Изучение физиолого-биохимических механизмов устойчивости растений картофеля к высокой температуре с использованием клеточной технологии

Актуальность темы

В последние годы для подъема сельскохозяйственного производства картофеля все больше используются нетрадиционные технологии, такие как генная и клеточная биотехнология. В биотехнологии растений особую роль играет клеточная селекция, при которой отбор клеточных линий и растений с новыми хозяйственно-ценными свойствами проводится на уровне культивируемых in vitro клеток.

Получение таким путем растений из отработанных в селективных условиях каллусных клеток возможно благодаря уникальному свойству растительной клетки — ее тотипотентности. Приемы культивирования растительных клеток и регенерации из них растений разработаны для многих сельскохозяйственных культур и они позволяют реализовать возможности клеточной селекции для создания новых сортов растений (Tall, 1983; Dix, 1986; Сидоров, 1990; Носов, 1999). Мощным источником генетического разнообразия растений является сомаклональная изменчивость, возникающая при прохождении растениями стадии неорганизованного роста, и/или при длительном культивировании в условиях in vitro (Носов, 1999; Высоцкая, 2003).

Вместе с тем в селекции растений in vitro следует реально учитывать и ограничения клеточной технологии. Несмотря на большое количество работ методы целенаправленного улучшения хозяйственно-ценных признаков растений in vitro на основе технологии клеточной селекции все же остаются еще несовершенными. До настоящего времени использование клеточной технологии для получения клеточной линии и растений-регенерантов, резистентных к высокому температурному фактору, остается нерешенным, что и определяет актуальность проведения таких исследований. Получение устойчивых к высокой температуре растений с помощью клеточной технологии имеет для Таджикистана особую практическую значимость, т. к. у многих культурных растений, выращиваемых в Таджикистане (хлопчатник, картофель, овощные культуры), период накопления урожая приходится на самый жаркий период, что является одним из факторов снижения урожайности и качества продукции (Алиев и др., 1997). Эта задача должна решиться в том числе за счет умелого использования достижений современной биотехнологии и природно-климатических факторов Таджикистана.

При равных условиях возделывания, для получения высокого урожая картофеля, так и других культур, наиболее значимы особенности сортов и качество семенного материала, определяемые системой семеноводства и методами получения семенного материала (Муминджанов, 2003; Каримов и др., 2004; Давлятназарова и др., 2004).

К сожалению, имеющиеся в производстве сорта не всегда отвечают запросам картофелеводства из-за неустойчивости к болезням и воздействию стрессовых природных факторов горных регионов республики. Поэтому создание форм, линий, сортов картофеля как методами традиционной селекции, так и современной биотехнологии (клеточной селекции, генной инженерии), адаптированных для каждой зоны, в будущем имеет большую перспективу.

Цель и задачи работы: Получение клеточной линии картофеля, устойчивой к природным стрессовым воздействиям (высокой температуре, водному дефициту и т. д.), а также возможности регенерирования из них фертильных растений методами современной биотехнологии и использование их как модель изучения физиолого-биохимических механизмов устойчивости растений к стрессу. В связи с поставленной целью в задачу исследования входило:

• Подбор оптимальных условий культивирования;

• Подбор культуральной среды, типа экспланта и оптимальных условий культивирования картофеля in vitro;

• Изучение особенностей морфогенеза каллусных клеток при действии высокой температуры;

• Подбор усолвий селективного отбора клеток и регенерантов, устойчивых к действию высокой температуры;

• Изучение некоторых морфо-физиологических параметров температуроустойчивых растений-регенерантов при действии высокой температуры;

• Изучение некоторых биохимических особенностей температуроустойчивых растений-регенерантов (ТУ-регенеранты) при действии засухи (водного дефицита).

Научная новизна. Проведен скрининг морфофизиологической характеристики компетенции в культуре in vitro растений картофеля сорта Жуковский ранний. Получен ряд линий, различающихся по некоторым физиологическим признакам и продуктивности.

