Модифицированные производные нуклеиновых кислот, содержащие 1, 2-диольные, альдегидные и гидразидные группировки. 
Синтез и свойства

6. выводы.

1. С использованием З'-амидофосфита 2'-0-[2-(2,3-диацетоксипропил)амино-2-оксоэтил]-5'-0-(4,4'-диметокситритил)-#3-пивалоилоксиметилуридина впервые синтезированы модифицированные олигорибонуклеотиды, содержащие в 2'-положении углеводного фрагмента 1,2-диольные и альдегидные группировки.

2. Показано, что встраивание в олигонуклеотидную цепь модифицированных остатков уридина, содержащих 1,2-диольные группировки, существенно не влияет на термическую стабильность ДНК-, РНКи гибридных дуплексов.

3. Данные, полученные при проведении кросс-линкинга в присутствии ДНК-конкурентов, показывают, что реакция 2'-оксоэтильных и 2'-диоксоазапентильных дуплексов с метилтрансферазой ЗэоН носит неизбирательный характер, что свидетельствует о снижении специфичности узнавания на фоне параллельного протекания реакции между е-аминогруппой остатка лизина белка и альдегидной группировкой или о возможном наличии двухстадийного механизма узнавания белком ДНК-лиганда.

4. Ковалентное связывание 2'-диоксоазапентильных олигорибонуклеотидов с белком РНКазы Р носит неизбирательный характер, так как, по-видимому, быстрое протекание химической реакции препятствует специфическому взаимодействию белка с лигандом.

5. Предложен новый эффективный метод получения 2'-гидразидных производных ДНК и РНК. Показано, что 2'-гидразидные олигонуклеотиды могут быть успешно применены для конъюгации с различными ароматическими и алифатическими альдегидами.

4.8.

Заключение

.

В настоящей работе продемонстрирована возможность использования альдегидных и гидразидных производных нуклеиновых кислот для получения конъюгатов с различными низкомолекулярными соединениями и белками. В рамках исследования свойств альдегидных производных РНК была предложена оригинальная методика для встраивания коротких олигорибонуклеотидов в протяженную молекулу РНК, что позволяет вводить в состав нуклеиновой кислоты разнообразные функциональные группировки. Такие протяженные.

РНК, содержащие химически активные или репортерные группы, могут быть применены для решения различных задач молекулярной биологии и химии нуклеиновых кислот.

5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Реактивы: 5-этилтио-Ш-тетразол (Glen Research, США) — дигидразид янтарной кислоты (Lancaster, Великобритания) — S-аденозил-Ь-метионин (AdoMet), предварительно прокрашенные маркеры молекулярных масс белков 20−120 кДа (SM0441) и 10−170 кДа (SM0671), маркер молекулярной массы белков 10−200 кДа (SM0661), буфер для Т4 ДНК-лигазы, дитиотреит (ДТТ), бычий сывороточный альбумин (БСА) (Fermentas, Thermo Fisher Scientific, Литва) — poly (dl-dC) (Midland Certified Reagent Company, США) — хлорометилпивалат (PomCl), гидросульфат тетрабутиламмония (TBAHS), бензилбромоацетат, 4,4-диметиламинопиридин (DMAP), тригидрофторид триэтиламина (Aldrich, США) — этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), трис (гидроксиметил)аминометан (Трис) (Amresco, США) — хлорид магния, ß—меркаптоэтанол, ацетат натрия, ацетат аммония, перхлорат лития, периодат натрия, цианборгидрид натрия, формамид, метиламин, 3-амино-1,2-пропандиол, 1,3-дихлор-1,1,3,3-тетраизопропилдисилоксан, wpem-бутилимино-отрмс (пирролидино)фосфоран (ВТРР), бмс (МА^-диизопропиламино)-2-цианэтоксифосфин, 4,4'-диметокситритил хлорид (DMTrCl), триэтиламин, (Fluka, Швейцария) — 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфокислота (HEPES), спермин, спермидин, хлорид натрия, додецилсульфат натрия (ДСН), Tween 20 (Sigma, США) — глицерин (Serva, Германия) — красители-маркеры бромфеноловый синий, ксиленцианол (Reanal, Венгрия) — [у-32Р]-АТФ (Изотоп, Россия).

2-Гидрокси-1 -нафтальдегид, антрацен-9-карбальдегид, 4-диметиламинокоричный альдегид, 3-(4-трет-бутилфенил)пропаналь, 4-гидрокси-З-метоксибензальдегид были любезно предоставлены научным сотрудником Химического факультета МГУ Волковым Е. М. Перилен-3-карбальдегид и пирен-1-карбальдегид были любезно предоставлены научными сотрудниками Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Коршуном В. А. и Прохоренко И.А.

Ферменты и белки. Рекомбинантные формы ДНК-метилтрансферазы SsoII и эндонуклеазы рестрикции SsoII, содержащие 6 остатков гистидина на N-конце белковой молекулы, выделены из культуры клеток Е. coli методом аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе. Концентрация белка в препаратах составляла 8 пмоль/мкл (R.SsoII) и 40 пмоль/мкл (M.SsoII).

Рекомбинантный белок В. subtilis рибонуклеазы Р, содержащий 6 остатков гистидина на iV-конце белковой молекулы, выделен из культуры клеток Е. coli JM109. Экспрессию, выделение и очистку белка проводили по стандартным методикам с использованием Ni-NTA-агарозы [245, 246]. Концентрация его составила 105 пмоль/мкл.

Полинуклеотидкиназа фага Т4, ингибитор РНКаз RiboLock™ RNase Inhibitor, Т4 ДНК-лигаза — коммерческие препараты производства Fermentas.

Буферные растворы:

Al: 5% ацетонитрил, 48 мМ калий-фосфатный буфер, содержащий 2 мМ дигидрофосфат тетрабутиламмония, рН 7.0;

Б1: 40% ацетонитрил, 48 мМ калий-фосфатный буфер, содержащий 2 мМ дигидрофосфат тетрабутиламмония, рН 7.0;

А2: 0.1 М ацетат аммония, рН 7.0;

Б2: 0.1 М ацетат аммония, 50% ацетонитрил, рН 7.0;

В: 0.4 М ацетат натрия, рН 4.0−4.5;

Г: 50 мМ Трис-НС1, 150 мМ NaCl, рН 7.5;

Д: 10 мМ Трис-НС1, 10 мМ MgCl2, 0.05% глицерин, 0.01% Tween 20, 1/10 000 (v/v) флуоресцентного красителя SYBR Green I;

Е: 50 мМ Трис-НС1, 10 мМ MgCl2, 5 мМ ДТТ, рН 7.6;

Ж: 50 мМ Трис-НС1, 10 мМ MgCl2, 50 мМ NaCl, 50 мМ ДТТ, рН 7.6;

3: 50 мМ Трис-НС1, 150 мМ NaCl, 5 мМ Р-меркаптоэтанол, рН 7.6;

И: 50 мМ Трис-НС1, 150 мМ NaCl, 5 мМ Р-меркаптоэтанол, 0.5 мкг poly (dl'dC), рН 7.5;

К: 50 мМ Трис, 50 мМ Н3В03, 1 мМ ЭДТА, рН 8.3;

JI: 50 мМ Трис-НС1, 2% глицерин, 1% ДСН, 0.05%> Р-меркаптоэтанол, 0.1% бромфеноловый синий, рН 6.8;

М: 20 мМ HEPES-KOH, 150 мМ NH4OAc, 2 мМ спермидин, 0.05 мМ спермин, 4.5 мМ MgCl2, 4 мМ Р-меркаптоэтанол, рН 7.4;

Н: 50 мМ HEPES-KOH, 150 мМ NH4OAc, 4.5 мМ MgCl2, 4 мМ p-меркаптоэтанол, рН 7.4- О: 25 мМ Трис-НС1, 6% глицерин, 1% ДСН, 1% р-меркаптоэтанол, 0.01% бромфеноловый синий, рН 6.8.

Растворы:

Р1: концентрированный водный аммиак и этанол, 3:1 (v/v);

Р2: концентрированный водный аммиак и 40% водный метиламин, 1:1 (v/v);

РЗ: 66% формамид, 2.6 M мочевина, 2Х буфер К, 0.02% бромфеноловый синий и ксиленцианол.

Спектры ЯМР! Н, 13С и 31Р регистрировали на приборах Bruker DRX-500, АМ-300, WM-250 (500.13, 300.13 МГц для! Н- 75.47, 62.90 МГц для 13С- 121.50 МГц для 31Р) в CDC13, используя примесь СНС13 как внутренний стандарт. При расшифровке 2D спектров использовали COSYи HSQC-методики, адаптированные для данного прибора. Химические.

1 1 'Я сдвиги (м.д., погрешность 0.01 м.д.) приведены относительно (CHa^Si (H, С) и 85%-ного.

