Лазерный цитомонитор, определение функции распределения размерного состава взвесей методом малоуглового рассеяния

Дисперсные среды составляют значительную часть окружающей среды, участвуют и в жизнедеятельности человека, и в различных технологических процессах. Особенно важную роль дисперсные среды играют в биологии и медицине, так как в этом случае носителями дисперсности выступают клетки, микроорганизмы, вирусы и т. п. Естественно, что получение новых знаний о состоянии и развитии дисперсных систем является важной задачей научных исследований. При этом значительную роль в таких исследованиях должны играть современные физические методы, использующие последние достижения в математической обработке данных, в оптических технологиях, вычислительной технике.

Высокой эффективности анализа дисперсных сред можно достичь с использованием оптических методов исследования. Важным преимуществом таких методов является безконтактный способ контроля [1]. Наряду с традиционным оптическим контролем с помощью светового микроскопа, все большое распространение получают методы, использующие эффекты рассеяния света и флуоресценции в дисперсной среде. Существует два подхода к исследованию состава дисперсной среды, а именно: методы, базирующиеся на измерениях отклика дисперсной системы как целого, и методы, которые изучают отдельные элементы дисперсной среды. Оба подхода имеют свои преимущества и недостатки. Так достаточно легко построить эксперимент по измерению рассеяния света на ансамбле частиц, однако, извлечение полезной информации о дисперсности системы представляется довольно сложной задачей. С другой стороны, экспериментально достаточно сложно изучать отдельные элементы дисперсности, хотя, при этом определить параметры элемента по оптическим измерениям гораздо легче, чем в первом случае. Фактически перед исследователем стоит задача выбора наиболее эффективного способа решения своих задач с использованием одного из этих двух подходов.

Экспериментальные системы, позволяющие измерять свойства одиночных частиц, все еще достаточно сложнытеоретические разработки, связанные с определением параметров одиночных частиц, малочисленны и малоэффективны. Однако, в последнее время, в связи с бурным развитием лазерной техники, средств автоматизации измерений и обработки данных и появлением на мировом рынке диагностической аппаратуры, в научных исследованиях и при технологическом контроле получили широкое распространение оптические анализаторы одиночных частиц.

С другой стороны в настоящее время уже известно много приборов, работающих в различных областях науки и техники, позволяющих проводить оценку характеристик взвесей. Для решения данных задач используются различные подходы и физические теории. Одним из основных методов исследования является оптический метод. Всю доступную оптическим методам информацию о дисперсной среде несет матрица рассеяния света (MFC). Одним из самых ее информативных и часто используемым для анализа светорассеяния элементов является угловая зависимость интенсивности рассеянного света (индикатриса). Однако до недавнего времени полное использование потенциала, заложенного в структуре индикатрисы, было затруднено. В первую очередь, это связано с тем, что подавляющее число экспериментальных работ выполнено на взвесях. Любая взвесь является гетерогенной, т. е. частицы в ней имеют разный размер, форму, структуру, значения оптических констант. Такие распределения оптических свойств, какими бы узкими они не были, сказываются на структуре экспериментальной индикатрисы. Индикатриса получается «размытая» (сглаживаются экстремумы), теряется ее тонкая структура. Вторая причина — отсутствие единой и простой схемы дешифрирования рассеянного излучения разными по размеру и оптическим свойствам частицами. Из-за этого приходится решать обратную задачу каждый раз в оригинальной постановке в рамках конкретного приближения.

В свете вышесказанного, представляется важным дальнейшее совершенствование методов расчета параметров частиц по данным светорассеяния (обратная задача светорассеяния). А необходимость создания недорогой, удобной, автоматизированной и достаточно универсальной системы, позволяющей быстро и качественно проводить диагностику взвесей, актуальна и по сей день. Создание такой системы (программно-вычислительного комплекса — лазерного цитомонитора) даст возможность изучать поведение клеточных копуляций, решать экологические задачи по загрязнению атмосферы и водоемов и многое другое.