При воздействии высокой температуры (41°С, 45 °C и 47°С) на культивируемые каллусные ткани картофеля отобраны устойчивые линии. Полученные от них растения отличались по некоторым морфологическим признакам от исходного варианта. Стабильными оказались изменения, вызванные действием более высокой температуры — 47 °C, тогда как у самоклональных, при меньшей температуре 41 °C, они со временем терялись. Отселектированный признак (повышенная резистентность к 47°С) сохранялся на протяжении 8 лет испытания в полевых условиях, а также in vitro. Полученные резистентные линии существенно отличались друг от друга по структуре урожая. Показано, что адаптированные к температурному стрессу регенеранты картофеля, полученные в результате клеточной селекции, характеризуются более высоким содержанием свободного пролина по сравнению контрольными растениями, и это можно использовать как тестпризнак при оценке уровня устойчивости генотипов картофеля к температурному стрессу и другим природным неблагоприятным факторам.

Практическая ценность диссертации. Отработана система каллусогенеза и регенерации картофеля, что позволило оптимизировать процесс регенерации в стрессовых условиях in vitro. Важным результатом работы является выделение регенерантов, устойчивых к высокой температуре и водному дефициту (засухе). Эти свойства можно использовать для расширения генетического базиса селекции как донора генов устойчивости к стрессу, а также для решения прикладных задач в научных целях как модель физиологической, молекулярно-генетической и прикладной биотехнологии.

Апробация диссертации. Основные результаты диссертационной работы были доложены на следующих научно-практических конференциях: первой республиканской конференции «Экология и здоровье,» 2001; конференции «Молодые ученые и современная наука», 2001; 2002; конференция «Вопросы сохранения и рационального использования растительного разнообразия Таджикистана», 2002; научно-педагогической конференции Таджикского государственного национального Университета 2002;2005 г.

ВЫВОДЫ.

1. Показано, что первичные каллусы образуются на срезах междоузлий и/или кусочках листа картофеля в среде МС, содержащей глутамин, зеатин и кинетин. Образовавшиеся каллусы отличались по размеру и цвету. В варианте +37°С наблюдалось увеличение роста каллусов, в варианте +41°С наблюдалась стимуляция роста каллусов, в варианте +45°С отмечалось резкое ингибирование роста каллусов.

2. Активная пролиферация наблюдалась у каллусов контрольного варианта и каллусов, образовавшихся при температуре +41 С и +45°С. После перенесения их на среду регенерации во всех вариантах наблюдалось появление апикальных структур через 20−25 дней.

3. Количество образовавшихся растений-регенерантов было самое высокое в контрольном варианте. Единичные растения-регенеранты образовались при +45°С и +47°С. Наиболее сильное угнетение роста и наименьшее количество корней наблюдалось в варианте +47°С. При постепенном воздействии высокой температуры (+47°С) на уровне растений-регенерантов наиболее устойчивыми оказались регенеранты, полученные из каллусов, подвергавшихся воздействию высокой температуры.

4. Давление на уровне неорганизованной пролиферации выявила ряд форм растений, резистентных к высокой температуре (+47°С). Стабильными оказались изменения, вызванные действием более высокой (+47°С) температуры, тогда как у сомаклональных линий при более низкой температуре (+37°С, +41°С) они со временем терялись.

5. Обнаружены различия между контрольными — исходными и температуроустойчивыми растениями-регенерантами по высоте стебля, количеству листьев, содержанию хлорофиллов и УПП листа. Растения, полученные методом клеточной технологии, имеют красноватый стебель и листья. Листья этих растений более плотные и опушенные.

6. Выявлены различия между контрольными растениями и температуроустойчивыми (ТУ растения-регенеранты) при действии засухи. Так, содержание воды у ТУ-регенерантов при засухе было значительно выше, чем у контрольных растений, и они оказались более выносливыми к обезвоживанию и перегреву почвы — засухи.

7. Анализ температуроустойчивых растений показал, что содержание пролина в них существенно выше, чем у исходного в нормальных условиях и при искусственно созданной засухе. Содержание пролина у ТУ-регенерантов было в 10−18 раз больше при засухе и в 2−3 раза у исходных контрольных растений. Количество амидов также увеличилось при засухе у ТУ-регенерантов. У исходной формы растений их количество при засухе изменилось незначительно.

