Лазерная спектроскопия модифицированных молекулярных объектов

Общая характеристика работы Актуальность темы.

Нативные биологические объекты, включая растения, микроорганизмы, пищевые продукты, характеризуются определенной молекулярной структурой. В результате естественных и искусственных возмущений может произойти модификация структуры нативного молекулярного объекта.

Изменение молекулярной структуры молекулярных объектов в результате процессов модификации приводит к изменению положений атомов и, соответственно, к изменению электронного и колебательного спектров. Существующие методы контроля зачастую дороги, занимают продолжительное время, не обладают универсальностью. Практика требует внедрения методов экспресс-контроля состояния молекулярных структур, входящих в состав определенных фармацевтических препаратов, биологических объектов, пищевых продуктов и живых систем. Решение данной проблемы может использовано, в частности, для контроля качества, пищевой ценности и безопасности пищевой продукции.

Развитие лазерной и вычислительной техники привело к качественно новому этапу в развитии традиционных методов спектроскопии, которые уже достаточно давно используются для анализа молекулярных объектов. Современная лазерная спектроскопия в совокупности с ЭВМ позволяет анализировать широкий спектр модификаций молекулярных структур в режиме реального времени, происходящих под влиянием различного рода возмущений: нагревания, химического воздействия, дейтерирования, изменения состояния хиральности.

Данная работа посвящена выявлению возможностей методов лазерной спектроскопии для анализа процессов модификации молекулярных объектов.

Постановка задачи.

В настоящей работе ставится задача установления закономерностей в спектрах молекулярных объектов при естественных и искусственных возмущениях на основе использования лазерной спектроскопии комбинационного рассеяния (КР) и флуоресцентной спектроскопии (ФЛ). В частности, ставится задача установления закономерностей в изменении спектров КР карбоновых (жирных) насыщенных кислот при увеличении длины молекулярной цепочки, исследования кинетики спектров ФЛ протеиносодержащих объектов при использовании задержки в системе регистрации, разработки методов контроля присутствия в молекулярных объектах токсических и биологически-активных примесей.

Научная новизна.

Впервые показано, что в зависимости от типа молекулы карбоновых кислот происходят изменения в спектрах КР в области частот решеточных колебаний.

Впервые получены и исследованы спектры флуоресценции сливочного и растительных масел и водных растворов аминокислот.

Впервые показано, что при переходе от естественных форм соевой муки к генетически модифицированным (ГМ) формам в спектрах ФЛ обнаруживается сдвиг положения максимума интенсивности в длинноволновую область спектра. Разработанная методика позволяет проводить идентификацию микроорганизмов и устанавливать условия их перехода в новые формы.

Достоверность.

Достоверность результатов диссертационной работы обеспечивается совершенной методикой эксперимента, согласием экспериментальных данных с теоретическими расчетами, согласием экспериментальных результатов автора с данными работ других исследователей в областях пересечения исследуемых диапазонов.

Практическая значимость работы.

Разработан метод анализа фазовых состояний молекулярных объектов, основанный на регистрации спектров импульсного вторичного излучения, возникающего в конденсированных средах при облучении лазерными источниками света. Ультрафиолетовое излучение лазера позволило эффективно возбуждать ФЛ и резонансное КР от исследуемых проб.

Предложена методика анализа молекулярных объектов и контроля присутствия в исследуемых пробах токсических веществ и биологически-активных примесей на основе использования методов лазерной спектроскопии.

Разработанный метод позволяет в режиме реального времени изучать воздействие видимого и ближнего ультрафиолетового излучения на молекулярные объекты различной модификации, устанавливать характеристики проб сырья и продуктов растительного и животного происхождения.

В результате выполненных исследований установлена возможность анализа молекулярного состава, фазового состояния и типа конформации насыщенных жирных кислот. Проведены исследования спектров токсических и биологически-активных веществ.

Разработанная методика может быть использована для осуществления экспресс-анализа присутствия в пищевых продуктах токсических компонентов с концентрацией до 1 нг/л, наличие биологически-активных примесей и трансгенных (ТГ) составляющих пищевых продуктов, фторорганических соединений и других контаминантов в ничтожно малых концентрациях.

Основные научные положения, выносимые на защиту.