Подводя итог, можно сказать, что по существующим оценкам, лазерный цитомонитор можно использовать для:

— функционального анализа системы крови, состояния иммунитета, различных систем и органов (материалы пункций, биоптатов и т. д.);

— количественного описания поведения раковой популяции;

— выяснения популяционно-клеточных аспектов старения;

— для контроля терапевтических воздействий;

— разработки новых форм эффективного скрининга лекарств и токсикантов;

— экологического и клинического мониторинга;

— прогнозирования развития различных патологических процессов, их зависимости от терапевтических воздействий;

— высокочувствительной биоиндикации малых доз радиацииа также для решения других задач в различных областях науки и техники, где необходимо решать обратную задачу рассеяния.

Цель работы и постановка задач.

Целью диссертационной работы является создание и отладка программно-вычислительного комплекса позволяющего оперативно и достоверно проводить диагностику взвесей с целью определения функции распределения частиц взвеси по размерам. Причем процесс диагностики должен быть автоматизирован, чтобы обслуживание комплекса не требовало высококвалифицированного персонала.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Создать программно-вычислительный комплекс (лазерный цитомонитор) позволяющий проводить измерения индикатрисы рассеяния взвеси частиц в области малых углов. Представление данных об индикатрисе рассеяния должно осуществляться в электронном виде с возможностью дальнейшей обработки и анализа.

2. Разработать и апробировать математический аппарат, способный решать обратную задачу рассеяния для частиц размера 2−100 мкм. Создать программное обеспечение, позволяющее осуществлять удобное управление расчетами функции распределения взвеси по размерам с учетом тематики исследования.

3. Теоретически и экспериментально исследовать применимость нового метода по решению обратной задачи рассеяния при обращении малоугловой индикатрисы, и сравнить результаты с результатами метода, предложенного Шифриным К.С.

4. Провести эксперименты по решению программно-вычислительным комплексом экологической задачи, а именно, для диагностики мелкодисперсной пыли в г. Москве.

5. Провести экспериментальное исследование функции распределения эритроцитов в зависимости от осмотичности раствора. Изучить влияние гиперосмотического воздействия на функцию распределения по размерам эритроцитов.

6. Оценить влияние воздействия химических реагентов, изменяющих форму клетки, на решение обратной задачи рассеяния с помощью лазерного цито-монитора.

7. Изучить возможности использования ПВК лазерного цитомонитора для анализа кинетики (динамики) размеров клеток крови при воздействии на них внешними факторами.

Научная новизна работы.

Предложен принципиально новый метод математической обработки экспериментальной индикатрисы рассеяния, дающий возможность учитывать дополнительную информацию о клеточной популяции, что позволяет вести оперативный мониторинг самых различных медико-биологических процессов с использованием простых и доступных клеточных проб, как в статическом, так и в динамическом режимах. При изучении клеточных распределений по размерам обычно имеют место полимодальные распределения, раскрывающие кластерную природу клеточного сообщества. Динамическими характеристиками клеточной популяции являются уровни «заселенности» кластеров. Скорость реорганизации клеток при переходе из кластера в кластер высока и составляет доли секунды. Используя данную информацию, метод обращения индикатрисы рассеяния в функцию распределения позволяет получать достоверные результаты. Лазерный цитомонитор может эффективно использоваться в медицине, 7 фармакологии и биотехнологии, а также применяться для эффективного экологического мониторинга обширных обитаемых территорий.

Практическое значение работы.

На основе оригинальной теории, математических алгоритмов, компьютерных программ и современных технических решений создана многоцелевая аналитическая система (лазерный цитомонитор) кинетической оценки реактивности клеток человека, животных и растений в реальном масштабе времени. Ее использование позволяет решать самые разнообразные задачи в области экологии, медицины, биотехнологии, фармакологии, сельского хозяйства. Аналитическая система представляет собой комплекс методических и технических средств, работающих в автоматическом режиме.

Лазерный цитомонитор позволяет получить функции распределения клеток по размерам и их эволюцию во времени с разрешением порядка 0,02с. Данная работа также посвящена методическим вопросам определения функций распределения по размерам на биологических объектах и неорганических взвесях.

Структура и объем диссертации

.

Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения и библиографии (170 наименований). Диссертация содержит 121 страницу текста, 28 рисунков и 2 таблицы.

Основные результаты и выводы.