8. Показано, что адаптированные к температурному стрессу регенеранты картофеля, полученные в результате клеточной селекции, характеризуются более высоким содержанием свободного пролина по сравнению контрольными растениями, и это можно использовать как тест — признак при оценке уровня устойчивости генотипов картофеля к температурному стрессу и другим природным неблагоприятным факторам.

9. Полученные результаты и разработанные биотехнологические методы способствуют расширению генетического базиса селекции картофеля путем создания ценных генотипов исходной формы, а также выяснению физиолого-биохимических механизмов устойчивости растений к стрессовым факторам среды.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Авгонова Х. Х., Диловарова Н. Повышение экологической пластичности растений с использованием методов биоинженерии // Экология и здоровье. Душанбе-2001. С. 9−10.

2. Авгонова Х. Х., Бабаджанова М. П., Диловарова Н., Дарвозиев М., Алиев К. А. Молекулярная экология и адаптационные механизмы растений. // Олимони чавон ва илми муосир. Душанбе-2001. С. 61−62.

3. Авгонова Х. Х., Холов Ф., Диловарова Н., Дарвозиев М., Адаптационные возможности трансгенных и нетрансформированных растений картофеля к водному дефициту. // Олимони чавон ва илми муосир. Душанбе-2001. С. 69−70.

4. Холов Ф. Х., Ахмедов Н. А., Бобохонов Р. С., Авгонова Х. Х., Каримов М. К. Махсулноки ва мубодилаи об дар растанихои тагйирдодашудаи гении картошка. // Мачмуи маколахои илми. Душанбе-2001. С. 93−97.

5. Давлятназарова З. Б., Алиев К. А., Бабаджанова М. П., Авганова Х. Х. Получение линий картофеля, устойчивых к высокой температуре, с использованием методов биотехнологии. // Докл. АН РТ, 2003, № 5−6. С. 61−69.

6. Авгонова Х. Х., Дарвозиев М. Влияние экологических условий на аттаргирующую способность клубней картофеля. // Олимони чавон ва илми муосир. Душанбе-2002. С. 58−59.

7. Давлятназарова З. Б., Каримов Б. К., Авгонова Х. Х., Мирзохонова Г. О., Назарова Н. Н., Алиев К. А. Регуляция клубнеобразования in vitro. Актуальные проблемы и перспективы развития физиологии растений. // Душанбе-2004. С.62−63. Изд-во «Дониш» .

8. Давлятназарова З. Б., Мирзохонова Г., Назарова Н., Файзиева С., Алиев М., Авгонова Х. Х., Суфиева М., Салимов Р., Наймов С., Алиев К. А. Регуляция клубнеобразования у различных генотипов картофеля in vitro // Республиканский симпозиум «Экономика и наука Горно-Бадахшанской автономной области: прошлое, настоящее, будующее» .спонсор симпозиума — Хукумат ГБАО — 2005. С. 187−188.

9. Авгонова Х. Х., Мирзохонова Г., Файзиева С. // Некоторые биохимические особенности адаптации растений картофеля к экологическому стрессу. Материалы научно-теоретической конференции профессорско-преподавательского состава и студентов, посвященной 60-летию победы в великой отечественной войне «Во имя мира и счастья на земле». Душанбе-2005. С. 110−111.

Заключение

.

Исследование водообмена растений было и остается главным элементом продукционного процесса растений и издавна привлекает внимание исследователей, поскольку обусловлено важностью и многогранностью функций, которые он выполняет. Водообмен как важнейший регулятор водного статуса клеток является ведущим звеном во взаимодействии растений с водной фазой почвы и атмосферы. Более того, он является прямым индикатором состояния влагообеспеченности и жизнедеятельности растений.

Исследования водообмена растений можно разделить на пять этаповосмотический, коллоидно-химический, термодинамический, биохимический, биофизический.