Частоты акустических колебаний цепных молекул насыщенных карбоновых кислот уменьшаются с ростом числа п атомов углерода в молекуле СпНщСЬ. Эта зависимость объяснена на основе модели двухатомной кристаллической цепочки конечной длины.

Максимумы интенсивности ФЛ ГМ соевой муки сдвигаются в длинноволновую область спектра по сравнению с максимумами ФЛ натуральных образцов соевой муки.

Спектры КР сложных молекулярных структур изменяются при добавлении в них токсической добавки твердотельных частиц стильбена: обнаруживаются характерные для стильбена резкие максимумы колебаний в области 1000−2000 см" 1.

По спектрам ФЛ кристаллического триптофана можно определить тип его энантиомера.

Кристаллическая форма Ь-триптофана остается устойчивой в температурном интервале 25−200 °С, что подтверждается слабыми изменениями в решеточной области спектра КР триптофана.

Воздействие возмущающих факторов на микроорганизмы и протеиносодержащие объекты приводит к смещению максимума ФЛ этих объектов в длинноволновую область и изменению формы спектров ФЛ.

Апробация работы.

Работа выполнялась в рамках программы Минобрнауки «Живые системы»: 2000 — 2003 г. г. — проект «Разработка методов экспресс-контроля качества сырья и продуктов животного происхождения на содержание токсичных веществ и микроорганизмов на основе лазерного спектрального анализа» — 2003 — 2004 г. г. — проект «Разработка методов и аппаратурного комплекса для исследования генетически модифицированных биологических структур и пищевых продуктов на основе комбинационного рассеяния и люминесценции» — 2001 г. — проект Минпромнауки «Разработка технологии биологически безопасных продуктов питания, направленных на коррекцию л пищевого статуса населения».

Основные результаты работы докладывались на следующих семинарах и конференциях:

Всероссийских конференциях «Физические проблемы экологии (экологическая физика)», М., МГУ, физический факультет, 2001, 2004 гг., международных конференциях «Пища, экология, человек», М., 2001, 2003 гг., International Congress «Biotechnology-state of art & prospects of development». Moscow, 2002, 2003 гг.,.

Всероссийских конференциях «Необратимые процессы в природе и технике», М., МГТУ им. Баумана, 2003, 2005 гг.,.

Научно-практической конференции «Актуальные направления развития экологически безопасных технологий производства, хранения и переработки сельскохозяйственной продукции», Воронеж, 22−24 апреля 2003 г., Научно-практических конференциях «Технологии живых систем», М., МГУПБ, 2001,2002,2003,2004 гг.,.

Научной конференции «Медико-генетическая оценка пищевых продуктов», Москва, 24−26 мая 2003 г.

На семинарах кафедры физики МГУПБ в 2002;2005 гг. Личный вклад.

В процессе выполнения диссертационной работы автор принимал непосредственное участие в постановке задачи исследования, выборе методов ее решения, разработке методики экспериментальных исследований, в проведении экспериментов, обработке и анализе результатов исследований.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 8 статей, их них 3 — в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, 14 тезисов докладов на конференциях, монография (157 е.).

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения и библиографии,.

4.7. Выводы.

Проведено исследование спектров вторичного излучения, возбуждаемого непрерывными и импульсно-периодическими лазерными источниками света в натуральных и модифицированных биологических объектах.

Установлено, что при переходе от одного зеркального изомера к другому в случае кристаллической гетероциклической аминокислоты (триптофана) в спектрах КР существенных изменений не обнаруживаетсяв спектрах двухфотонновозбуждаемой ФЛ при этом наблюдается изменение интенсивности и спектрального положения основного максимума, расположенного в ближней ультрафиолетовой области спектра. При переходе от хиралыю чистых аминокислот к рацематам изменения в спектрах вторичного излучения становятся гораздо более существенными и информативными.

Обнаружено, что фторирование аминокислот приводит к сдвигу характеристических частот колебаний соответствующих молекул в спектрах КР и к изменению формы полос ФЛ.

Под влиянием возмущающих факторов (ультрафиолетового облучения и нагревания), действующих на молекулярные объекты, наблюдается существенный сдвиг полос спектров ФЛ в сторону больших длин волн.

Исследования биологически-активных веществ показывают, что их спектры ФЛ зависят от типа образца и условий его технологической обработки. По изменениям в спектрах флуоресценции простейших микроорганизмов в результате их деструкции под воздействием различных факторов можно проводить диагностику их перехода от живого состояния к мертвому.

