Клеточные механизмы развития пролиферативной витреоретинопатии (экспериментально-клиническое исследование)

В современной офтальмологии один из научно-познавательных акцентов связан с изучением патогенетических механизмов пролиферативной витреоре-тинопатии (ПВР), осложняющей течение таких патологических процессов, как травма, воспаление, сахарный диабет, сосудистые заболевания глаза. Для данной патологии характерен широкий спектр необратимых изменений, ухудшающих прогностические результаты лечения и значительно затрудняющих проведение хирургических вмешательств [6, 45, 48, 84, 215].

Достигнутые знания констатируют, что в основе ПВР лежит эпии субре-тинальное разрастание фиброваскулярной ткани, обладающей контрактильны-ми свойствами, что вызывает складчатость сетчатки с ее последующей ретрак-ционной отслойкой [284, 371].

О сложности и многогранности проблемы патогенеза ПВР свидетельствует тот факт, что в последние годы изучение механизмов развития и формирования пролиферативной ткани в полости глазного яблока привлекает внимание не только офтальмологов, но и ученых иного профиля — морфологов, патофизиологов. Такой широкий подход обеспечивает необходимую фундаментальность проводимым исследованиям, а также открывает перспективу иных концептуальных построений.

Интенсивное развитие витреоретинальной хирургии тесно связано с кли-нико-морфологическими исследованиями периретинальной пролиферации, чему посвящены многие работы отечественных и зарубежных авторов [18, 194, 195, 196, 252, 466]. Однако, на наш взгляд, имеющиеся знания не позволяют с исчерпывающей полнотой объяснить патогенез пролиферативного процесса.

Так, согласно публикациям последних лет, развитие витреоретинальной пролиферации во многом определяется анатомо-физиологическими особенностями строения сетчатки и стекловидного тела, в частности, задней гиалоидной мембраной и ее свойствами [82, 91, 150, 370, 426, 477]. В то же время, роль данной структуры в патогенезе ПВР неоднозначна. С одной стороны, частичная отслойка задней гиалоидной мембраны ведет к прогрессированию пролифера-тивного процесса и способствует возникновению кровоизлияний в стекловидное тело [37, 54]. Полная заднегиалоидная отслойка предотвращает развитие витреоретинальной пролиферации и стабилизирует течение патологического процесса [150, 151].

Экспериментальные и клинические исследования указывают также на важность локальных изменений гомеостаза с развитием метаболического ацидоза, обусловленного активацией свободнорадикальных процессов, интенсификацией перекисного окисления липидов [11, 23, 54, 60, 278]. Продукты метаболизма, накапливаясь в витреальной полости, оказывают повреждающее действие на клеточные структуры внутренних оболочек глаза [54, 177, 299, 372].

Изменения локального иммунитета, выявляемые у больных ПВР различной этиологии, свидетельствуют о формировании и персистенции очага хронического воспаления в заднем полюсе глазного яблока [21, 63, 156, 195, 238, 241, 367]. Наличие дисбаланса системных иммунорегуляторных механизмов усугубляет течение патологического процесса.

Существенная роль в развитии ПВР отводится биологически активным веществам — факторам роста, стимулирующим миграцию клеток, их адгезию и собственно пролиферацию, продукцию других активаторов роста, а также не-оваскулогенез [251, 283, 286, 466].

Новообразование сосудов, согласно теории ангиогенеза, происходит за счет митоза эндотелиоцитов предсуществующих сосудов с формированием «почек роста» [46, 95, 268, 429]. Основу формирования фиброзных мембран составляют те же репаративные процессы, что наблюдаются при заживлении раны: клеточный хемотаксис и митоз, синтез экстрацеллюлярного матрикса, процессы ремоделирования в новообразованной рубцовой ткани [192, 197, 241].

Таким образом, мы полагаем, что тактика и динамика научных исследований патогенеза ПВР на современном этапе характеризуются неоднородностью и отсутствием систематизированного, конструктивного подхода к изучению явлений, лежащих в основе формирования пролиферативной ткани в полости глазного яблока. Обилие конкретной информации привело к тому, что в ней стала теряться концептуальность проблемы.

