Исследование роли парамагнитных интермедиатов в биологически важных процессах методами спиновой химии и химической радиоспектроскопии

3.2. Фотоиндуцированная изомеризация а, Р-ненасыщенных кетонов.-51.

3.3. Фотоизомеризация ретиналя.-59.

3.4. Фотоиндуцированные превращения изомеров р-ионона в растворах.-70.

3.5.

Заключение

-100.

— ГЛАВА 4. Окислительно-восстановительные реакции каротиноидов.-101.

4.1.

Введение

-101.

4.2. Окислительно-восстановительные реакции каротиноидов с хинонами и ионами металлов.-103.

4.3. Реакции каротиноидов со свободными радикалами. Антиоксидантные свойства каротиноидов.-107.

4.4. Роль процессов с переносом электрона в про-оксидантной активности каротиноидов.-116.

4.5.

Заключение

-124.

— ГЛАВА 5. Попытка моделирования элементарных стадий лиганд-рецепторных взаимодействий.-126.

5.1. Постановка задачи.-126.

5.2. Моделирование взаимодействия нифедипина с кальциевым рецептором с использованием методов спиновой химии.-127.

5.3. Изучение механизмов фотоиндуцированных окислительно-восстановительных процессов с участием природного алкалоида лаппаконитина.-140.

5.3.1. Изучение механизмов фотоиндуцированных окислительно-восстановительных процессов в реакциях лаппаконитина с индивидуальными аминокислотами.-140.

5.3.2. Изучение механизма фототрансформации лаппаконитина методами ХПЯ и ЯМР.-152.

5.4. Выводы и биологическое значение результата.-165 ГЛАВА 6. Исследование кинетических закономерностей поведения радикальных пар в мицеллярных растворах с использованием импульсной микроволновой накачки электронных переходов в РП.-167.

6.1.

Введение

-167.

6.2. Описание методики.-168.

6.3. Изучение динамики радикальных пар в мицелярных растворах.-174.

6.4. Исследование структуры и динамики мицелл с использованием время-разрешенного метода PYESR. Влияние температуры и концентрации соли на структуру и динамику мицеллы.-178.

6.5. Фотохимия ацетиленовых кетонов в SDS мицеллах. Влияние внешнего магнитного поля на выход радикальных продуктов реакции.-189.

6.6.

Заключение

:.-200.

• ГЛАВА 7. Влияние организованной среды на окислительно-восстановительные процессы с участием биологически активных соединений.-202.

7.1.

Введение

-202.

7.2. Строение и реакционная способность комплексов включения каротиноидов с цикло декстринами.-203.

7.3. Супрамолекулярные комплексы каротиноидов с глицирризиновой кислотой.-221.

7.4. Изучение комплексообразования нифедипина с глицирризиновой кислотой. .-237.

7.5. Исследование влияния комплексообразования на реакционную способность лаппаконитина.-245.

7.6. Выводы и биологическое значение результатов.-251.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ.-253.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

-254.

В последнее десятилетие произошел качественный скачок в исследовании химических процессов происходящих в живой природе. Этот прогресс характеризуется, прежде всего, переходом с макро уровня на микро уровень в понимании механизмов этих процессов. Особый прогресс был достигнут в биологии и медицине, свидетельством чему является присуждение Нобелевских премий по медицине в последние годы. Немалая заслуга в этом принадлежит, несомненно, развитию и применению новых физических методов исследования биологически важных процессов. В настоящей работе с помощью современных физических методов исследована роль парамагнитных интермедиатов ряда конкретных биологически активных соединений в процессах, представляющих практический интерес для биологии и медицины. Это — окисление 1,4-дигидропиридинов — аналоговкофермента NADH, лиганд-рецепторное взаимодействие, цис-транс изомеризация полиенов, антиоксидантная активность каротиноидов, а также фотостабильность и фототоксичность ряда лекарственных препаратов.

Современные физические методы позволяют не только изучать структуру продуктов конкретных биохимических процессов, но и получать новую информацию о структуре И' временах жизни короткоживущих интермедиатов этих реакций, а также о механизмах процессов на молекулярном уровне. Широкое применение в биологии имедицине нашли структурные методы исследования. В частности, методы химической радиоспектроскопии (ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и электронный парамагнитный резонанс (ЭПР)) позволяют исследовать структуру и динамику сложных биологических молекул и их парамагнитных форм. В настоящее время эти методы применяются для исследования структуры белков, олигои поли-нуклеотидов и других биополимеров. Поскольку биологическая активность биополимеров напрямую связана с их пространственной структурой, эти данные имеют огромное практическое значение, в частности, для понимания механизмов работы клеточных рецепторов и для создания новых более эффективных лекарственных форм.