Показано, что при возбуждении импульсным УФ излучением соевой муки обнаруживается ФЛ, спектр которой расположен в области 300−500 нм. В этом спектре проявляются характерные полосы хромофорных групп молекул нуклеиновых оснований и белков, входящих в состав соевой муки. При введении временной задержки в систему регистрации в спектрах ФЛ наблюдаются существенные изменения, согласующиеся с выводами, основанными на анализе поляритонных эффектов.

Показано, что в результате модификации образцов соевой муки основные максимумы ФЛ смещаются в длинноволновую область, а их форма видоизменяется.

В области ультрафиолетового диапазона обнаружено различие спектров ФЛ для модифицированных и немодифицированных образцов сои.

Полученные результаты открывают новые возможности для контроля молекулярного состава трансгенных пищевых продуктов на основе анализа спектров фотолюминесценции, возбуждаемой импульсно-периодическим ультрафиолетовым излучением.

Выполненное исследование открывает возможности для осуществления неразрушающей диагностики процессов различной модификации биологических объектов, используемых в настоящее время в пищевой промышленности, фармакологии и медицине.

Разработанные методики получения спектров однофотоннои двухфотонновозбуждаемой ФЛ могут быть применены для диагностики микроскопических параметров ДНК молочнокислых и других бактерий.

Разработанная методика импульсного ультрафиолетового возбуждения вторичного излучения воды, водных растворов и взвесей позволяет проводить анализ молекулярной структуры воды и посторонних компонентов, присутствующих в водной среде, и оценивать степень структурирования воды. Разработанная методика позволяет также обнаруживать наличие в пробах тяжелой воды.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

•' 1. Определены частоты колебаний молекул насыщенных жирных кислот, относящихся к деформационным, маятниковым, крутильным, веерным и ножничным движениям СНг-групп, а также частоты валентных С-Н колебаний. Установлено, что эти частоты зависят от длины соответствующих молекулярных цепочек: с увеличением числа атомов углерода в молекулярной цепочке частоты деформационных, маятниковых, крутильных и ножничных колебаний уменьшаются, а веерных колебаний — увеличиваются. Результаты модельных расчетов частот колебательного спектра согласуются с экспериментальными данными.

2. Обнаружено, что максимумы интенсивности ФЛ ГМ соевой муки сдвинуты в длинноволновую область спектра по отношению к максимумам интенсивности ФЛ натуральной соевой муки. По спектрам ФЛ различных образцов соевой муки в ультрафиолетовой области можно диагностировать наличие генной модификации. Наблюдаемые изменения согласуются с выводами, основанными на поляритонной модели конденсированных сред.

3. Показана эффективность разработанной методики для проведения анализа молекулярного состава растительных и животных жиров, содержащих молекулы насыщенных карбоновых кислот различной длины, оперативного контроля присутствия в пищевой продукции, токсических ароматических примесей и добавок, возникающих в процессе хранения и вводимых при обработке исходного продукта для его консервации или модификации.

4. Показано, что спектры КР ароматических аминокислот в решеточной области различаются для хиралыю чистых и рацемической конформаций. Установлено, что по спектрам ФЛ триптофана можно различать тип его энантиомера. Анализ спектров КР и ФЛ аминокислот может быть использован для диагностики хиральной чистоты биосферы.

5. Под влиянием ультрафиолетового излучения или нагревания, действующих на молекулярные объекты, наблюдается существенный сдвиг полос спектров ФЛ в сторону больших длин волн. Это позволяет по изменениям в спектрах ФЛ простейших микроорганизмов в результате их деструкции под воздействием различных факторов проводить диагностику их перехода в новые формы.

6. Показано, что анализ спектров ФЛ воды, водных растворов и взвесей позволяет устанавливать молекулярную структуру воды и наличие в ней посторонних компонентов. По спектрам КР можно определять наличие в пробах тяжелой воды.

7. Разработан метод экспресс-анализа состава молекулярных объектов, основанный на использовании спектроскопии КР и ФЛ ароматических соединений, хромофорных групп биологически-активных соединений активных примесей, который может быть использован для экспресс-контроля процессов модификации сложных молекулярных объектов.