В последние годы большое развитие получил термодинамический подход к исследованию водообмена растений. Этот подход получил свое развитие в работах B.C. Шардакова (1953), основанный на системе показателей (почва — растение — атмосфера). Предлагался ряд терминов для обозначения водного статуса в растениях: сосущая сила, дефицит воды, водоудерживающая способность, активность воды, гидратация и диффузия. Далее было введено понятие потенциал воды (Slatyer, Taylor, 1960; Krammer et. al. 1966), отражающий степень уменьшения химического потенциала клеточного раствора относительно чистой воды. Водный потенциал является собирательным понятием для характеристики следующих параметров водообмена: осмотический потенциал — это влияние на активность воды химических частиц растворенных в воде веществ, матричный потенциаладаптация воды на тканевом веществе, то есть матриксе, потенциал давления — гидростатический или тургорное давление. В работе (Тугее, Karamanos, 1981) получил развитие матричный потенциал для оценки состояния воды в клетке (определение количества связанной воды), как экологически менее значимый параметр и осмотический потенциал, являющийся важнейшим экологическим параметром.

Напротив, А. А. Завьялов (1984) считает, что более значимым параметром является термодинамический потенциал воды в клетке, поскольку он полнее отражает состояние воды в растениях.

В.Н. Жолкевич и др. (1989) указывает на неприемлемость уподобления растения простой гидравлической машине, где действуют чисто физические законы циркуляции воды в водных растворах. Он указывает на непосредственное участие живых клеток в транспорте воды и его эндогенной регуляции. Это представление получило развитие в работе некоторых исследователей (В. Кундт, М. Робник, 1998).

Вместе с тем, в работе последних лет приводятся данные, указывающие на то, что водный потенциал не является универсальным методом измерения водообмена растений. В ряде случаев определение относительного содержания воды гораздо информативней, чем измерение водного потенциала (Емельянов, Анкуд, 1992). Все выше приведенные факты указывают, что водообмен растений — это интегральный процесс, который объединяет процессы поступления, передвижения, выделения и состояние воды в растениях. Поэтому водообмен не может быть охарактеризован каким-то одним признаком и, следовательно, он объединяет комплекс физических и физиологических процессов, протекающих в целостном организме растений. Поэтому измерение параметров водного режима, занимает особое место, в настоящее время, в связи с появлением новых типов растений с измененной генетической конструкцией, то есть генетически модифицированных растений.

Обычно, генмодифицированные растения конструируют путем введения генов с помощью Agrobacterium tumerfaciens, то есть методом генетической инженерии или путем воздействия на культуры каллусов определенными стрессовыми факторами, такими как высокая температура, высокая доза солей и др., то есть методом клеточной селекции. Культура клеток in vitro дает возможность в контролируемых условиях исследовать зависимость ростовых и репродуктивных органов растений от дозированного воздействия стрессовых и других факторов. Такая техника эксперимента позволяет отобрать сомаклоны растений с желаемыми параметрами устойчивости к неблагоприятным условиям, таких как соли (Бургутин и др., 1996), высокая температура (Давлятназарова и др., 2003), к растениям, устойчивым к высокой температуре (ТУ-растения) которые получили согласно применяемой схеме (рис.17).

В известных работах по сравнительной устойчивости клонов растений картофеля in vitro к NaCl авторы ограничивались по несколько штук пробирочных растений (от 4 до 10) (Бургутин и др., 1996). Такие эксперименты не дают положительного ответа на вопрос о возможности эффективной селекции растений in vitro на спонтанном уровне при столь ограниченной выборке, хотя и не отрицает возможности неконтролируемой селекции в системах микроклонального размножения. Поэтому в работе А. Б. Бургутина и др. (1996) были выработаны системы целых растений in vitro для оценки солеустойчивости картофеля и отбора столоноустойчивых сомаклонов. Они показали, что достаточно высокая концентрация хлористого натрия на уровне каллусогенеза привела к стабильным изменениям, а при более низких уровнях засоления возникающие варианты теряли приобретенные свойства.