Наряду со структурными методами широкое развитие получили кинетические методы исследования химических процессов. Большая часть этих методов основана на импульсной инициализации реакций с последующей регистрацией временной эволюции исходных соединений или продуктов реакции (конечных и промежуточных). Наибольшим временным разрешением обладают фотохимические и радиационные методы генерации химической реакции. Помимо огромного разнообразия фотохимических процессов происходящих в живой природе, эти методы позволяют генерировать и изучать свойства промежуточных парамагнитных интермедиатов, про которые известно, что они образуются в темновых реакциях в живых клетках. Моделирование, в частности, ферментативных процессов с помощью фотохимической генерации позволяет повысить концентрацию короткоживущих парамагнитных интермедиатов, и тем самым облегчает их регистрацию. Такой же цели нередко служит проведение реакций в так называемых организованных средах (мицеллы, комплексы «гость — хозяин», и др.). Известно, что большинство фотохимических процессов и многие ферментативные процессы протекают по радикальному механизму. В настоящей работе автор также будет прибегать к такого рода моделированию, т. е. исследовать модельные фотопревращения биологически важных молекул, а также их реакции в организованных средах.

Целью настоящей диссертационной работы являются исследования методами спиновой химии и химической радиоспектроскопии роли корокоживущих парамагнитных интермедиатов, образующихся в процессах с участием биологически важных молекул в растворах и организованных средах. В качестве объектов исследования выбраны 1,4-дигидропиридины — синтетические аналоги NADH, природные полиены, включая ретиналь, являющийся частью зрительного пигмента родопсина, и каротиноиды, а также биологически активные карбонильные соединения и некоторые лекарственные препараты. Выбор объектов, определяющий во многом актуальность и практическую" значимость представленной работы связан со следующими обстоятельствами. Все выбранные соединения, или их природные аналоги, участвуют в биологических системах в окислительно-восстановительных превращениях, механизмы которых не были установлены.ранее. И именно роль парамагнитных частиц в этих процессах, являлась, а кое-где является и поныне, предметом дискуссии.

В настоящее время методики спиновой химии занимают' важнейшее место в исследованиях процессов с участием радикальных частиц. Эти методы основаны на явлении химической поляризации ядер (ХПЯ) и электронов (ХПЭ), а также на явлении влияния магнитного поля на радикальные химические процессы, открытые в семидесятые годы группой новосибирских и московских ученых (открытие № 300 «Закономерность радикальных химических процессов», авторы: A.JI. Бучаченко, Э. М. Галимов, Т. В. Лешина, Ю. Н. Молин и Р.З. Сагдеев). К преимуществам этих методов относится их более высокая чувствительность по сравнению с традиционными методами ЯМР и ЭПР, а также высокая информативность. Так, метод ХПЯ позволяет одновременно получать информацию о парамагнитных интермедиатах, конечных продуктах реакции, и кинетике отдельных стадий.

Говоря о преимуществах тех или иных методов исследования, нельзя не отметить, что каждый метод имеет и свои ограничения, и по области применения, и по чувствительности, и по временному разрешению. Поэтому каждый метод в отдельности, как правило, не дает всей необходимой информации о процессе, особенно для таких сложных объектов, какими являются биологические системы. Для более глубокого изучения механизмов сложных процессов необходимо применение комбинации различных методов, а также создание новых методик и экспериментальных установок, наилучшим образом подходящих для решения конкретной задачи. В представленной работе значительное внимание уделяется разработке и применению комплексного использования современных физико-химических методов для исследования биологически важных процессов. Особое внимание уделено время-разрешенным методам спиновой химии в сочетании с оптической спектроскопией, ЭПР и ЯМР в стационарном и импульсном вариантах. Подробному описанию используемых в этих исследованиях экспериментальных установок и методических подходов посвящена Глава 1 диссертации. Основная часть работ выполнена в лаборатории Магнитных явлений Института химической кинетики и горения СО РАН на ЯМР спектрометрах фирм Varian, Bruker и Jeol с различной напряженностью магнитного поля, снабженных стационарными и импульсными источниками света для проведения фотохимических экспериментов и регистрации эффектов ХПЯ. Кроме того, часть работ выполнена автором диссертации в рамках международного сотрудничества с коллегами из Латвии, США и Японии-. Мы благодарны коллегам из Латвии за синтез широкого набора замещенных 1,4-дигидропиридинов — аналогов природного кофермента NADH. В. содружестве с Университетом штата Алабама, США (Проф. Л.Д. Кисперт), выполнен цикл работ, посвященный исследованию окислительно-восстановительных процессов с участием широкого набора каротиноидов и их супрамолекулярных комплексов. Совместно с группой Д-ра Оказаки (National Industrial Research Institute of Nagoya, Japan) создан время-разрешенный вариант метода PYESR (product-yield-detected-ESR) для исследования динамики радикальных пар и магнитных эффектов! в организованных средах. В проведении расчетов участвовали сотрудники лаборатории Теоретической химии ИХКГ СО РАН, Проф. Счастнев П. В. и Башурова B.C.