1. Разработана и изготовлена многоцелевая аналитическая система (лазерный цитомонитор), позволяющая диагностировать поведение клеточного сообщества как в статическом, так и в динамическом режимах. При этом минимальное время съема информации составляет 20 мс. Временной интервал между отдельными измерениями может плавно регулироваться в пределах от 20 мс до десятков минут. Предлагаемый метод кинетического анализа клеточных популяций позволяет вести оперативный мониторинг самых различных медико-биологических процессов с использованием простых и доступных клеточных проб. Особенность и преимущество предлагаемого метода диагностики состоит, прежде всего, в проведении статистического динамического анализа клеточной популяции в реальном масштабе времени с учетом коллективных процессов, протекающих в клеточном сообществе. Для обслуживания комплекса не требуется высоко квалифицированный персонал.

2. Теоретически показано, что хорошо известный метод К. С. Шифрина по решению обратной задачи рассеяния имеет значительные недостатки, среди которых отметим следующие:

• необходимость предварительного сглаживания индикатрисы рассеяния;

• принципиальная непригодность метода для описания частиц малых размеров;

• возможность наличия в восстановленной функции распределения участков с отрицательными значениями при отсутствии обоснованных путей устранения этого недостатка.

3. Экспериментальные исследования пространственного распределения мелкодисперсной пыли в г. Москве показали, что диаграммы, характеризующие пространственное содержание пыли в воздухе не обладают центральной симметрией и вытянуты вдоль направления, совпадающего с преимущественным направлением розы ветров. Такое совпадение, по-видимому, не случайно и связано с выпадением тяжелой фракции пылевых потоков при пересечении территории города, изобилующей высокими строениями. Наличие повышенного содержания крупных частиц в юго-юго-западном секторе города может быть связано с функционированием вторичных источников пылеобразования, например, в районе между Каширским и Варшавским шоссе, где есть много мелких и крупных промышленных предприятий различного профиля.

4. Проведены измерения индикатрис рассеяния на эритроцитах помещенных в раствор с разной осмотичностью. Характерный размер эритроцитов полученный путем обращения малоугловой индикатрисы рассеяния сравнивался с размером, полученным методом определения клеточного распределения по плотностям в градиенте диметилфталата-диэтилфталата для такой же осмотичности. Результаты полученные обоими методами исследования хорошо согласуются. Что позволяет рекомендовать использование лазерного цитомонитора для данных исследований, и использовать его достоинства, а именно скорость проведения анализа, удобство и простоту в обслуживании.

5. Проверено влияние изменения формы клеток на точность метода. Эхино-цитная форма клеток приводила к незначительному уменьшению характерного размера клеток измеренного при помощи лазерного цитомонитора. Придание клетке стоматоцитной формы не повлияло на ее характерный размер.

6. Лазерный цитомонитор позволяет проводить экспресс диагностику динамики функции распределения клеток по размерам. Это подтверждено исследованиями процессов изменения размера эритроцитов, активированных ионофорным веществом. Альтернативные методы исследования динамики данных процессов весьма трудоемки (несколько часов) и не позволяют проводить измерения в начальной фазе изменения размера клетки (первые 5 минут).

7. Проведены исследования и подтверждена возможность использования ПВК «Лазерный цитомонитор» для применения в качестве инструмента по изучению кинетического анализа реактивности клеточных популяций и процессов агрегации клеток с высоким временным разрешением динамических процессов.

Автор выражает особую признательность КБ. Тимофееву и В. А. Черникову за руководство и постоянную поддержку при выполнении данной работы, а также всем соавторам за помощь и разрешение использовать в диссертации совместно полученные результаты.

Автор благодарен Б. И. Тимофееву за неоценимую помощь в разработке аппаратной части и программного обеспечения ПВК Лазерный цитомонитор, С. Н. Чувашеву за участие в обсуждении и интерпретации результатов расчета.

Автор выражает благодарность КВ. Шайтану, А. Ф. Лобкову, а также Гематологическому центру Российской академии медицинских наук в лице И. Л. Лисовской и Ф. И. Атауллаханова за постановку интересных прикладных задач в области биологии и медицины, обсуждение результатов и помощь в оформлении совместных работ.

Автор признателен профессору А. Ф. Александрову за поддержку и полезные контакты на разных этапах выполнения данной работы.

Автор благодарен Красногорскому оптико-механическому заводу им. С. А. Зверева в лице директора А. ИГоева, главного инженера В.В. Потело-ва и В. М. Румянцева за изготовление малой серии опытной партии программно-аппаратных комплексов, позволившей провести эксперименты.