Разрозненность представлений о месте и значении тех или иных факторов в целостной картине патогенеза ПВР, в известной мере, предопределяют многочисленность и, соответственно, неопределенность подходов, мнений, практических рекомендаций, нередко противоречащих друг другу. Множество сведений о деталях, несомненно важных, отнюдь не отменяет необходимость осмысления законов инициации, развития и фазовых смен основных патогенетических событий при формировании пролиферативной ткани в полости глазного яблока. Сложность состоит в том, что из всего многообразия факторов и взаимосвязей необходимо выделить главные, детерминирующие этот процесс.

Важный шаг в данном направлении — установление механизма, опосредующего и модулирующего межклеточные и клеточно-структурные взаимодействия в патологическом очаге. За этим открывается возможность исследования того, как и каким образом формируется ключевая интегративная система движущих сил процесса.

Все вышеизложенное создает предпосылки для формулирования ряда научно-исследовательских задач, направленных на изучение клеточных механизмов развития фиброваскулярной пролиферации в полости глазного яблока.

Цель исследования — изучить клеточные механизмы инициации и развития пролиферативной витреоретинопатии.

Задачи исследования:

1. Разработать экспериментальную модель пролиферативной витреоретинопатии путем интравитреального введения мононуклеаров крови.

2. Изучить особенности возникновения и динамики развития пролиферативной витреоретинопатии при интравитреальном введении мононуклеаров крови в условиях нормои гипергликемиипровести сравнительный анализ морфогенеза экспериментальной пролиферативной витреоретино-патии в зависимости от уровня гликемии.

3. Разработать новый способ культивирования мононуклеаров периферической крови человека in vitro.

4. Исследовать влияние направленного движения жидкости на морфофунк-циональное состояние мононуклеаров периферической крови человека in vitro.

5. Изучить морфологический состав периретинальных мембран у больных пролиферативной витреоретинопатии различной этиологии.

6. Разработать концептуальную схему целостной картины патогенеза пролиферативной витреоретинопатии с позиций системного анализа.

Научная новизна •.

Впервые разработана экспериментальная модель пролиферативной витреоретинопатии, основанная на индукции патологического процесса интравит-реальным введением мононуклеаров крови.

Впервые создана модель пролиферативной витреоретинопатии, индуцированная интравитреальным введением мононуклеаров крови на фоне экспериментального сахарного диабета. Обнаружено, что развитие пролиферативной витреоретинопатии на фоне экспериментального сахарного диабета характеризуется формированием значительно больших по объему фиброваскулярных мембран с усилением дегенеративных изменений структуры сетчатки. Установлено, что мононуклеарные клетки крови в условиях экспериментальной гипергликемии резко ускоряют патологические процессы в тканях глазного яблока.

Впервые разработано устройство, позволяющее in vitro моделировать клеточные механизмы развития пролиферативной витреоретинопатии в условиях движения питательной среды, сходного с движением жидкости в полости глазного яблока.

Впервые выявлено, что при культивировании in vitro мононуклеаров периферической крови человека в условиях направленного движения питательной среды, в клетках отмечается значительное повышение активности внутриклеточных ферментативных систем. В динамических условиях ускоряется процесс дифференцировки моноцитов крови в макрофагальные клетки, а циркулирующих предшественников фибробластов — в зрелые формы, продуцирующие коллаген. Эти процессы являются патогенетической основой развития и прогрес-сирования пролиферативной витреоретинопатии.

Установлено, что периретинальные пролиферативные мембраны у больных пролиферативной витреоретинопатией различной этиологии характеризуются сходным морфологическим строением. Это патоморфологическое сходство свидетельствует об общих закономерностях развития пролиферативной ткани в полости глазного яблока при различных заболеваниях.

Предложена оригинальная концепция патогенеза пролиферативной витреоретинопатии при различных заболеваниях в аспекте общих механизмов кле-точно-структурных взаимодействий.

Практическая значимость.

Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ для молодых российских ученых за 2003;2004 гг. (№ МК — 2697.2003.04), а также в соответствии с планом проблемной комиссии Межведомственного научного совета при Президиуме РАМН «Структурно-функциональные основы организации мозга в норме и патологии» № 44.01.

Разработанные экспериментальные модели ПВР позволили получить новые данные о патогенезе фиброваскулярной пролиферации. Понимание динамики межклеточных и клеточно-структурных взаимодействий при ПВР, особенно на начальных стадиях, способствует более полному и глубокому познанию сущности данного процесса. Экспериментальное моделирование открывает перспективы для разработки патогенетически обоснованных методов лечения и профилактики ПВР. Получен патент РФ на изобретение № 2 182 369 от 10.05.2002 «Способ моделирования пролиферативной витреоретинопатии».