Главы 2−7 настоящей диссертации посвящены описанию конкретных исследований процессов с участием биологически важных соединений с использованием набора физических методов. При этом результаты работы поделены на две части: исследование процессов в гомогенных растворах (главы 2−5) и в организованных средах (комплексы «хозяин — гость» и мицеллы, главы 6−7).

Вторая глава диссертации посвящена исследованию процессов с переносом электрона в реакциях 1,4-дигидропиридинов (ДГП) — синтетических аналогов природного кофермента NADH. Дискуссия о возможностях гетеролитического и гемолитического механизмов превращения этого соединения в живых системах не утихает последние несколько десятилетий. В настоящей работе исследования проводились с использованием различных методов спиновой химии: ХПЯ в сильных и слабых магнитных полях, ХПЯ с временным разрешением, а также СПЯ (стимулированная поляризация ядер). Исследование модельных реакций фотоиницированного окисления целого ряда замещенных 1,4-дигидропиридинов в присутствии различных акцепторов электрона и сравнение фотоинициированных и темновых процессов позволило установить роль радикальных частиц в этих процессах. В частности, удалось проследить за всеми тремя* стадиями процесса превращения ДТП в пиридин: последовательный перенос электрона, протона и атома водорода, или электрона, протона, электрона). Сравнения эффектов ХПЯ ряда замещенных ДГП показали, что механизм реакции существенно различается для N-замещенных и N-незамегценных ДГП. Для того, чтобы установить как зависит механизм реакции от физико-химических параметров системы, от полярности среды и структуры молекулы ДГП, был изучен фотолиз различных синтетических N-замещенных и N-незамещенных ДГП в полярной и неполярной средах.

Следующий цикл работ посвящен исследованию механизмов цис-транс изомеризации полиненасыщенных соединений. Этот вопрос подробно освещен в Главе 3 диссертации. В< этой главе описаны механизмы" цис-транс изомеризации, полиенов,' включающие стадию переноса электрона. В’отличие от оптических методов исследования, методы ЯМР и ХПЯ позволяют раздельно наблюдать сигналы от разных изомерных форм, что позволило нам впервые применить эти методы для исследования механизмов изомеризации сложных молекул содержащих несколько сопряженных двойных связей. Следует отметить, что доказательство участия одноэлектронного переноса в процессе цис-транс фотоизомеризации замещенных этиленов в присутствие доноров и акцепторов электрона впервые было получено именно методами спиновой химии и это считается одним из важных её достижений. Изучение свойств ион-радикалов природных полиенов в настоящее время приобретает особую актуальность, поскольку они входят в состав многих биологических систем, в которых идут процессы цис-транс изомеризации, предположительно с переносом заряда. Так, например,* 11 -цис ретиналь является хромофором зрительного пигмента родопсина. Считается, что его цис-транс изомеризация инициирует процесс зрительного восприятия в глазу человека и других млекопитающих. В представленном цикле работ получены экспериментальные доказательства участия следующих промежуточных короткоживущих частиц в реакциях цис-транс изомеризации полиенов: триплетные возбужденные состояния, образующиеся при рекомбинации триплетной ион-радикальной парыкатион-радикалы и дикатионыа также вторичные интермедиаты образующиеся из ион-радикалов: нейтральные радикалы и бирадикалы. Для каждого из описанных вариантов установлен детальный механизм изомеризации.