В наших работах (Давлятназарова, Авгонова и др., 2004 г.) исследования проводились с пробирочными растениями, что позволило проследить за каждым растением отдельно на протяжении всего периода выращивания in vitro. Полученные нами данные свидетельствуют об определенных преимуществах отбора на устойчивость к высокой температуре с использованием целых растений in vitro для оценки результатов отбора. Оценивая результаты отбора культивируемых каллусов на целых растениях (полученных от этих каллусов), можно избежать существующих противоречий, когда устойчивость к высокой температуре на уровне каллусных линий не совпадает с устойчивостью целого растения. Воздействие на уровне неорганизованной пролиферации с последующим получением резистентных растений картофеля повторного воздействия на уровне целых растений выявило более устойчивые к более высокой температуре сомаклональные варианты — линии. Полученные таким путем растения-регенеранты обладают повышенной устойчивостью к высокой температуре и имеют существенные различия по ряду морфофизиологических признаков (Авгонова и др., 2005 г.). растениерегенерат получение каллуса суспензия клеток.

Воздействие высокой температуры отоор устойчивых клеток проверка устойчивости к стрессовым воздействиям клонирование получение микроклубней молекулярно—генетические исследования.

Получение растения-регенеранта картофеля, устойчивого к воздействиям факторов среды.

Рис. 17. Схема получения устойчивости растений картофеля к температурному фактору.

Воздействием на каллусные культуры и регенеранты in vitro высокой температуры нами получены сомаклоны растений картофеля с измененной генной конструкцией. Установлено, что воздействие на растения-регенеранты температуры 45 °C и 47 °C в течение 16 часов привели к полной гибели растений, как при 45 °C, так и при 47 °C. Температурно-устойчивые клетки сохранили жизнедеятельность даже при выдерживании растений при 47 °C в течении 24 ч. При таких условиях обработки пробирочных растений наблюдалось следующее: растения, полученные при обработке 41 °C и 45 °C — полностью погибли. В варианте с обработкой при температуре 47 °C в 7 случаях из 400 пробирочных растений в нижней части стебля появились зеленоватые участки. Из этих участков стебля в течение последующих 10−12 дней начали появляться вторичные стебли и далее образовались листочки. Эти растения пересаживали в свежую среду для регенерации. Из 7 регенерированных растений 5 оказались фертильными и 2 безхлорофилльными мутантами.

Фертильные растения использовали для клонирования и получения линии и анализировали в полевых условиях.

Полученные линии существенно отличались друг от друга по структуре урожая. Среди них имеются линии, с низким урожаем. Некоторые линии являются перспективными и их можно использовать в селекционном процессе для получения семенного картофеля. Таким образом, приведенные данные свидетельствуют об определенных успехах в отборе на температурную устойчивость с использованием каллусных культур и целых растений in vitro для оценки результатов отбора. Полученные таким путем линии растений являются сомаклональными вариантами. Деление на уровне неорганизованной пролиферации дало возможность выявить резистентные к высокой температуре (47°С) линии картофеля. Стабильными^оказались изменения, вызванные действием более высокой (47°С) температуры, тогда как у сомаклональных линий при более низкой температуре (41 °С) они со временем терялись. Регенеранты, обладающие устойчивостью к высокой температуре обозначались как (ТУ-растения-регенеранты).

Как известно, показателями устойчивости растений к засухе являются водоудерживающая способность и жароустойчивость (Генкель, 1982).

Из анализа проведенных нами исследований на протяжении 5 суток засухи интенсивность транспирации, водоудерживающая способность были значительно выше у модифицированных растений картофеля, чем у исходной формы (сорта Жуковский ранний). Это показывает, что они адаптированы к неблагоприятным факторам среды. По мере усиления засухи в листьях картофеля накапливался свободный пролин, причем его содержание в листьях модифицированных растений в несколько раз выше, чем у контрольных. Синтез свободных аминокислот и амидов также был значительно усилен у ТУ-регенерантов картофеля. Повышенное содержание аминокислот и амидов в листьях трансгенных (модифицированных) растений, вероятно, указывает на их участие в осморегуляции. Предположительно, в растениях сорта Жуковский (Жолкевич и др., 1997) участие свободных аминокислот и амидов в осмотическом давлении возрастает по мере действия засухи, особенно у засухоустойчивого генотипа растений.