Результаты культивирования in vitro мононуклеаров периферической крови человека в условиях направленного движения питательной среды позволили существенно расширить представления о влиянии факторов микроокружения на морфофункциональное состояние изучаемых клеток и реализацию их фиброгенного потенциала. Полученные результаты дают возможность с новых позиций подойти к изучению клеточных механизмов развития фиброваскуляр-ной пролиферации в полости глазного яблока. Получен патент РФ на изобретение № 2 221 039 от 10.01.2004 «Способ культивирования мононуклеаров крови in vitro».

Предложенная с позиций системного подхода концепция патогенеза ПВР создает основу для разработки практических рекомендаций с учетом клеточно-структурных взаимодействий в патологическом очаге.

Материалы работы используются в программе лекционного курса и практических занятий на кафедрах патологической физиологииофтальмологии Сибирского государственного медицинского университетав практике офтальмологической клиники Сибирского государственного медицинского университета.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Интравитреальное введение мононуклеарных клеток крови в эксперименте индуцирует развитие пролиферативной витреоретинопатии, приводящей к формированию фиброваскулярной ткани и к тракционной отслойке сетчатки с последующей субатрофией глазного яблока. В условиях экспериментального сахарного диабета мононуклеары крови обусловливают более выраженные (по скорости и амплитуде) деструктивно-пролиферативные изменения в полости глазного яблока.

2. Моделирование клеточных механизмов пролиферативной витреоретино-патии in vitro в условиях направленного движения питательной среды, сходного с движением внутриглазной жидкости, показывает (в сравнении со стационарной культурой клеток) повышение активности внутриклеточных ферментативных систем мононуклеаров периферической крови человека. При этом ускоряется процесс дифференцировки моноцитов в макрофагальные клетки, а циркулирующих фибробластоподобных клеток — в зрелые, коллагенсинтезирующие формы.

3. Периретинальные пролиферативные мембраны у больных пролиферативной витреоретинопатией различной этиологии характеризуются сходным морфологическим строением, что позволяет говорить об общих механизмах их формирования в полости глазного яблока.

4. Изучение механизмов пролиферативной витреоретинопатии с позиций системного подхода указывает на формирование в полости глазного яблока сложной системы, главным патогенетическим фактором которой являются мигрирующие из крови мононуклеарные элементы (моноциты, фибробластоподобные клетки), способствующие инициации и усилению развития фиброваскулярных пролиферативных мембран.

Апробация работы.

Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на Томской областной конференции офтальмологов (1999 г., 2000 г., 2003 г.) — межрегиональной научной конференции Сибири и Дальнего Востока, посвященной 150-летию со дня рождения акад. И. П. Павлова (Томск, 1999 г.) — региональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы офтальмоэндокрино-логии и сосудистой патологии глаз» (Красноярск, 1999 г.) — научнопрактической конференции «Актуальные вопросы диабетологии» (Томск, 1999 г.) — Международной научной конференции The Association for Research in Vision and Ophthalmology (Florida, USA, 2000) — I, III, IV, V Международном конгрессе молодых ученых «Науки о человеке» (Томск, 2000 г., 2002 г., 2003 г., 2004 г.) — II Всероссийском симпозиуме «Хроническое воспаление» (Новосибирск, 2000 г.) — I и II Международной научно-практической конференции «Пролиферативный синдром в офтальмологии» (Москва, 2000 г., 2002 г.) — Восточно-Сибирской региональной конференции «Патогенетически обоснованные технологии профилактики, лечения и реабилитации в офтальмохирургии» (Иркутск, 2000 г.) — межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 20-летию Красноярского областного центра микрохирургии, «Вопросы офтальмологии» (Красноярск, 2001 г.) — 2-й Всероссийской конференции «Современные технологии лечения витреоретинальной патологии» (Москва, 2002 г.) — IV Съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 2002 г.) — юбилейной научно-практической конференции «Вопросы офтальмологии» (Омск, 2002 г.) — Всероссийской конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные и клинические аспекты» (Новосибирск, 2002 г.) — III научном семинаре «Биомеханика глаза» (Москва, 2002 г.) — межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы офтальмологии», посвященной 60-летию Кемеровской области (Кемерово, 2003 г.) — юбилейном научном симпозиуме «Актуальные проблемы офтальмологии», посвященном 30-летию образования ГУ НИИ глазных болезней РАМН (Москва, 2003 г.) — юбилейной научно-практической конференции «Боевые повреждения органа зрения», посвященной 185-летию основания первой в России кафедры офтальмологии (С.Петербург, 2003 г.) — межрегиональной конференции офтальмологов, посвященной 40-летию детской глазной службы Красноярского края (Красноярск, 2003 г.) — Всероссийской научно-практической конференции «Лечение посттравматической патологии заднего отрезка глаза у пострадавших в экстремальных ситуациях с применением приборов и медикаментов» (Москва, 2004 г.) — Всероссийской научно-практической конференции «Современные возможности в диагностике и лечении витреоретинальной патологии» (Москва, 2004 г.).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 52 работы, в том числе 9 в центральной печати, получено 2 патента РФ на изобретение.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 251 странице машинописного текста и состоит из введения, 6 глав собственных исследований, выводов, практических рекомендаций и библиографического списка литературы. Работа иллюстрирована 18 таблицами, 56 рисунками. Библиографический список включает 479 источников, из них 225 на русском языке и 254 на иностранных языках.