Примером комплексного подхода к изучению биологически важных процессов является исследование окислительно-восстановительных реакций каротиноидов, описанное в четвертой главе. В представленном цикле работ, выполненных с использованием различных физико-химических методов исследования (ЯМР, ЭПР (включая импульсные методики), ХПЯ, ВЭЖХ, электрохимия, оптическая спектроскопия и флюоресценция) изучен ряд окислительно-восстановительных процессов с участием природных и синтетических каротиноидов. Известно, что каротиноиды являются одним из самых распространенных классов пигментов’в природе. Они синтезируются растениями и микроорганизмами и присутствуют во многих пищевых продуктах, включая овощи, фрукты и рыбу. В большинстве природных процессов, включая фотосинтез, их роль чаще всего связывают с реакциями переноса энергии и электрона. В медицине интерес к каротиноидам связан, прежде всего, с их антиоксидантными свойствами. Сегодня антиоксиданты, и в частности каротиноиды, используются на практике в комплексном лечении таких серьезных заболеваний, как рак, болезни сердца, нервной системы, а также возрастные дегенеративные изменения мышечных тканей. В связи с упомянутым" интересом к антиоксидантным свойствам каротиноидов можно утверждать, что именно химические и физико-химические исследования реакционной способности каротиноидов в окислительно-восстановительных процессах в настоящий момент являются приоритетными. Сегодня исследователи разных специальностей, от физиков и химиков, до биологов и медиков, заняты выяснением природы основных факторов, определяющих их антиоксидантную активность. Имеющаяся в литературе информация о короткоживущих парамагнитных и диамагнитных интермедиатах, образующихся в реакциях каротиноидов со свободными радикалами, весьма ограничена, а структура интермедиатов, как правило, только предполагается. Поэтому именно на исследования, связанные с реакционной способности каротиноидов, а также их короткоживущих парамагнитных интермедиатов" были направлены работы, описанные в настоящей главе диссертации. Показано, что в зависимости от условий эксперимента и природы каротиноида они могут проявлять как антиоксидантные, так и про-оксидантные свойства. При этом, антиоксидантная активность каротиноидов напрямую связана с их восстановительной способностью.

В пятой главе диссертации описан развитый в рамках настоящей работы оригинальный подход к изучению механизмов лиганд-рецепторных взаимодействий на молекулярном уровне на примере моделирования взаимодействия ряда лекарственных препаратов и их комплексов с активными центрами рецепторов. Понимание механизмов терапевтического действия лекарственных препаратов на молекулярном уровне является одной из важнейших задач биохимии и фармакологии. Успешное решение этой проблемы имеет принципиальное значение не только для фундаментальной науки. Понимание механизма взаимодействия лекарства с клеточным рецептором может стать определяющим фактором при разработке новых лекарственных средств. Вот почему в последние годы стали появляться работы направленные на изучение механизмов процессов происходящих в активных центрах клеточных рецепторов на молекулярном уровне, постепенно вытесняя широко используемый до этого макроскопический подход. Представленный экспериментальный подход основан на моделировании с помощью физических методов отдельных стадий процесса взаимодействия лекарства с аминокислотами, остатки которых располагаются в активных центрах клеточных рецепторов. Основой для построения модели послужили приведенные в литературе расчеты, указывающие на образование донорно-акцепторного комплекса между молекулой гипотензивного препарата — нифедипина и аминокислотой — тирозином, располагающимся в активном сайте кальциевого рецептора. В работе было предположено, что в таком комплексе может происходить одноэлектронный перенос. Данная гипотеза* была проверена и получила экспериментальное подтверждение на примере двух лекарственных препаратов: нифедипина — блокатора кальциевых рецепторов, и лапаконитина — блокатора натриевых каналов. Механизм взаимодействия между молекулами лекарств и аминокислотами тирозином и триптофаном, входящими в активные центры соответствующих рецепторов, изучен методами ядерного магнитного резонанса и химической поляризации ядер, включая версию с временным разрешением. Доказано, что первичной стадией процесса в обеих системах действительно является перенос электрона. Показано, что анион-радикалы обоих лекарственных соединений нестабильны и быстро (в микросекундном временном диапазоне) превращаются в продукты, не способные к связыванию с рецептором. Этот факт важен, поскольку проливает свет на практически не изученную природу диссоциации комплекса лекарства с рецептором.

Отдельный интерес представляют результаты исследования фотохимии нифедипина и лаппаконитина в растворах в присутствие доноров и акцепторов электрона. Вопрос о фотостабильности лекарственных препаратов весьма актуален для фармакологии, поскольку фотораспад приводит не только к уменьшению терапевтической активности препарата, но и может привести к образованию токсических продуктов или интермедиатов. Показано, что оба этих соединения фоточувствительны в УФ диапазоне и при фото возбуждении вступают в реакции переноса электрона с рядом аминокислот, а также другими органическими молекулами. Установлено, что результатом реакции является образование широкого набора N-, О-, и С-центрированных свободных радикалов и ион-радикалов нифедипина, лаппаконитина и партнеров. Кроме того, в триплетном возбужденном состоянии лаппаконитин сам подвергается внутримолекулярному переносу электрона с образованием бирадикала. Детально описаны механизмы всех исследованных процессов. Не исключено, что именно короткоживущие парамагнитные интермедиаты являются причиной высокой токсичности лаппаконитина.