5 1 водного раствора Н3РО4 (Р). Указаны константы спин-спинового взаимодействия (./, Гц, погрешность 0.5 Гц). Масс-спектры MALDI-TOF регистрировали на приборах Voyager DE Biospectrometry Workstation (PerSeptive Biosystems) и Bruker Microflex (Bruker Daltonics). Для олигонуклеотидов в качестве матрицы использовали смесь 3-гидроксипиколиновой кислоты и двухосновного цитрата аммония. Перед нанесением образцы обрабатывали катионно-обменной смолой в аммониевой форме для удаления примесей щелочных и щелочноземельных металлов. Для низкомолекулярных веществ в качестве матрицы применяли растворы 2,5-дигидроксибензойной кислоты (2,5-DHBA) (10 мг-мл" 1 в метаноле) или 2,4,6-тригидроксиацетофенона (2,4,6-ТНАР) (10 мг-мл" 1 в 50%-ном водном ацетонитриле). Тонкослойную хроматографию (ТСХ) осуществляли на алюминиевых пластинках Kieselgel 60 F254 (Merck). Вещества, поглощающие в УФ-области, обнаруживали при облучении УФ-светом с длиной волны 254 нм в виде темных пятен на флуоресцирующем поле. Соединения, содержащие диметокситритильную группу, идентифицировали при обработке хроматографической пластинки парами трифторуксусной кислоты. Колоночную хроматографию проводили на силикагеле 60 (BDH).

Синтез 3−1111валоилоксн1иетил-2,-0-[2-(2,3-диацетокси11ронил)амино-2-оксоэтил]-3'-0-(Л^У-д11и:т11ро1П1лам1шо-2-цна11этокс11фосф|!1Шл)-5'-0-(4,4'-диметокснтри'1и:|)ур11Д11на.

Уридин 5.1 {4.88 г. 20 ммоль) высушивали переупариванием в вакууме с абсолютным пиридином (ЗхЗО мл), растворяли в 100 мл абсолютного пиридина и добавляли при перемешивании и охлаждении на ледяной бане 1,3-дихлор-1 J, 3,3-тетраизопропилдисилоксан (6.72 мл, 21 ммоль}. Реакционную смесь перемешивали на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 12−18 часов. Полноту прохождения реакции контролировали методом ТСХ (СНС'Ь/ЕЮН 95:5, v/v). После полного исчезновения исходного вещества в реакционную смесь добавляли 3 мл метанола. Реакционную смесь упаривали до масла, растворяли в 150 мл этилацетата и промывали 5%-пым раствором NaHCO^ (2×150 мл). Объединенные органические вытяжки высушивали над безводным Na^SO^. Осушитель отфильтровывали, реакционную смесь концентрировали до масла в вакууме. Остаток переупаривали с толуолом (3Х30 мл), хлороформом (3Х30 мл) и хроматографировалн па колонке с силикагелем. Элюировали градиентом EtOAc в Ci 1С13.

0—10⁴⁰%, v/v). Выход 5.2 в виде белой пены 9.05 г (93%). Rr 0.45 (CHCb/EtOH 95:5, v/v). !Т-ЯМР (CDCb, S, м. д): 163.24 (C4) — 150.03 (C2) — 139.98 (C6) — 101.95 (C5) — 90.99 (СГ) — 81.98 (C41) — 75.17 (C2') — 69.07 (C3') — 60.38 (C5') — 17.44−16.83 (CH (CH3)2) — 13.41. 13.12, 12.96, 12.56.

4.1b) 1182].

3', 5'-0-(Тсграизопропилд1!склоксаН" 1,3-диил)уридин (5.2).

CM (CH02).

3-Т1ивалоилоксиметил-3,5,-0-('гсграи:1011ропилдиси:ткса11−1,3-дипл)урилии (5.3).

О О О.

Соединение 5.2 (9.05 г, 18.6 ммоль) растворяли в смеси хлористого метилена (150 мл) и 0.2 М раствора карбоната натрия (300 мл), затем при сильном перемешивании добавляли хлормегиловый эфир пивали новой кислоты (26.8 мл, 186 ммоль) и гидросульфат тетрабутиламмония (1.26 г, 3.72 ммоль). Реакционную смесь оставляли при сильном перемешивании на 48 часов при комнатной температуре (ТСХ в СНСЬ/ЕЮИ 98:2. у-/у). после чего отделяли органическую фазу и промывали ее 5%-ным раствором К’аНСО* (2*150 мл). Объединенные органические вытяжки высушивали над безводным N33804. Осушитель отфильтровывали, реакционную смесь концентрировали в вакууме, переупаривали с бензолом (Зх50 мл) и хроматографировали на колонке с силикагелем. Элюировали градиентом ЕЮАс в бензоле (0—>2—>4~-«6—^>8—>10%, vlv). Выход соединения 5.3 в виде белой немы 8.41 г (70%). Щ 0.34 (СНС13/ЕЮН 96:4, уН). Спектр ЯМР 'н (С1)С1>, 5, м.д. .//Гц): 7.82 (д, 1 Н, Н6, Л6 = 8.0) — 5.95 (с, 2 Н, СЬЬОСОВп1) — 5.82 (д, 1 Н, Н5) — 5.75 (каж. т, 1 Н, НГ) — 4.33 (уш. с, 2 Н, Н2 ИЗ') — 4.15 (м, 1 Н, Н4') — 3.98 (д, 1 Н, На5',.7?Х5Ъ= 12.0) — 3.82 (д, 1 И, Нй|') — 1.20 (с, 9 Н, Ви') — [.10−0.80 (м, 28 Н, Рг1). Спектр ЯМР ВС (ШС13, 6, м.д.): 178.00 (С1ЬОСОВи1) — 161.75 (С4) — 151.50 (С2) — 140.02 (Об) — 101.85 <С5) — 92.58 (С'Г) — 85.33 (С4') — 74.97 (СТ) — 70.20 (СЗ') — 64.58 (СН2ОСОВн1) — 61.65 (С5'| 38.92 (С (СН3)3) — 27.01 (С (СН3)3) — 17.09 (СН (СН3)2) — 13.39−12.85 (СЫ (С113)2). Масс-спектр (МЛЫМ-ТОР, 2,5-ОЫВА), т/г: найдено 624.05, вычислено для [М+]^а]+ 623.84- найдено 641.77, вычислено для [М+К)+ 639.95.

3-Пнвало11локснметнл-2,-0-(2-бе1анлокси-2-оксоэтил)-3,5,-С>-(тетраизо11ро1]и-1-дисилоксан-1,3-диил)уридин (5.4).

Соединение 5.3 (8.41 г. 14 ммоль) высушили упариванием с абсолютным ацетон итрилом (3*50 мл), растворили в 300 мл смеси абсолютных ТГФ и ацетонитрила (1:1, v/v) и добавили бензилбромацетат (5.54 мл. 35 ммоль) и ВТРР (11.98 мл, 39.20 ммоль). Полноту прохождения реакции контролировали по ТСХ (CHCl3/EtOH 97:3, v/v). Реакционную смесь оставили на ночь, после чего концентрировали в вакууме, остаток (масло) упарили с бензолом (3×50 мл) и выделили целевой продукт колоночной хроматографией (градиент EtOAc в бензоле 0-^2—>4—>6%, v/v). Выход соединения 5.4 в виде бесцветной пены 9.54 г (91%). Af 0.31 (СНСЦ/ЕЮН 97:3, v/v). Спектр ЯМР *Н (CDCl3, O, м.д., .//Гц): 7.90 (д, 1 Н, Мб, J5, в = 8.0) — 7.407.30 (уш. с, 5 Н, Ph) — 5.97 (д, I Н, СНаНьОСОВи ./н, 1ш. = 9.5) — 5.91 (д, 1 Н, CI IajJbOCOBul) — 5.81 (уш. с, 1 Н, III') — 5.71 (д, 1 Н, Н5) — 5.21 (д, 1 Н, OCHaHbPh, /ца, 1! Ь — 12.5) — 5.18 (д, I Н, ОСЬЩьРЬ) — 4.61 (д, 1 Н, ОСНцНьСО, /Иа, нь = 16.5) — 4.48 (д, 1 Ы, ОСНдНьСО, /На, нь = 16.5) — 4.25 (д, 1 В, 1 la5% .h aSb = 13.3) — 4.22 (уш. с, 2 И. Н3 Н4') — 4. U5 (с, 1 Н. Н2')> 3.98 (д, 1 Н, Нь5') — 1.20 (с, 9 Н, Ви1) — 1.10−0.80 (м, 28 Н, Рг1). Спектр ЯМР l3C (CDC1-,. 5, м.д.): 177.36 (С1-ЬОСОВис) — 169.66 (ОСН3СО) — 161.61 (С4) — 149.97 (С2) — 138.36 (С6) — 135.42 (и-Ph) — 128.53, 128.35 (Ph) — 101.10 (С5) — 89.13 (СГ) — 82.46 (02^- 81.60 {С4') — 68.42 (С3|- 67.53 (ОСП, СО) — 66.56 (OCH2Ph): 64.48 (CI-bOCOBi/) — 59.36 (С5') — 38.82 (С (СН3)3) — 27.01 (С (СН3)3) — 17.42−16.76 (СН (СН3)2) — 13.46−12.37 (СН (С1 ЬЫМасс-спектр (MALDI-TOF, 2,4,6-ТНАР), т/г. найдено 750.17, вычислено для [М+Н]1 750.02- найдено 772.50. вычислено для [M-v-Na]+ 772.00- найдено 788.63, вычислено для [М+К]+ 788.1 Г.