В наших опытах при 5 суточной засухе значительно возрастало содержание свободного пролина. Известно, что свободный пролин участвует во многих физиолого-биохимических процессах, способствующих устойчивости растений к неблагоприятным условиям. Он защищает от разрушения макромолекул (белков, нуклеиновых кислот), участвует в запасании азота, выполняет энергетическую функцию, а также является антиоксидантом (Кузнецов, Шевякова, 1999). Другие авторы обнаружили изменение содержания 9 основных аминокислот при засухе (Пуставойтова и др., 2000). Они также показали, что у трансгенных форм табака при засухе усиливается синтез основных аминокислот, особенно пролина и триптофана нежели у исходной формы.

В наших экспериментах обнаружили ряд аминокислот, присутствие которых, очевидно, необходимо для нормального протекания адаптированной устойчивости растений к стрессу. К ним относятся накопление свободного пролина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, глицина и серина., а также в значительном количестве обнаруживается аланин и амиды: глутамин и аспарагин. При анализе свободных аминокислот у клеточно-модифицированных и обычных растений мы акцентировали внимание на изменении только тех аминокислот и амидов, уровень которых существенно различается. На пятые сутки засухи обнаруживается, что суммарное содержание выше перечисленных свободных аминокислот и амидов в листьях опытного варианта растений существенно превышали их количество у контрольных растений. Сопоставление содержания отдельных свободных аминокислот и амидов между исследованными растениями при засухе и в норме, обнаруживалось, что количество пролина превышало в 10−18 раз у ТУ-растений-регенерантов и в 2−3 раза у исходных (контрольных) растений. Количество аланина у модифицированных растений, наоборот, резко снижалось при засухе. Сумма глицин+серин у модифицированных растений при засухе не изменялось. Некоторые изменения суммы глицин+серин наблюдались при засухе у исходных растений. Количество глютаминовой кислоты, аспарагиновой и амидов резко увеличивалось при засухе у модифицированных растений. У контрольных растений их количества изменялись незначительно при засухе.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что при воздействии стрессовых факторов (водный дефицит) клеточно-модифицированные растения и исходные формы реагируют не однозначно.

Обнаружены различия в суммарном содержании некоторых свободных аминокислот и амидов у обоих исследованных форм растений картофеля при нормальном водообеспечении. Повышение содержания свободных аминокислот, таких как пролин, глютаминовая кислота, аспарагиновая кислота и амиды в листьях модифицированных растений указывают на их существенный вклад в осморегуляционный процесс. Роль этих свободных аминокислот в осморегуляции резко возрастает по мере действия засухи, особенно у клеточно-модифицированных генотипов картофеля.

Из полученных данных следует, что в условиях водного дефицита (засухи) модифицированные растения картофеля с высоким содержанием пролина более адаптированы к обезвоживанию. Видимо защитные реакции модифицированных растений направлены на включение генов синтеза пролина, а адаптационный процесс направлен на перестройку физиолого-биохимического механизма и изменение процессов осморегуляции.

Таким образом, полученные результаты и разработанные нами биотехнологические методы направлены на расширение генетического базиса селекции картофеля путем создания ценных генотипов исходной формы, не только ускоряющие процессы селекции, но и раскрывающие механизмы физиолого-биохимических процессов продуктивности растений, а также способствует развитию исследований в области генной инженерии с целью получения улучшенных растений картофеля, устойчивых к неблагоприятным факторам среды.

Регенерация растений in vitro позволила увеличить генотипическую изменяемость исходного сорта картофеля и получить ценный генетический материал с новой экспрессией генов. Нами получены данные по стабильности экспрессии генов устойчивости к высокой температуре и их сохранение при ведении пробирочной культуры растений in vitro, а также в полевых условиях (первый год испытания). В культуре ткани листа путем многократного скрининга к температурному фактору получены регенеранты растений с большой вариабельностью по морфологическим показателям. При исследовании сомаклональной изменчивости регенерантов растений у одних отмечены различия по некоторым признакам, которые сохранились в течении длительного культивирования по ряду признаков in vitro. У других морфофизиологические отклонения усиливались от пасажа к пасажу. И появились химерные растения. У третьих на стадии каллусного роста, предшествующего регенерации происходили как генетические так и эпигенетические изменения. Из 800 регенерантов остались единичные фертильные растения (всего 3 растения), которые были пригодны в физиолого-биохимических и молекулярно-биологических исследованиях.