Во второй части диссертации (главы 6−7) описываются окислительно-восстановительные процессы с участием биологически активных соединений в организованных средах и развитый оригинальный подход для исследования кинетики процессов в организованных средах — мицеллах.

Шестая глава посвящена изучению динамики радикальных пар в мицеллярных растворах. Эта проблема представляет интерес, прежде всего, с точки зрения понимания механизмов межмолекулярных взаимодействий в системах с ограниченной подвижностью, к которым можно отнести практически все биологические системы. Отметим, что именно в таких системах были зарегистрированы значительные магнитные эффекты на выход продуктов реакции. В последние несколько десятилетий вопрос о влиянии слабых магнитных и электрических полей на живые системы привлекает внимание многих исследователей, включая медиков и биологов. Это связано как с фундаментальными проблемами понимания механизмов ориентации животных в магнитном поле Земли, так и с практическими задачами оценки возможного вредного воздействия современных диагностических и лечебных методов. Обнаружение в наших работах значительных магнитных эффектов (сотни процентов) на выход свободных радикалов в фотоинициированных процессах с участием ряда карбонильных соединений является наглядной демонстрацией, как актуальности этих проблем, так и реальности решения стоящих перед наукой задач.

В представленном цикле работ реализована идея об использовании импульсной микроволновой накачки электронных переходов в РП для получения кинетической информации о скоростях образования и гибели радикальных пар в мицеллах. Созданный в результате данной работы время-разрешенный импульсный вариант метода PYESR (product-yield-detected-ESR) обладает целым рядом преимуществ перед существовавшими на тот момент методиками, использующими аналогичный принцип микроволновой накачки электронных переходов в РП. В работе были измерены кинетические параметры радикальных пар образующихся при фотолизе ряда карбонильных соединений (антрахинон и ацетилен-замещенные ароматические кетоны) в мицеллярных растворах, а также изучено влияние внешних факторов (температура и концентрация соли) на структуру и динамику самих мицелл. Отметим, что все исследованные системы представляют интерес и с точки зрения их биологической активности. Известно, что многие природные и синтетические антрахиноны и их производные обладают противоопухолевой активностью, а ацетилен-содержащие кетоны используются как антигрибковые препараты.

В первой части следующей Главы затронута проблема касающаяся комплексообразования каротиноидов и влияния организованной среды на их реакционную способность в окислительно-восстановительных процессах. Известно, что такие свойства каротиноидов, как гидрофобность, высокая фоточувствительность и химическая активность, существенно затрудняют их применение на практике. Одним из путей решения подобных проблем в фармакологии, является использование комплексов включения типа «гость-хозяин». Молекулы «гостя» в комплексе могут изменить свои физические, химические и биологические свойства. Установлено, что комплексообразование может значительно увеличить стабильность и биодоступность включенных молекул. Работы представленные в диссертации можно считать пионерскими, поскольку в литературе практически отсутствовали данные, касающиеся физико-химических свойств комплексов включения каротиноидов. Интересной находкой' в этом плане явилось использование в качестве молекулы «хозяина» р-глицирризиновой кислоты — природного соединения принадлежащего к тритерпеновым гликозидам. Показано, что комплексообразование с глицирризиновой кислотой оказывает заметное воздействие на реакционную способность каротиноидов. Было зарегистрировано уменьшение скоростей переноса электрона в реакции с акцепторами, а также удлинение времени жизни катион-радикалов каротиноидов в комплексах, приводящее к изменению соотношения продуктов реакции. Экспериментально обнаружено многократное увеличение скорости захвата перекисных радикалов (антиоксидантная активность) каротиноидами в комплексе, и установлена причина этого явления. Следует отметить, что, несмотря на большой интерес к использованию комплексов включения с целью направленного изменения свойств включенных соединений, до сих пор остается открытым вопрос о природе влияния комплексообразования на их реакционную способность. Представленные в настоящей главе результаты исследований процессов одноэлектронного переноса с участием комплексов каротиноидов, — это немногочисленные примеры попыток ответить на поставленные вопросы. Прежде всего, показано, что перенос электрона характерен для каротиноидов не только при их превращениях в фотосинтетических центрах, но и при взаимодействии со свободными радикалами, а также при цис-транс изомеризации. Можно констатировать, что именно склонность к одноэлектронному переносу объединяет наиболее важные биологические процессы с участием каротиноидов, начиная от фотосинтеза и фотоизомеризации ретиналя в* составе зрительного пигмента родопсина, и кончая их антиоксидантной активностью.