3-П11вал"11локсиметил-2,'-С'-|2-(2,3-Д11ацетоксинропил)аминг>-2-оксоэтил)-3', 5'-6>-{тетраизт1р (шилднснлоксан-1,3-диил)уридин (5.6) О.

0 0 0 0 rvi AnftvАСг° ^ i mrfrf о о.

О N'.

А -—Ул ¦—1 DMAP, пиридин.

V6 o X o 'О Y?, %.

4 О^Y VNH ОН I %j-o 0.

5.4 О'^Ph I / 5.5 О' W Г У ~ Рт.

Х-0Н 1 / 5.6 о.

— О Ас.

К соединению 5.4 (1.3 г, 1.74 ммоль) добавляли расгвор 3 -ам и но-1,2-п pon ai i д иола (1.58 г, 17.3 ммоль) в абсолютном этаноле (25 мл). Реакционную смесь оставляли при перемешивании tia ночь при комнатной температуре, после чего упаривали до масла. Остаток (масло) растворяли в ЕЮ Ас (50 мл) и промывали водой (50 мл) и 20%-ным раствором NaCl (2×50 мл). Объединенные органические вытяжки высушивали над безводным «Na^SOj. Осушитель отфильтровывали, реакционную смесь концентрировали в вакууме. Остаток переупаривали с абсолютным пиридином (Зх20 мл) и растворяли в смеси абсолютных ТГФ (15 мл) и пиридина (0.7 мл, 8.65 ммоль). Затем добавляли уксусный ангидрид {0.82 мл, 8,65 ммоль) и каталитические количества DMA Р. Реакционную смесь перемешивали на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 5 часов, затем добавляли I мл метанола. Через 10 мин реакционную смесь упаривали до масла, растворяли в 50 мл этил ацетата и промывали водой (50 мл), 5%-ным раствором NaHCO^ (50 мл) и 20%-ным раствором NaCl (2*50 мл). Органическую фазу высушивали над безводным NaiSO^ Осушитель отфильтровывали, реакционную смесь концентрировали до масла в вакууме. Остаток переунаривали с бензолом (3×25 мл) и х ро м ато гр аф и р о в ал и на колонке с силикагелем. Элюировали градиентом СНСЬ в бензоле (0⁵^10-«20->30⁴⁰^50⁶⁰^75->100%, v/v). Выход соединения 5.6 в в-иде белой пены 1.24 г (87.4%). Rr 0.64 (СПС13/ЕЮН 98:2, v/v). Спектр ЯМР (CDCh, 8, м.д., .//Гц): 7.82 (дд, I К, Н6, Jy6 = 8.2) — 7.22 (дд, 1 Н, Wm = 13.0, 6.5, CONHCH2) — 5.96 (д, I Н, СН, НьОСОВиг, Ун*, нь = 8.8) — 5.90 (д, 1 Н, СЩЙСОВи, = 8−8) — 5.79 (уш. с, 1 II, ИГ) — 5.72 (д, 1 И, Н5. Лл = 8.2) — 5.18 (м. 1 П, СН (ОАс)СН2(ОАс)) — 4.35 (д, 1 Н, ОСЩ-1ьСО ./, а. ш = 16.5) — 4.30 (д, 1Н, ОСаИьСО./Иа.нь= 16.5) — 4.28 (м. 2 Н, На5 CH (OAc)CH:(OAc)) — 4.22 (дд, 1 Н. ИЗJr. y = 3.5,JyA =8.5) — 4.15 (м, 2 И, Н4 СН (ОАс)СН2(ОАс)) — 3.98 (д, 1 Н, Нь5 JHd. m = 13.0, JrSh = 2.3) — 3.86 (каж. г, 1 Н. i 12') — 3.63 (м, 1 И, CONIICIb) — 3.50 (м. I И, CONHOT) — 2.10, 2.07 (оба с, по 3 Н, СН3СО) — 1.20 (с. 9 Н, Bu') — 1.10−0.80 (м. 28 И, Рт1). Спектр ЯМР |3С.

СПСЬ. м. д-У- 177.24 (СРЬОСОВи1) — 170.61, 169.72 (СН5С=0) — 161.41 (С4) — 150.28 (С2) — 137.57 (С6): 101.44 (С5) — 89.43 (СГ) — 83.09 (С2') — 81.64 (С4') — 70.52 (С11(ОАс)СН2(ОАс)) — 70.32 (ОСН2СО) — 68.91 (СЗ') — 64.33 (СН2ОСОВиг) — 63.03 (СН (ОАс)СН2(ОАс)) — 59.12 (С5'| 39.38 (С (СП.Оз) — 38.91 (СОМИСРЬ) — 26.99 (С (СН3)3- 20.94, 20.72 (СН3СО) — 17.44, 17.37, 17.00. 16.86 (С:Н (?Нг)г) — 13.38. 13.02, 12.89, 12,71 (СН (С1 ШМасс-спектр (МАЬГХ-ТОР, 2.4.6-ТНАР), т!1 найдено 816,64. вычислено для [М+Н] 817.06- найдено 838.38, вычислено для [М+Ма]* 839.04- найдено 854.53, вычислено для [М+К]+ 855.15.

3-Пивалоилоксимегил-21−0-[2-(2,3-Диацетоксипропил)амиио-2-оксоэтил1уридин (5.7).

О О о о.

Соединение 5.6 (1.21 г, 1.48 ммоль) растворяли в абсолютном тетрагидрофуране (5 мл) и добавили при перемешивании 0.48 мл (2.96 ммоль) три гидрофторида триэтиламина. Реакцию ВШИ 1.5 ч при комнатной температуре. Полноту прохождения реакции контролировали по ТСХ (CHCIj/ElOII 97:3, v/v), после чего смесь разбавили EtOAc (50 мл) и промыли последовательно 5%-ным раствором МаНС03 (2×50 мл), водой (50 мл). 5%-ным раствором лимонной кислоты (2*50 мл) и 20%-ным раствором NaCl (50 мл). Органическую фазу высушили безводным Na2SC)4, осушитель отфильтровали, растворитель упарили, остаток (масло) упарили с СНСЦ (3×25 мл) и выделили целевой продукт колоночной хроматографией (градиент ЕЮН в СНС13 0->1-^2-^3-^4%, v/v). Выход соединения 5.7 0.81 г (95.3%). Rf 0.26 (CHCb/EtOH 92:8. v/v). Спектр ЯМР 'Н (CDC13, 6, м.д.,//Ец): 8.05 (дд, — 1 И, Н6, J5,6 = 8.3) — 7.40 (уш. с. 1 I I, CONHCH2). 5.96 (д, 1 Н, CJJ, I IbOCOKu /ца.Иь = 9.5) — 5.90 (д, 1 Н, СНаПьОСОВи', •/н,.нь = 9.5) — 5.85 (каж. т, 1 Н. НГ. J = 2.8) — 5.80 (д. 1 Н. П5, J5fi = 8.0), 5.10 (м. 1 II, СН (ОАс)С1 Ь (ОАс)) — 4.38 (д. 1 И. ОСНаНьСО. ,/ilaHb = |б.6) — 4.32 (м, 1 Н, ИЗ') — 4.30 (Д, I Н. ОСНаНьСО. УНа, нь = 16.6) — 4.25 (м, I Н, Н41) — 4.20 (м, I 11, CH (OAc)CLb (ОАс)) — 4.10 (м, 1 Н, СН (ОАс)СЬЬ (ОАс)) — 4.04 (д, 1 Н. Па5″, УНа. нь = 12.0): 4.02 (м, 1 Н, Н2') — 3.90 (д, I Н. Пъ5.

Л^.нъ= 12.0) — 3.6 (м, 1 НГСШНСЩ-ШШ (м, 5 Щ^ШШСЩ) — 3,25 (уш. с, I Н, ОН) — 2.10 (уш. с, 1 1, ОН) — 2.05 (м, 6 П, СНзСО): 1.20 (с. 9 Н. Ви1). Спектр ЯМР ПС (СОС13. 5. м.д.): 177.58 (СНтОСОВи1) — 171.13, 171.03 (СН3С=0) — 169.99 (ОСН2СО) — 161.66 (С4) — 150.47 (С2) — 139.29 (С6) — 101.62 (С5) — 89.39 (СГ) — 84.26, 83.84 (С2 С4') — 70.45 (СИ (ОЛс)СН2(ОЛе)): 69.91 (ОСН2СО) — 6Й.35 (СЭО- 64.48 (СН2ОСОВи') — 62.94 (СН (ОАс)СН2(ОАс)) — 60.53 (С5*) — 39.31 (СОЫНСН2): 38.87 (С (Ш3)3) — 27.00 (С (СН,)з) — 20.99, 20.75 (СН3СО). Масс-спектр (МЛШ1-ТОГ, 2,4,6-ТНАР), МШ найдено 574.75, вычислено для [М+Н]+ 574.55- найдено 591.44, вычислено для 596.54- найдено 612.28. ЦтчйсЖно для [М+К]~ 612.64.

