мутации в этом элементе приводят к нарушению продукции HBsAg и секреции вирионов [87, 108].

В пределах Pre-Sl белка (92−113 аа) располагается участок, который как полагают, выполняет матриксную функцию при морфогенезе вирионов с последующей их секрецией из клетки [35, 36]. Следовательно, изменения в этом регионе могут привести к нарушению сборки и секреции вирусных частиц. В этом участке нами были выявлены следующие замены — N103DМ1Т — замена, повреждающая инициирующий кодон для М белкаW3R. Обнаруженная у изолята 5 делеция, захватывает L-M домены (94−108/1−10 аа), которая почти полностью исключает матриксный участок, что должно приводить к нарушению формирования оболочки вирионов и их секреции. В работе M. Melegari et al. (1997) [83] описывается мутантный вирус гепатита В с делецией в L белке (47−107 аа), которая наряду с матриксным участком удаляла и S промотор, в результате синтеза HBsAg и секреции вирионов не происходило. Но в эксперименте при котрансфекции подобного вируса с конструкцией, несущей S-ген, секреция вирионов, несущих делецию, восстанавливалась. Это наблюдение противоречит данным V. Bruss (1997) [36], который показал, что матриксный участок в L домене (92−113 аа) является необходимым для секреции вирионов. В нашем случае, изолят 5, несущий делетированный матриксный участок, выделен из сыворотки, положительной на HBsAg. Возможно, наша ситуация напоминает эксперимент M. Melegari et al. (1997) [83], когда к мутаитному ВГВ с делецией матриксного участка была добавлена конструкция с S-геном ВГВ, экспрессирующая HBsAg и при этом секреция вируса восстанавливалась. Также возможна комплементация делетированного генома ВГВ геномом дикого типа, присутствующего как минорный компонент в вирусной популяции, в результате вирусный геном с делецией использует оболочечные белки генома дикого типа и успешно секретируется.

Цитозольная петля (33−80 аа) S белка, как полагают H. Loffler-Mary et al. (2000) [65] и D.R.Milich et al. (1990) [82], участвует в сборке и секреции вирионов и субвирусных частиц. Нами на этом участке были выявлены следующие аминокислотные замены N40S, F41L, G44E, T45N, S45A, Р46Н, T57I, S61T, P67Q, T68I, W74S, C76Y, C76R, R79H, F80S. Все изоляты ВГВ с аминокислотными заменами в этом участке S-белка были выделены из сывороток крови, в которых определялся HBsAg иммуноферментными тест-системами.

Как было указано выше, к снижению чувствительности ИФА тест систем для детекции HBsAg могут приводить аминокислотные замены не только в иммунодоминантном участке главного гидрофильного региона (MIIR) HBsAg, но и изменения вне этого участка. В этой связи хотелось отдельно остановиться на двух изолятах HBV, обнаруженных нами. Один из них, изолят К (генотип D, субгенотип D3, серотип ayw2) был выделен из сыворотки крови пациента с хроническим гепатитом В. Единственным серологическим маркером вирусного гепатита В был anti-HBc. Молекулярно-генетический анализ PreSl/PreS2/S белков показал наличие следующих аминокислотных замен: PreSlТ40Р, L74I, N103DPreS2 — V32A, V35AS — S204R, Y206H. Как видно в области главного гидрофильного региона и «а" — детерминанты нет пи одной замены. Сравнение с другими изолятами ВГВ того же генотипа показало, что аминокислотные замены V32A, V35A (PreS2) и S204R, Y206H (S) обнаруживаются только у этого изолята. По-видимому, эти аминокислотные замены, расположенные вне «а" — детерминанты, могут изменять ее пространственную структуру, тем самым, препятствуя взаимодействию со специфическими антителами. Другой, изолят 5 (генотип D, субгенотип D2, серотип ayw3) был выделен из сыворотки крови пациента с хроническим гепатитом В. В его сыворотке крови определялись следующие серологические маркеры — HBsAg, anti-HBc (сумм.), anti-HBe, anti-HBc IgM, HBeAg. Анализ предсказанной аминокислотной последовательности PreSl/PreS2/S белков этого изолята показал наличие делеции 94−108 (PreSl/PreS2) — W74Stop, G112R, V118A, G185R, L186P, S207R. Изолят 5 имеет две особенности в структуре изученных белков: во-первых, это наличие делеции, которая приводит к удалению матриксного участка PreSl — белка, тем самым по данным [35, 36] должна нарушаться сборка и секреция зрелых вирионовво-вторых, это наличие стоп кодопа в 74 позиции S белка, который при трансляции с вирусной mRNA (S) должен приводить к прекращению дальнейшего синтеза HBsAg, но как мы видим, сыворотка крови позитивна на HBsAg. В ряде исследований [39, 45, 93] преждевременный стоп код он в S белке в позициях 61, 69, 94 был описан, в одних случаях, сыворотки крови, из которых выделены подобные изоляты были позитивны на HBsAg, в других нет. Одним из возможных объяснений может быть гетерогенность вирусной популяции — наличие квази-видов, которые компенсируют утраченную функцию и/или поврежденную структуру доминантной субпопуляции вируса.

Как было нами показано, изоляты ВГВ, выделенные у разных пациентов, гетерогенны между собой. Помимо этого, каждая вирусная популяция в пределах одного инфицированного организма обладает различной гетерогенностью, степень которой нарастает со временем в процессе хронической НВ-вирусной инфекции, что также было показано в работах Y.-F.Fan et al. (2000) [102] и T. Pollicino et al. (1995) [99]. По-видимому, несмотря на наличие доминирующей субпопуляции вируса, дефектной в структурном и/или функциональном отношении, жизнеспособность общей популяции поддерживается минорным компонентом, например диким типом вируса. Из этого следует, что для диагностических и терапевтическим мероприятий в отношении хронической НВ-вирусной инфекции необходимо изучать всю вирусную популяцию и ее динамику, что позволит объяснить появление атипичного серологического профиля и эффективно контролировать противовирусную терапию.

На примере двух изолятов ВГВ (5) и (К) ясно прослеживается противоречивый характер генетической вариабельности вируса, выражающийся в фенотипическом проявлении наличия или отсутствия HBsAg. Это лишний раз подчеркивает многофакторность проблемы «диагностического ускользания» НВ-вирусной инфекции.