В’Главе 7 представлен также цикл работ, посвященных исследованию структуры и реакционной способности комплексов включения нифедипина и лаппаконитина с. глицирризиновойкислотой. Поводом для данных исследований явилось экспериментальное обнаружение значительного (в десятки исотни раз)' усиления терапевтической активности этих препаратов в^ присутствие глицирризиновой кислоты. Созданиеэффективных лекарственных препаратов на основе комплексов-включения-с природнымисоединениями сегодня является бурно развивающейсяобластью медицинской' химии. Использование комплексов^ включения позволяет направленно' регулировать (усиливать или ослаблять) те или иные свойства лекарственных соединений. Используя оптическую и ЯМР спектроскопию (включая релаксационные методы) удалось показать, что глицирризиновая1 кислота, образует очень стабильные комплексы как с нифедипином, так, и с лаппаконитином. Показано, что комплексообразование повышает растворимость препаратов в воде и существенно снижает скорость фоторазложения нифедипина и лаппаконитина и выход свободных радикалов. Данный результат может иметь практическое значение дляувеличения фотостабильности, других лекарственных препаратов, увеличения их биодоступности и снижения токсичности (включая, фототоксичность).

В.

заключение

отметим, что полученные в настоящей работе результаты могут представлять интерес для. разных областей науки, (химическая физика, химия, биохимия, медицина). Кроме того, результаты, полученные во второй части диссертации, касающиеся повышению стабильности каротиноидов и лекарственных препаратов за счет комплексообразованияимеют несомненное практическое значение и будут небезынтересны для пищевой промышленности, косметологии и фармакологии.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ.

I. В первой части работы, в результате исследования строения и свойств радикальных интермедиатов в растворах, установлены детальные механизмы ряда биологически значимых процессов:

1) Продемонстрировано, что фотоинициированное окисление акцепторами электрона синтетических аналогов NADH — 1,4-дигидропиридинов (ДГП) проходит по радикальному пути с образованием тех же продуктов, которые получаются и в реакциях смешения: соответствующих пиридинов или катионов пиридиния.

2) На примере широкого набора полиненасыщенных соединений получены экспериментальные доказательства участия короткоживущих парамагнитных частиц в реакциях фотоинициированной цис-транс изомеризации.

3) Продемонстрировано, что скорости реакций перекисных радикалов с каротиноидами с коррелируют с их окислительными потенциалами. Это прямо указывает на связь антиоксидантной активности каротиноидов с процессом переноса электрона. Установлено, что каротиноиды могут проявлять как антиоксидантные, так и про-оксидан гные свойства, и определена роль ионов металлов в этих процессах.

4) Показано, что при фотолизе лекарственных препаратов нифедипина и лаппаконитина в растворах образуются активные короткоживущие парамагнитные интермедиаты: бирадикалы, ион-радикалы и нейтральные радикалы, могущие быть причиной фототоксических побочных эффектов, возникающих при медицинском применении этих препаратов.

II. Во второй части исследованы процессы в организованных средах:

5) Создан время разрешенный импульсный вариант метода PYESR, позволяющего регистрировать спектры ЭПР короткоживущих радикальных пар. Измерены кинетические параметры радикальных пар образующихся при фотолизе ряда биологически активных карбонильных соединений в мицеллах SDS, а также зарегистрированы значительные магнитные эффекты на выхода и времена жизни свободных радикалов.

6) Показано, что комплексообразование с глицирризиновой кислотой оказывает заметное воздействие на реакционную способность каротиноидов в окислительно-восстановительных реакциях. Обнаружено, что комплексообразование повышает растворимость препаратов в воде, и существенно увеличивает фотостабильность нифедипина и лаппаконитина. Последний результат может быть использован в медицинской практике, т.к. исследованные лекарства являются фототоксичными.

6.6.

Заключение

.

В представленной главе описана идея использования импульсной микроволновой накачки электронных переходов в РП для получения кинетической информации о скоростях образования и гибели радикальных пар в мицеллах. В результате реализации этой идеи был создан время-разрешенный импульсный вариант метода product-yield-detected-ESR, PYESR. Применение данной методики позволяет детектировать спектр ЭПР промежуточной радикальной пары по изменениямs в выходе продукта реакциидолгоживущего спинового аддукта. В этом заключается преимущество данного подхода перед остальными аналогичными методиками, поскольку мы не ограничены ни в выборе системы (не требуется присутствие флуоресцирующего реагента как в методе ОДЭПР), ни в скорости регистрации (как в методе СПЯ). Дополнительное преимущество данного метода по сравнению с обычным методом ЭПР заключается еще и в возможности детектировать короткоживущие геминальные РП при комнатных температурах. Необходимым условием регистрации качественных спектров PYESR является наличие большого магнитного эффекта реакции, что достигается в данной методике использованием мицеллярных растворов. Демонстрация значительных эффектов магнитного поля на выход продуктов реакции в организованной среде, представленная в данной главе, имеет большое самостоятельное значение, поскольку организованная среда имеет непосредственное отношение ко всем биологическим системам. Интерес исследователей к проблеме влияния внешнего слабого магнитного поля на химические процессы в живой природе связан с попыткой понять механизм ориентации животных и птиц по сторонам света, с анализом возможного вредного воздействия электромагнитных излучений на здоровье человека, а также с поиском новых возможностей управления химическими процессами.