3-Пива.'10илоксимет11л-21−0-[2-(2,3-диацетокс1111ронил)амино-2−01геотгил|-5'-0-(4,4'-диметокситритил)уридин (5.8).

О О.

— чX нсгЛэу РМТГС1 ^ рттг^Жу I пиридин / но 'о—ч на о.

-|1Н ОАс О Ас т М о.

5.7 «°АС 5.8 0Ас.

Соединение 5.7 (0.77 г, 1,34 ммоль) высушили упариванием с абсолютным пиридином (Зх25 мл), растворили в абсолютном пиридине (25 мл) и добавили при охлаждении на ледяной бане и перемешивании БМТгС1 (0.73 г, 2.14 ммоль). Полноту прохождения реакции контролировали по ТСХ (СПСЬ/ПЮН 95:5, у/у), после чего добавляли I мл ЕЮН. По истечении 10 мин реакционную смесь концентрировали в вакууме, остаток растворили в 50 мл СНСЬ и промыли 5%-ным раствором МаНСОз (2×50 мл) и 20%-ным раствором №С| (50 мл). Орган и ческу ¡-о фазу высушили безводным МарШ^ осушитель отфильтровали, растворитель упарили, остаток (масло) переупарили с толуолом (3×25 мл) и хроматограф и ро вал и на колонке с силикагелем (градиент СИСЬ в толуоле (О—>20—>25—>30—->50—" 100%) + 1% пиридина (у/у/у), потом 1% ЕЮН в СНС1*+ 1% пиридина, у/у/у). Выход соединения 5.8 0.99 г (84.3%). К, — 0.25 (СИСЦ/ЕЮН 98:2. у/у). Спектр ЯМР 'н (С1Х1з. 5, м.д.,.//Гц): 8.05 (дд, % II, П6. = 8.0): 7.40 (д, 2 11, о-РЬ,./ 7.8) — 7.30 (д, 2 Ы, о-Лп, ./ 8.5): 7.25 (м, 4 11, м, п-Щ СОМНС!12) — 6.80 (д, 2 Н,, и-Ап, .1 = 8.5) — 5.90 (м, 2 И, СНЮСОВи') — 5. Я5 (перекрывание, I Н. НГ) — 5.30 (д, I Н, Н5, = 8.0) — 5.10 (м, 1 II,.

CH (OAc)Cl lz (OAc)) — 4.50 (каж. к, 1 Н, Щ J= 6.5) — 4.42 (д. 1 ЕI, ОСНаПьСО, */№.нь = 15.8) — 4.36 (д. 1 Н, ОСВДьСО, J, ia, Mb * 15.8) — 4.25 (м, 1 Н, СН (ОЛс)СШОАс)) — 4.15 (м, 1 Н. CI 1(0Ас)С1 Ь (ОАс)): 4.10 (каж. к, 1 Н, Н4./= 6.5) — 3.90 (дд, 1 Н, Н2 ./,= 4.5. JY, y = 13.0) — 3.80 (с. 3 Н, ОСЩ- 3.70 (м, 1 Н. З'-ОН): 3.65 (м, 1 Н, CONHCPb) — 3.55 (м, 2 Н, Н5') — 3.40 (м, 1 Н, CONHCH2)-2.10 (с, 6 Н, СНзСО) — 1.20 (с, 9 Н, Bu1). Спектр ЯМР, 3С (CDClj, 5, м.д.): 177.80 (СН2ОСОВи') — 171.10, 171.00 (С1-Г, С=0) — 169.50 (ОСН2СО) — 161.45 (С4) — 158.82 (й-Ап) — 150.20 (С2) — 144.50 (w-Ph| 138.48 (С6) — 135.31, 135.11 (м-Лп) — 130.16 (о-Ап) — 128.17, 128.09 (, u, f?-Ph) — 127.26 (и-Ph) — 113.40 (л/-Ап) — 101.65 (С5) — 88.70 (С Г) — 87.10 (С (Аг)3) — 84.16 (С2') — 82.80 (С4) — 70.59 (СН (ОАс)СН2(0Ас)) — 69.96 (ОСН2СО) — 68.60 (Со') — 64.00 (СН (ОАс)СЬЬ (ОАс)) — 60.00 (С5-) — 55.30 (ОСН?) — 39.49 (СОМНСЬЬ) — 39.40 (С (СН3)э) — 27.05 (С (СН3)з) — 21.01, 20.77 (СН3СО). Масс-спектр (MALD1-TOF, 2,4.6-ТНАР), т/ж. найдено 899.21, вычислено для [M+Na]+ 898.9- найдено 915.16, вычислено для [M+KJ+915.01.

3-Пивалоилокс11метнл-21−0-[2-(2,3-диацегоксипропил)амипо-2-оксо')тил]-3'-(?-(Л, г^Аг-Д11изопропиламино-2-цианэтокснфосфинил)-5,-0-(4,4'-диметокситритил)уриднн (4.1 Ь).

CN.

Соединение 5.8 (0.95 г. 1.09 ммоль) высушили упариванием с абсолютным хлористым метиленом (3×20 мл) и растворили в абсолютном хлористом метилене (10 мл). К раствору добавили тетразолйд диизопропиламмония (0.28 г, 1.63 ммоль) и бг/с (^, Лг-диизопропиламино)-2-ци:иотоксифосфин (0.45 мл, 1.42 ммоль), после чего реакционную смесь оставили при перемешивании на ночь. По окончании реакции (ТСХ в ПЮАс/гексан 2:1 # 1% триэтиламина. v/v/r) реакционную смссь упарили, разбавили 50 мл EtOAc и промыли 5%-ным раствором ШНСОз (100 мл) и 20%-пым раствором NaCl (100 мл). Органическую фазу высушили безводным Na2SO). Осушитель отфильтровали, растворитель упарили, остаток высушили до пенообразного состояния, затем залили гексаном и выдержали 18−24 ч при -20°С. Растворитель декантировали, продукт далее высушили в вакууме. Выход соединения 4.1Ь в виде белой пены 1.09 г (93.1%). Rf 0.27 (CHCl3/Et3N 99:1, v/v). Спектр ЯМР 'Н (CDC13, 5, м.д., //Гц): 8.04, 8.01 (оба д, перекрывание, по 1 Н, Н6) — 7.45−7.16 (м, 18 Н, Ph, о-Ап) — 6.84 (м, 8 Н, ж-Ап) — 5.95 (с, 2 Н, СНгОСОВи1) — 5.91 (уш. с, 4 Н, СНгОСОВи1 и 2 HI') — 5.36 (д, 1 Н, Н5, J5,6 = 8.8) — 5.28 (д, 1 Н, Н5, J5, б = 8.1) — 5.20, 5.12 (оба м, по 1 Н, СН (ОАс)СН2(ОАс)) — 4.57 (м, 2 Н, НЗ') — 4.45 (д, 1 Н, OCHaHbCO, JHa, нь =15.8) — 4.35 (d, 1 Н, ОСНаИьСО, ./На, нь =15.8) — 4.35−4.06 (м, 12 Н, Н4', СН (ОАс)СН2(ОАс), ОСНгСО, NCH (CH3)2) — 3.93−3.37 (м, 14 Н, Н2 Н5 CONHCH2, OCH2CH2CN) — 3.81 (с, 12 Н, ОСЩ- 2.80−2.40 (м, 4 Н, OCH2CH2CN) — 2.07 (с, 12 Н, СН3СО) — 1.20 (с, 18 Н, Ви') — 1.29, 1.15, 1.03 (три д, 6 Н, 12 Н, 6 Н, соответственно, NCH (CH3)2). Спектр ЯМР 13С (CDCI3, 8, м.д.): 177.32 (СН2ОСОВи') — 170.57, 170.42, 170.28, 169.80, 169.10 (СН3С=0, ОСН2СО) — 161.54 (С4) — 158.75 (п-An) — 150.45 (С2) — 144.20, 144.12 (w-Ph) — 138.29, 138.21 (С6) — 135.16, 135.09, 134.95 (и-Ап) — 130.26, 130.22 (о-Ап) — 128.27, 127.97 (o^t-Ph) — 127.19 (я-Ph) — 113.27 (ж-An) — 101.73, 101.66 (С5) — 89.80, 88.90 (С1') — 87.08 (С (Аг)3) — 82.80, 82.20, 81.65, 81.47 (С2', С4') — 71.08, 70.90, 70.34, 70.24, 69.95, 69.80 (СН (ОАс)СН2(ОАс), СН2СО, СЗ') — 64.55 (СН (ОАс)СН2(ОАс)) — 62.97, 62.89 (С5') — 58.14, 57.86 (СН (СН3)2) — 55.25 (ОСНз) — 43.40, 43.20 (OCH2CH2CN) — 39.23, 39.08, 38.93, 38.83 (С (СН3)3, CONHCH2) — 27.02 (С (СН3)3) — 24.67, 24.59 (OCH2CH2CN) — 22.92, 20.93, 20.72, 20.49, 20.38, 20.29 (СН (СН3)2, СН3СО). Спектр ЯМР 31Р (CDC13, 5, м.д.): 153.695, 151.351. Масс-спектр (MALDI-TOF, 2,4,6-ТНАР), m/z: найдено 1077.48, вычислено для [М+Н]+ 1077.14.