ВЫВОДЫ:

1. Периретинальные фиброваскулярные мембраны у больных с различной патологией в заднем отрезке глаза (диабетическая пролиферативная вит-реоретинопатияцентральная атеросклеротическая хориоретинопатия, далеко зашедшая стадиярегматогенная отслойка сетчатки, осложненная пролиферативной витреоретинопатией) характеризуются сходным морфологическим строением, что свидетельствует об общем патогенезе про-лиферативных изменений в полости глазного яблока.

2. Развитие экспериментальной пролиферативной витреоретинопатии, проявляющейся фиброваскулярной пролиферативной реакцией и тракцион-ной отслойкой сетчатки с последующей субатрофией глазного яблока, индуцируется интравитреальным введением мононуклеарных клеток крови.

3. На фоне экспериментального сахарного диабета мононуклеары крови способствуют резкому прогрессированию некроза нейросенсорных клеток с очаговым выпадением соответствующих слоев сетчатки и разрастанием радиальной глии. При этом отмечается увеличение скорости и амплитуды пролиферативных изменений в полости глазного яблока, формирование массивных фиброзных шварт, тракционная отслойка сетчатки, интенсивный неоваскулогенез.

4. Культивирование in vitro мононуклеаров периферической крови человека в условиях направленного движения питательной среды, моделирующих движение внутриглазной жидкости, вызывает последовательное повышение внутриклеточной ферментативной активности и ускорение (по сравнению со стационарной культурой) процесса дифференцировки моноцитов в макрофагальные клетки.

5. При проточном культивировании in vitro мононуклеаров периферической крови человека, в отличие от стационарной культуры, выявлены клетки, цитохимический профиль которых соответствует молодым элементам фибробластической популяции. При этом молодые стромальные клетки быстро, в течение 3 суток, дифференцируются в зрелые формы, синтезирующие коллаген.

6. Системный анализ механизмов пролиферативной витреоретинопатии указывает на формирование в полости глазного яблока сложной системы, главным патогенетическим фактором которой являются мигрирующие из крови мононуклеарные элементы (моноциты, фибробластоподобные клетки), способные инициировать и усиливать развитие фиброваскуляр-ной ткани.

Практические рекомендации.

1. С целью ограничения миграции мононуклеаров крови в полость глазного яблока и уменьшения их негативного влияния на витреоретинальные структуры у больных с различной патологией заднего отрезка глаза, патогенетически обоснованно назначение ангиопротекторов, антиоксидантов и противовоспалительных средств.

2. При кровоизлияниях в стекловидное тело необходимо проведение своевременной, по возможности, ранней, трансцилиарной витрэктомии.

3. При появлении эпиретинальной пролиферативной ткани на начальной стадии развития ПВР целесообразно интравитреальное введение коллагеноли-тических препаратов с последующей витрэктомией и удалением пролифератив-ных мембран.

4. Вариант клеточной терапии заболеваний с местным введением синген-ных мононуклеарных лейкоцитов может иметь негативные последствия, связанные с инициацией и ускорением фиброваскулярных пролиферативных реакций.