Приведенные в данной главе примеры использования метода PYESR с временным разрешением демонстрируют уникальные возможности данного метода для получения кинетической информации о динамике радикальных пар в растворах. В настоящей работе были измерены кинетические параметры радикальных пар образующихся при фотолизе ряда карбонильных соединений (антрахинон и ацетиленовые кетоны) в мицеллярных растворах. Полученные данные о структуре радикальных пар и о кинетике процесса фотовосстановления хорошо согласуются с данными полученными другими методами, в частности, методами ХПЯ и лазерного импульсного фотолиза. Отметим, что использование в исследовании комбинации различных кинетических методов существенно повышает объем и достоверность полученной информации. В последующие годы этот метод успешно применялся нашими японскими коллегами для исследования бирадикалов, а также радикальных пар в других средах с ограниченной подвижностью, в частности, в нанопорах [321−322].

В контексте глобальной проблемы влияния организованной среды на реакционную способность химических соединений, рассматриваемой в настоящей диссертации, наиболее важными являются следующие наблюдения. Это существенные изменения времен жизни РП и вероятностей клеточной рекомбинации свободных радикалов в мицеллах по сравнению с гомогенным раствором, а также зависимость динамики партнеров РП от параметров самой мицеллы. Эти наблюдения содержат указания на возможные причины изменений в механизмах и направлении реакций для многостадийных радикальных процессов в организованных средах. Исследованию таких процессов с участием биологически важных соединений методом ХПЯ, а также другими физическими методами посвящена следующая глава диссертации.

ГЛАВА 7. Влияние организованной среды на окислительно-восстановительные процессы с участием биологически активных соединений.

7.1.

Введение

.

Исследование влияния организованной среды на радикальные процессы с участием биологически активных соединений представляет интерес с нескольких точек зрения. Во-первых, такие исследования помогают лучше понять механизмы химических процессов происходящих в живой природе. А, во-вторых, они имеют несомненное прикладное значение, поскольку многие из этих соединений широко используются в качестве лекарственных препаратов, витаминов или пищевых продуктов. В последние годы стало развиваться направление, связанное с попыткой усилить терапевтическое действие препаратов с помощью комплексов включения. Использование супрамолекулярных комплексов в медицине сегодня является одним из наиболее эффективных способов улучшения свойств существующих лекарственных препаратов. Наибольшие успехи в этом направлении были достигнуты в увеличении растворимости лекарств, повышении их биодоступности и уменьшении побочных эффектов.

В настоящей главе описаны результаты работ посвященных изучению влияния комплексообразования на реакционную способность ряда биологически активных соединений (ряда каротиноидов и двух лекарственных препаратов, нифедипина и лаппаконитина) в процессах,, которые в растворах исследовались в первой части диссертации. Используемые комплексанты, циклодекстрины (ЦД) и глицирризиновая кислота (ГК), а также методы анализа комплексов включения подробно описаны в Главе 1 настоящей диссертации. Поводом для начала этих исследований послужило открытие, сделанное с участием автора настоящей работы, значительного увеличения терапевтической активности лаппаконитина и нифедипина (в 20 и 300 раз, соответственно) в присутствие ГК. Было предположено, что данный эффект может быть связан с образованием комплексов ГК с лекарственным соединением, но ни структура этих комплексов, ни механизм влияния комплексообразования на терапевтическую активность препарата известны не были. Отметим, что лаппаконитин и нифедипин являются не единственными примерами, для которых был обнаружен синергизм при совместном использовании с глицирризиновой кислотой.

Учитывая, что в настоящее время создание супрамолекулярных комплексов лекарственных препаратов с различными природными соединениями является одним из самых многообещающих направлений в области медицинской химии, полученные нами.

202 результаты, безусловно, имеют и самостоятельную значимость в плане использования глицирризиновой кислоты для повышения биодоступности и фотостабильности биологически активных соединений.

7.2. Строение н реакционная способность комплексов включения каротиноидов с циклодекстринами.