Синтез модифицированных олигодезоксирибонуклеотидов и олигорибонуклеотидов осуществляли на автоматическом синтезаторе ABI 394 (Applied Biosystems, США) по стандартному регламенту с использованием коммерческих реагентов и растворителей. В качестве полимерного носителя применяли стекло с определенным размером пор (LCAA-CPG-500, LCAA-CPG-1000). Удельная загрузка полимера первым нуклеозидным звеном составляла 37−60 мкмоль-г" 1. З'-Амидофосфиты 2'-дезоксинуклеозидов и 2'-0-(трет-бутилдиметилсилил)рибонуклеозидов использовали в виде 0.1 М растворов в абсолютном ацетонитриле. Концентрация З'-амидофосфита модифицированного нуклеозида в ацетонитриле составляла 0.2−0.5 М. Время конденсации для модифицированных мономеров увеличивали до 30−60 мин. Степень превращения на этой стадии была несколько ниже, чем для З'-амидофосфитов 2'-дезоксинуклеозидов и 2'-рибонуклеозидов, и составила не менее 95−97%.

Деблокирование олигодезоксирибонуклеотидов. После завершения твердофазного синтеза олигонуклеотиды обрабатывали концентрированным водным раствором аммиака в течение 12−18 ч при 55 °C. Далее отбирали аммиачный раствор, промывали полимерный носитель водой (2×100 мкл), объединяли вытяжки и упаривали аммиак. Затем проводили высаживание олигонуклетидов 2 М водным раствором перхлората лития (150 мкл) и ацетоном (1 мл) в течение 5 мин при -20°С.

Деблокирование олигорибонуклеотидов. После завершения твердофазного синтеза олигонуклеотиды обрабатывали 400 мкл раствора Р1 в течение 4−17 ч при комнатной температуре (методика «UltraMild») или 1.5 мл раствора Р2 в течение 40 мин при 65 °C (методика «UltraFast»). После отбирали раствор и промывали полимер водой (2×100 мкл), объедиенные вытяжки концентрировали в вакууме. Осадок растворяли в 100 мкл ДМСО, добавляли 125 мкл Et3N*3HF и выдерживали в течение 2.5 ч при 65 °C. Объем доводили водой до 1 мл и проводили высаживание н-бутанолом (20 мл) в течение 16 ч при -20°С. Анализ и выделение олигонуклеотидов. Реакционные смеси, полученные после олигонуклеотидного синтеза, анализировали методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в ион-парном варианте на хроматографе фирмы «Waters» (США) с шагом элюции 0.5 или 1 нукпеотидное звено в минуту. Использовали колонку 4.6×250 мм с сорбентом Luna С-18(2) Phenomenex (размер частиц 5 мкм). Условия аналитического разделения: температура колонки — 45°Сэлюент: буфер Alбуфер Б1- логарифмический градиент концентрации ацетонитриларасход элюента 1 мл-мин" 1.

Выделение целевых продуктов проводили методом электрофореза в 10%- или 20%-ном ПААГ в присутствии 7 М мочевины. Контроль чистоты олигонуклеотидов осуществляли методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в ион-парном варианте. Выделенные олигонуклеотиды обессоливали методом ультрафильтрации с использованием микроконцентраторов Микрокон-3 (Millipore Inc, США).

Олигонуклеотиды, содержащие остатки 2'-0-(2,3-дигидроксипропил)уридина, были синтезированы научным сотрудником Химического факультета МГУ Зацепиным Т. С. Элюирование олигонуклеотидов из геля. Олигодезоксирибонуклеотиды выделяли из геля 2 М водным раствором перхлората лития в течение 14 ч при комнатной температуре, затем осаждали ацетоном. Осадок центрифугировали, промывали ацетоном, высушивали и растворяли в воде. Олигорибонуклеотиды выделяли из геля 1 М раствором ацетата натрия pH 5.0) в течение 14 ч при 10 °C. Олигонуклеотиды осаждали спиртом. Осадок центрифугировали, промывали спиртом, высушивали и растворяли в воде. Синтез 2'-гидразидных олигодезоксии олигорибонуклеотидов. К олигонуклеотиду (I, IV, V, XIV-XVI, XVIII) (1−3 ОЕ А26о) добавляли 10 мкл воды, 10 мкл буфера В и 10 мкл 0.23 М NaI04. Реакционную смесь инкубировали в течение 1 ч при 25 °C. Затем добавляли 15 мкл 10%-ного этиленгликоля и выдерживали 30 мин при 25 °C. Далее олигонуклеотидный материал высаживали 4 М NaOAc (9 мкл) и спиртом (1 мл). К осадку добавляли раствор дигидразида янтарной кислоты (50−100 нмоль) в смеси буфера В и ДМСО (1:1, v/v, 50 мкл). Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 15 ч. Затем добавляли цианборгидрид натрия (~1 мг), инкубировали 30 мин, добавляли 4 М раствор ацетата натрия (20 мкл) и этанол (1.5 мл) и проводили высаживание. Реакционную смесь анализировали с использованием обращенно-фазовой ВЭЖХ в ион-парном варианте и масс-спектрометрии (MALDI-TOF).

Спектры поглощения водных растворов олигонуклеотидов в УФ-области записывали на спектрофотометре Сагу Eclipse (Varian, США). Концентрацию нуклеотидного материала определяли спектрофотометрически по формуле Бугера-Ламберта-Бера: С — А2бо/?2бо'1, где С — концентрация нуклеотидного материала (М), А2бо — оптическая плотность раствора при 260 нм, 8260 — молярный коэффициент экстинкции при 260 им (М" 'см1), 1 — длина оптического пути (см). Молярные коэффициенты экстинкции (s26o) олигонуклеотидов рассчитывали с помощью программы OligoAnalyzer 3.1 (SciTools, www.idtdna.com).

Термическую стабильность дуплексов А, В и Е-Н изучали путем регистрации УФ-поглощения образца в зависимости от температуры на спектрофотометре U-2800A Hitachi (Япония) с температурным регулятором SPR-10. Измерения проводили в буфере Г с предварительным отжигом образцов. Использовали термостатируемые кварцевые кюветы Hellma (ФРЕ) с длиной оптического пути 1 см. УФ-поглощение фиксировали при длине волны 260 нм, соблюдая следующий температурный режим: термостатирование при 25 °C -15 мин, нагрев от 25 °C до 85 °C — 120 мин. Концентрация НК-дуплексов составляла 1 мкМ. Еипохромию комплексообразования определяли по уравнению h26o = ((Амакс — Амин)/АмаКс) ' 100%, где Амакс и Амин — оптическая плотность раствора при максимальной и минимальной температурах соответственно (к = 260 нм). Термическую устойчивость дуплексов С и D изучали по изменению интенсивности флуоресценции красителя SYBR Green I в зависимости от температуры. Изменение флуоресценции регистрировали на приборе для проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени (Синтол, Россия) при непрерывном повышении температуры со скоростью 0.5°С/мин. Исследования проводили в 40 мкл буфера Д. Концентрация ДНК-дуплексов составляла 1.88 мМ.

Спектры кругового дихроизма двуспиральных НК регистрировали на дихрографе Applied Photophysics Chirascan (Англия), оснащенном термостатированным кюветным отделением и системой сбора данных с использованием программы Graf Work v.l.04.05. Измерения проводили в интервале длин волн 220−330 нм в кварцевых кюветах фирмы Hellma (Германия) с длиной оптического пути 1 см при 23 °C в буфере Г. Результаты КД, которые являются усредненными данными трёх независимых экспериментов, были скорректированы путем вычитания базовой линии, соответствующей спектру буферного раствора, и выражены в виде молярного кругового дихроизма As (в расчете на мононуклеотидное звено): As= sl — sr=AlAr /С1, где 8l и sr молярные коэффициенты экстинкции, a AL и Ar — оптическое поглощение лево (Ь) — и право (11)-поляризованного светаС — концентрация-олигонуклеотидов, моль/л (в расчете на мономерное звено) — 1 — длина оптического пути, см.

Введение

32Р-метки в олигонуклеотиды. Для получения 5'-[32Р]-меченного производного.

32 олигодезоксиили олигорибонуклеотид инкубировали с Т4-полинуклеотидкиназой и [уР]-АТФ в 10 мкл буфера Е в течение 30 мин при 37 °C. Меченые олигонуклеотиды очищали методом гель-фильтрации на колонках G-25 Illustra MicroSpin™ (GE Healthcare, США). Радиоактивность Р-меченных препаратов определяли методом счёта по Черенкову в импульсах в минуту на счетчике Delta 300 (Tracor, Нидерланды). Ошибка счёта не превышала 2%.

Определение начальной скорости гидролиза ДНК-субстрата эндонуклеазой рестрикции SsoII (R.SsoII). ДНК-дуплексы А, В и I (2.5 нМ), содержащие 32Р-метку в верхней цепи, инкубировали с R. SsoII (1 нМ) в 100 мкл буфера Ж при 37 °C. Через определенные промежутки времени из реакционной смеси отбирали аликвоты (10 мкл). Время инкубации варьировали от 0.25 до 12 мин. Реакцию останавливали добавлением 80% формамида. Продукты гидролиза анализировали методом электрофореза в 20%-ном ПААГ, содержащем 7 M мочевину. Визуализацию радиоактивных полос в геле и обсчет данных проводили на приборе Molecular Dynamics Phosphorlmager SI (Molecular Dynamics), используя компьютерную программу Image Qantum, версия 5.0. Степень гидролиза дуплексов R. SsoII определяли как отношение радиоактивности продукта к суммарной радиоактивности продукта и нерасщепленного субстрата, умноженное на 100%. Начальные скорости гидролиза (vo) ДНК-дуплексов А, В, I R. SsoII рассчитывали как угловой коэффициент тангенс угла наклона) начального прямолинейного участка кинетической кривой. Угловой коэффициент прямой определяли графически. Относительные vo определяли как отношение начальных скоростей гидролиза модифицированного ДНК-дуплекса к v0 соответствующего немодифицированного субстрата. Измерения проводили не менее трех раз, в дальнейших расчётах использовали среднее значение. Воспроизводимость результатов измерений характеризует средняя относительная погрешность, не превышающая 20%. Определение эффективности метилирования ДНК-дуплексов метилтрансферазой SsoII. Эффективность метилирования ДНК-дуплекса M. SsoII оценивали по степени «защиты» субстрата от гидролиза R.SsoII. 0.35 мкМ ДНК-дуплексов А, В и I, содержащих 32Р-метку, инкубировали с M. SsoII (89 нМ) в буфере 3, содержащем 0.1 мМ AdoMet, от 0.5 до 20 мин при 37 °C. После реакции с метилтрансферазой реакционную смесь выдерживали 10 мин при 65 °C для инактивации фермента, затем медленно охлаждали до 25 °C. К реакционной смеси добавляли MgCl2 до конечной концентрации 10 мМ и инкубировали с R. SsoII (4.8 мкМ) в течение 1 ч при 37 °C. Затем реакционную смесь выдерживали 3 мин при 90 °C для инактивации фермента. Продукты реакции анализировали, как описано выше. Комплексообразование M. SsoII с ДНК-дуплексами, содержащими остатки 2'-0-[2-(2,3-дигидроксипропил)амино-2-оксоэтил]уридина и 2'-0-(2,3-дигидроксипропил)уридина методом «торможения» в геле. 5'-32Р-меченные ДНК-дуплексы С, D, J, К или олигонуклеотиды Dl, J1 (50−400 нМ) инкубировали с 2.6−5.2 мкМ M. SsoII в 10 мкл буфера И, содержащего 10% глицерина, в течение 30 мин при 37 °C. Реакционные смеси анализировали в неденатурирующем 7%-ном ПААГ в буфере К. Пробы наносили на гель в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 10−20% глицерина. Визуализацию радиоактивных полос в геле и обсчет данных проводили на приборе Molecular Dynamics Phosphorlmager SI (Molecular Dynamics), используя компьютерную программу Image Qantum, версия 5.0. Степень связывания M. SsoII с ДНК-дуплексами и олигонуклеотидами рассчитывали как отношение радиоактивности зоны, соответствующей ДНК-белковому комплексу, к сумме радиоактивности зон, соответствующих ДНК-белковому комплексу и несвязавшейся ДНК. Получение ДНК-дуплексов, содержащих остатки 2'-6Ц2,5-диоксо-3-азапентил)уридина и 2 '-0-(2-оксоэтил)уридина. 10 пмоль 5'-32Р-меченного олигонуклеотида, содержащего 1,2-диольную группу, растворяли в 15 мкл буфера В. К раствору добавляли 15 мкл 0.23 М NaI04, реакционную смесь инкубировали 30 мин при 25 °C. Затем добавляли 6 мкл 4 М ацетата натрия, олигонуклеотидный материал высаживали 200-кратным избытком спирта и сушили при 37 °C. К модифицированному олигонуклеотиду добавляли комплементарную матрицу (10 пмоль) и проводили «отжиг» от 80 °C в 20 мкл воды.

Ковалентное связывание ДНК-дуплексов, содержащих 2'-альдегидную группировку, с ДНК-метилтранеферазой БвоП. 5'-32Р-меченные ДНК-дуплексы Ь-О или модифицированные олигонуклеотиды М1, N1 (0.5 пмоль) инкубировали с 50 пмоль М^оН в 10 мкл буфера И в течение 30 мин при 37 °C. В некоторых случаях в реакционные смеси добавляли 1 мМ дитиотреит для стабилизации третичной структуры белка. Затем к реакционной смеси добавляли 275 мМ КаВНзСИ до конечной концентрации 50 мМ и выдерживали 1 ч при 37 °C. Продукты реакций разделяли электрофорезом по Лэммли [247] в 12%-ном ДСН-ПААГ с 4%-ной концентрирующей полосой. Перед нанесением на гель реакционные смеси выдерживали 5 мин при 95 °C в денатурирующем буфере Л для разрушения нековалентных комплексов ДНК-белок. В некоторые реакционные смеси кроме буфера Л добавляли 8 М мочевину для денатурации ДНК-дуплексов и выдерживали 10 мин при 95 °C. Положение 5'-32Р-меченных соединений определяли радиоавтографически. Выходы продуктов ковалентного связывания рассчитывали как отношение радиоактивности зоны, соответствующей ДНК-белковому конъюгату, к сумме радиоактивности зон, соответствующих ДНК-белковому конъюгату и несвязавшейся ДНК. Изучение специфичности аффинной модификации М^воП.

Конкурентное ингибирование связывания. К 50 пмоль М^эоН и 0.5 пмоль 5'- Р-меченным дуплексам Б и I, содержащим участок узнавания М. БзоП, добавляли конкурирующие ДНК-лиганды С, Р, К, О в 10-, 20-, 40-, 60-, 80-, 100-кратном избытке по отношению к меченому дуплексу. Эксперименты проводили в 10 мкл буфера И в течение 30 мин при 37 °C. Продукты реакции анализировали в неденатурирующем 7%-ном ПААГ в буфере К. Конкурентное ингибирование ковалентного связывания. К 50 пмоль М. ЗэоИ и 0.5 пмоль 5'-32Р-меченным дуплексам М и 14, содержащим участок узнавания М. ЗбоН, добавляли конкурирующие ДНК-лиганды С, Р, Ь, О в 5-, 10-, 20-, 40-, 60-, 80-, 100-кратном избытке по отношению к меченому дуплексу. Реакцию проводили в 10 мкл буфера И в течение 30 мин при 37 °C. Затем к реакционной смеси добавляли 275 мМ НаВНзСЫ до конечной концентрации 50 мМ и выдерживали 1 ч при 37 °C. Продукты реакции анализировали электрофорезом в 12%-ном ДСН-ПААГ с 4%-ной концентрирующей полосой как описано выше.

Ковалентное связывание модифицированных ДНК-дуплексов с М^оП после образования комплекса. 5'-32Р-меченные 2'-диольные олигонуклеотидные дуплексы (0.5 пмоль) инкубировали с 50 пмоль M. SsoII в 20 мкл буфера И в течение 30 мин при 37 °C. После этого к реакционной смеси добавляли 15 мкл 0.23 мМ или 0.023 мМ NaIC>4, реакционную смесь инкубировали 5, 15, 30, 120 мин и 15 ч при 25 °C. Затем добавляли 275 мМ NaBH3CN до конечной концентрации 50 мМ и выдерживали 1 ч при 37 °C. Продукты реакции анализировали, как описано выше.