Применение каротиноидов в качестве антиоксидантов на практике (в пищевой промышленности, косметологии и медицине) сильно затруднено из-за нестабильности каротиноидов в присутствие кислорода воздуха, их гидрофобности и высокой светочувствительности. Поэтому, целью получения из них комплексов включения является, прежде всего, преодоление указанных трудностей при использовании каротиноидов. Наибольшее количество работ в этой области посвящено приготовлению и изучению свойств комплексов каротиноидов с циклодекстринами (Рис. 1.10). Прикладные исследования уделяли основное внимание улучшению растворимости и стабильности каротиноидов в водных растворах [323−325], а фундаментальные — изучению структуры комплексов, биодоступности каротиноидов на клеточном уровне, проникновению каротиноидов через клеточные мембраны, а также использованию циклодекстринов как моделей природных ферментов [326−336].

Благодаря разнообразию и насыщенности цветовой гаммы каротиноидов, они нашли применение в пищевой промышленности не только как антиоксиданты, но и как красители для пищевых продуктов. Применение комплексов каротиноидов с циклодекстринами в качестве пищевых красителей продемонстрировало как увеличение стабильности красителя при хранении, так и получение более стойкой окраски продуктов питания. В частности, добавление в рацион питания лососевых рыб комплекса астаксантина с циклодекстрином значительно улучшает стойкость окраски мяса лосося при хранении по сравнению с добавкой чистого астаксантина [337]. Комплекс циклодекстрина с Р-каротином обладает значительно менее насыщенной окраской по сравнению с раствором Р-каротина в органических растворителях. Ряд авторов используют даже термин «бесцветный» для характеристики этого комплекса [325]. Это качество комплекса заинтересовало косметологов, которые предложили использовать комплекс в качестве добавки в косметические крема в качестве антиоксидантов [323]. Полученные таким способом составы обладают приятным розовым цветом, в отличие от насыщенно-кирпичного при добавке чистого Р-каротина. В России комплекс Р-каротина с Р-циклодекстрином широко применяется под названием «Циклокар» как биологически активная добавка, а также как сырье для пищевой промышленности и детского питания.

338, 339]. В тоже время, показано, что хотя (3-циклодекстрин и увеличивает стабильность P-каротина по отношению к действию света, повышенной температуры и кислорода воздуха, применение других циклодекстринов, а именно а-циклодекстринов и в особенности метилированных (3-циклодекстринов дает существенно больший эффект [340]. Широкое применение на практике именно (3-циклодекстрина связано по-видимому с его доступностью и относительно низкой стоимостью.

В связи с этим, нельзя не отметить, что авторы перечисленных прикладных работ не рассматривают вопрос о сохранении полезных свойств каротиноидов при комплексообразовании, в частности их антиоксидантной активности. Поскольку антиоксидантная активность каротиноидов, как было показано выше, связана с их реакциями со свободными радикалами, комплексообразование вполне способно оказать влияние на эти процессы. Поэтому этот вопрос требовал специального исследования.

7.2.1. Комплексы включения циклодекстринов с /З-иононом.

Логично предположить, что образование комплекса будет происходить путем включения циклогексенового кольца каротиноида во внутреннюю полость циклодекстрина. Поскольку каротиноиды практически не растворимы в водных растворах, на первом этапе работы мы исследовали образование комплекса со структурным аналогом большинства каротиноидов, Р-иононом [341].

Комплексы готовились путем смешения водных растворов ЦД со спиртовым раствором Р-ионона и дальнейшего перемешивания смеси на магнитной мешалке в течение нескольких часов. Для доказательства образования комплекса использовался один из наиболее удобных и информативных методов исследования комплексов включения, а именно спектроскопия ЯМР [342]. Этот метод дает прямое доказательство включения органического субстрата в полость ЦД. Причиной высокой чувствительности метода ЯМР является изменение магнитного окружения протонов расположенных во внутренней полости ЦД (Нз и Н5) при вытеснении молекул воды молекулой «гостя» (см. Рис. 1.10). Это отражается в заметном изменении химических сдвигов протонов Нз и Н5, в то время как химические сдвиги внешних протонов Hi, Н2 and Н4 остаются неизменными. Метод ЯМР дает информацию о стехиометрии, динамике и структуре комплекса 4.

— p-lonone включения. В частности, диаграмма Джоба (зависимость химического сдвига от относительной концентрации субстрата и ЦД) позволяет рассчитать стехиометрию комплекса [342, 343]. В таблице 7.1 приведены значения химических сдвигов протонов Р-ЦД и Р-ионона (индивидуальные и в комплексе) в водном растворе.