Приготовление РНК-транскрипта и пре-тРНК. РНК-транскрипт Bstea-ra/??[Al-26] и Т. thermophilus пре-т PHKGly получены с помощью in vitro транскрипции. В качестве матриц для синтеза транскрипта Bstea-m/??[Al -26] и Т. thermophilus претРНК01у были использованы плазмидные ДНК pSP64pBstea-rwp?[Al-26] и pSBpt3'hh [248], подвергнутые гидролизу эндонуклеазой рестрикции BamHI.

Синтез полноразмерной РНК Bacillus stearothermophilus с помощью Т4 ДНК-лигазы.

5'-32Р-меченный немодифицированный олигорибонуклеотид или его модифицированный аналог XII (3 мкМ), транскрипт Bstea-rw/??[Al -26] (1 мкМ) и ДНК-матрицу (2 мкМ) нагревали (92°С — 1 мин, 25 °C — 5 мин [226]) в присутствии или в отсутствие буфера для Т4 ДНК-лигазы, либо не нагревали и инкубировали с Т4 ДНК-лигазой (7.5 ед) в 20 мкл буфера в присутствии 5 мМ ДТТ, 1 мМ АТФ, ингибитора РНКаз (40 ед) либо БСА (0.1 мг/мл) в течение 4, 6, 8 или 15 ч при 28 °C. Продукты лигирования анализировали методом электрофореза в 8%-ном ПААГ, содержащем 7 М мочевину.

Формирование структуры РНК РНКазы Р за счет комплементационных.

32 взаимодействий. Транскрипт Bstea-rw/>i?[Al-26] (4−5 мкМ) и 5'- Р-меченный модифицированный олигорибонуклеотид (XII, XXVII-XXIX) или его немодифицированный аналог (0.2−0.25 мкМ), взятые в соотношении 20:1, соответственно, выдерживали в отсутствие Т4 ДНК-лигазы в 10 мкл буфера М или Н в течение 5 мин при 55 °C, затем 30 мин при 37 °C. Полученную структуру РНК РНКазы Р использовали для определения активности холофермента РНКазы Р и изучения закономерностей ковалентного связывания 2'-альдегидных олигорибонуклеотидов с белком РНКазы Р.

Каталитическое отщепление 5'-концевой последовательности пре-тРНК [249]. 250 нМ.

РНК В. stearothermophilus (дикий тип, лигированная либо гибридизованная) или 250 нМ транскрипт Bstea-rrcpZ?[Al-26] инкубировали в 20 мкл буфера М [250] 5 мин при 55 °C, затем 50 мин при 37 °C. После этого добавляли 2.5 пмоль белка В. subtilis. Реакционную смесь объемом 20 мкл выдерживали 5 мин при 37 °C. Параллельно инкубировали субстрат — 5'-32Рмеченную пре-тРНК°'у (конечная концентрация в смеси составляла < 1 нМ) — в 5 мкл буфера M 5 мин при 55 °C, затем 25 мин при 37 °C.

К 16 мкл холофермента добавляли 4 мкл 5'- Р-меченного субстрата и проводили реакцию ферментативного расщепления при 37 °C. Через определенное время (1, 2, 5, 10 мин) отбирали аликвоты (4 мкл) и добавляли их к 6 мкл раствора для нанесения на гель РЗ. Продукты реакции анализировали методом электрофореза в 20%-ном ПААГ, содержащем 7 M мочевину. Визуализацию радиоактивных полос в геле и обсчет данных проводили на приборе Fuji Film (Япония), используя компьютерную программу AIDA, версия 3.45. Расчет константы скорости реакции первого порядка проводили с использованием компьютерной программы Grafit 3.04.

Получение олигорибонуклеотидов, содержащих остаток 2'-{?-(2,5-диоксо-3-азапентил)уридина. 10 пмоль 5'-32Р-меченного олигорибонуклеотида (XIV-XVI), содержащего 1,2-диольную группу, растворяли в 15 мкл буфера В. К раствору добавляли 15 мкл 0.23 M NaIU4, реакционные смеси инкубировали 30 мин при 25 °C. Затем добавляли 6 мкл 3 M ацетата натрия (рН 5.0), олигонуклеотидный материал высаживали 5-кратным избытком спирта и сушили при 37 °C.

Ковалентное связывание РНК-лигандов, содержащих 2'-альдегидную группировку, с белком бактериальной рибонуклеазы Р. 5'- Р-меченные олигонуклеотиды XXVII-XXIX (0.2 мкМ) гибридизовали с Bstea-гирДА1 -26] (4 мкМ) в буфере H в течение 5 мин при 55 °C, затем в течение 30 мин при 37 °C. Полученную структуру РНК В. stearothermophilus РНКазы Р инкубировали с белком В. subtilis РНКазы Р в течение 10 мин при 37 °C. Объем реакционной смеси составлял 10 мкл. Концентрацию белка варьировали в диапазоне 2−20 мкМ. Затем к реакционной смеси добавляли 275 мМ NaBF^CN до конечной концентрации 50 мМ и выдерживали 1.5 ч при 37 °C. Продукты реакции разделяли методом электрофореза в 13%-ном ДСН-ПААГ с 4%-ной концентрирующей полосой (гель-электрофорез по методу Шагера и фон Ягова) [251]. Перед нанесением на гель реакционные смеси выдерживали 5 мин при 95 °C в денатурирующем буфере О для разрушения нековалентных комплексов РНК-белок. Визуализацию радиоактивных полос в геле и обсчет данных проводили на приборе Molecular Dynamics Phosphorlmager SI (Molecular Dynamics), используя компьютерную программу Image Qantum, версия 5.0. Выходы продуктов ковалентного связывания Р-белка с РНК рассчитывали как отношение радиоактивности зоны, соответствующей РНК-белковому конъюгату, к сумме радиоактивности зон, соответствующих РНК-белковому конъюгату и несвязавшейся РНК.

Ковалентное связывание ДНК-дуплексов, содержащих 2'-альдегидную группировку, с белком бактериальной рибонуклеазы Р. 5'-32Р-меченные ДНК-дуплексы L, М (1 пмоль) инкубировали с белком В. subtilis РНКазы Р (100 и 200 пмоль) в 10 мкл буфера Н в течение 30 мин при 37 °C. Затем к реакционной смеси добавляли 275 мМ NaBH3CN до конечной концентрации 50 мМ и выдерживали 1 ч при 37 °C. Продукты реакций разделяли электрофорезом по Леммли в 12%-ном ДСН-ПААГ с 4%-ной концентрирующей полосой. Перед нанесением на гель реакционные смеси выдерживали 5 мин при 95 °C в денатурирующем буфере JI для разрушения нековалентных комплексов ДНК-белок. Положение 5'-32Р-меченных соединений определяли радиоавтографически. Реакция 2'-гидразидных олигонуклеотидов с альдегидами. Осадок 2'-гидразидного олигонуклеотида (XIX, XXII) (1−3 ОЕ А260) растворяли в 50 мкл буфера В. Затем добавляли 50 мкл раствора альдегидов 1−5 (1 мг) в ДМСО либо в воде. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 15 ч при рН 4.0−4.5. Далее, если необходимо, добавляли 40 мкл 275 мМ NaBH3CN, инкубировали 30 мин при комнатной температуре. После проводили высаживание 4 М раствором ацетата натрия (28 мкл) и этанолом (1.5 мл). Анализ реакционных смесей и выделение целевых продуктов проводили в 20%-ном ПААГ, содержащем 7 М мочевину, и методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на хроматографе фирмы «Agilent 1100″ (США) с использованием колонки Nucleosil С18 (5 мкм, 300 А, 4.6×250 мм). Условия аналитического разделения: температура колонки — 45°Сэлюент: буфер А2- буфер Б2- линейный градиент концентрации ацетонитриларасход элюента 0.9 мл-мин» 1. Строение конъюгатов подтверждали данными масс-спектрометрии MALDI-TOF (см. Приложение).

Реакция 2'-гидразидных олигонуклеотидов с пирен-1-карбальдегидом или перилен-3-карбальдегидом. К осадку 2'-гидразидного олигонуклеотида (XX, XXI, XXIV, XXV) (1−3 ОЕ А260) добавляли 50 мкл Н20 и раствор альдегида 6 или 7 (1 мг) в 50 мкл ДМСО. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 15 ч при рН 5.5. Затем, если необходимо, добавляли 40 мкл 275 мМ NaBH3CN и реакционную смесь инкубировали еще 30 мин при комнатной температуре. После проводили высаживание 4 М раствором ацетата натрия (20 мкл) и этанолом (1.5 мл). Продукты реакции анализировали, как описано выше.

1. Yaffe М.В. X-ray crystallography and structural biology. И Crit. Care. Med. 2005. 33(12 Suppl): S435−440.

2. Mertens H.D., Svergun D.I. Structural characterization of proteins and complexes using small-angle X-ray solution scattering. II J. Struct. Biol. 2010. 172(1): 128−141.

3. Svergun D.I. Small-angle X-ray and neutron scattering as a tool for structural systems biology. II Biol. Chem. 2010. 391(7): 737−743.

4. Kirino Y., Mourelatos Z. Site-specific crosslinking of human microRNPs to RNA targets. // RNA. 2008. 14(10): 2254−2259.

5. Dechassa M.L., Zhang В., Horowitz-Scherer R., Persinger J., Woodcock C.L., Peterson C.L., Bartholomew B. Architecture of the SWI/SNF-nucleosome complex. // Mol. Cell. Biol. 2008. 28(19): 6010−6021.

6. Dang W., Bartholomew B. Domain architecture of the catalytic subunit in the ISW2-nucleosome complex. II Mol. Cell. Biol. 2007. 27(23): 8306−8317.

7. Maltseva E.A., Rechkunova N.I., Petruseva I.O., Vermeulen W., Scharer O.D., Lavrik O.I. Crosslinking of nucleotide excision repair proteins with DNA containing photoreactive damages. // Bioorg. Chem. 2008. 36(2): 77−84.

8. Суханова M.B., Ходырева C.H., Лаврик О. И. Влияние экзогенной поли (АОР-рибозо)-полимеразы-1 и ее апоптотического фрагмента 24 кДа на репарацию ДНК-дуплексов в ядерном экстракте из семенников крупного рогатого скота. // Биохимия. 2006. 71(7): 909−923.

9. Neher Т.М., Rechkunova N.I., Lavrik O.I., Turchi J.J. Photo-cross-linking of XPC-Rad23B to cisplatin-damaged DNA reveals contacts with both strands of the DNA duplex and spans the DNA adduct. II Biochemistry. 2010. 49(4): 669−678.

10. Bose D., Pape Т., Burrows P.C., Rappas M., Wigneshweraraj S.R., Buck M., Zhang X. Organization of an activator-bound RNA polymerase holoenzyme. // Mol. Cell. 2008. 32(3): 337 346.

11. Burrows P.C., Wigneshweraraj S.R., Buck M. Protein-DNA interactions that govern AAA+ activator-dependent bacterial transcription initiation. II J. Mol. Biol. 2008. 375(1): 43−58.

12. Naryshkin N., Druzhinin S., Revyakin A., Kim Y., Mekler V., Ebright R.H. Static and kinetic site-specific protein-DNA photocrosslinking: analysis of bacterial transcription initiation complexes. II Methods Mol. Biol. 2009. 543: 403−437.

13. Grunberg S., Reich C., Zeller M.E., Bartlett M.S., Thomm M. Rearrangement of the RNA polymerase subunit H and the lower jaw in archaeal elongation complexes. // Nucleic Acids Res. 2010. 38(6): 1950;1963.

14. Reyes D.Y., Zuber P. Activation of transcription initiation by Spx: formation of transcription complex and identification of a cz’s-acting element required for transcriptional activation. // Mol. Microbiol. 2008. 69(3): 765−779.

15. Grunberg S., Bartlett M.S., Naji S., Thomm M. Transcription factor E is a part of transcription elongation complexes. II J. Biol. Chem. 2007. 282(49): 35 482−35 490.

16. Micorescu M., Griinberg S., Franke A., Cramer P., Thomm M., Bartlett M. Archaeal transcription: function of an alternative transcription factor В from Pyrococcus furiosus. II J. Bacteriol. 2008.190(1): 157−167.

17. Kim M.K., Kang Y.S., Lai H.T., Barakat N.H., Magante D., Stumph W.E. Identification of SNAPc subunit domains that interact with specific nucleotide positions in the U1 and U6 gene promoters. // Mol. Cell. Biol 2010. 30(10): 2411−2423.

18. Kassavetis G.A., Prakash P., Shim E. The C53/C37 subcomplex of RNA polymerase III lies near the active site and participates in promoter opening. II J. Biol. Chem. 2010. 285(4): 2695−2706.

19. Paratkar S., Patel S.S. Mitochondrial transcription factor Mtfl traps the unwound non-template strand to facilitate open complex formation. // J. Biol. Chem. 2010. 285(6): 3949−3956.

20. Молотков М. В., Грайфер Д. М., Попугаева Е. А., Булыгин К. Н., Мещанинова М. И., Веньяминова А. Г., Карпова Г. Г. Белок S3 в 80S рибосоме человека соседствует с мРНК с 3'-стороны от ко дона в А-участке. // Биоорг. химия. 2007. 33(4): 431−441.

21. Хайрулина Ю. С., Молотков М. В., Булыгин К. Н., Грайфер Д. М., Веньяминова А. Г., Карпова Г. Г. С-концевой фрагмент рибосомного белка S15 расположен в декодирующем центре рибосомы человека. // Молекуляр. биология. 2008. 42(2): 306−313.

22. Meisenheimer К.М., Koch Т.Н. Photocross-linking of nucleic acids to associated proteins. // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol 1997. 32(2): 101−140.

23. Rutvisuttinunt W., Meyer P.R., Scott W.A. Interactions between HIV-1 reverse transcriptase and the downstream template strand in stable complexes with primer-template. // PLoS. One. 2008. 3(10): e3561.

24. Ha K.S., Toulokhonov I., Vassylyev D.G., Landick R. The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase. II J. Mol Biol 2010. 401(5): 708−725.

25. Schwer B. A conformational rearrangement in the spliceosome sets the stage for Prp22-dependent mRNA release. II Mol Cell. 2008. 30(6): 743−754.

26. Turunen J.J., Will C.L., Grote M., Luhrmann R., Frilander M.J. The U11−48K protein contacts the 5' splice site of U12-type introns and the U11−59K protein. // Mol Cell Biol. 2008. 28(10): 3548−3560.

27. Haugen S.P., Berkmen M.B., Ross W., Gaal T., Ward C., Gourse R.L. rRNA promoter regulation by nonoptimal binding of sigma region 1.2: an additional recognition element for RNA polymerase. II Cell. 2006.125(6): 1069−1082.

28. Haugen S.P., Ross W., Manrique M., Gourse R.L. Fine structure of the promoter-sigma region 1.2 interaction. // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2008.105(9): 3292−3297.

29. Pisarev A.V., Kolupaeva V.G., Yusupov M.M., Hellen C.U., Pestova T.V. Ribosomal position and contacts of mRNA in eukaryotic translation initiation complexes. // EMBO J. 2008. 27(11): 1609−1621.

30. Koleva R.I., Austin C.A., Kowaleski J.M., Neems D.S., Wang L., Vary C.P., Schlax P.J. Interactions of ribosomal protein SI with DsrA and rpoS mRNA. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. 348(2): 662−668.

31. Nishiyama T., Yamamoto H., Uchiumi T., Nakashima N. Eukaryotic ribosomal protein RPS25 interacts with the conserved loop region in a dicistroviral intergenic internal ribosome entry site. // Nucleic Acisd Res. 2007. 35(5): 1514−1521.

32. Lu K., Ye W., Zhou L., Collins L.B., Chen X., Gold A., Ball L.M., Swenberg J.A. Structural characterization of formaldehyde-induced cross-links between amino acids and deoxynucleosides and their oligomers. II J. Am. Chem. Soc. 2010. 132(10): 3388−3399.

33. Qin H., Wang Y. Exploring DNA-binding proteins with in vivo chemical cross-linking and mass spectrometry. II J. Proteome Res. 2009. 8(4): 1983;1991.

34. Han Y.T., Hsu Y.H., Lo C.W., Meng M. Identification and functional characterization of regions that can be crosslinked to RNA in the helicase-like domain of BaMV replicase. // Virology.2009. 389(1−2): 34−44.

35. Hinz J.M., Rodriguez Y., Smerdon M.J. Rotational dynamics of DNA on the nucleosome surface markedly impact accessibility to a DNA repair enzyme. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010.107(10): 4646−4651.

36. Kim Y.C., Cheng Kao C. Biochemical analyses of the interactions between viral polymerases and RNAs. II Methods Mol. Biol 2008. 451: 185−200.

37. Vasudevan S., Steitz J.A. AU-rich-element-mediated upregulation of translation by FXR1 and Argonaute 2. // Cell. 2007.128(6): 1105−1118.

38. Bogenhagen D.F., Rousseau D., Burke S. The layered structure of human mitochondrial DNA nucleoids. II J. Biol. Chem. 2008. 283(6): 3665−3675.

39. Jayani R.S., Ramanujam P.L., Galande S. Studying histone modifications and their genomic functions by employing chromatin immunoprecipitation and immunoblotting. // Methods Cell. Biol.2010. 98: 35−56.

40. Xie Z., Hu S., Qian J., Blackshaw S., Zhu H. Systematic characterization of protein-DNA interactions. II Cell. Mol. Life Sci. 2011. 68(10): 1657−1668.

41. Piersen C.E., McCullough A.K., Lloyd R.S. AP lyases and dRPases: commonality of mechanism. // Mutat. Res. 2000. 459(1): 43−53.

42. Rieger R.A., Zaika E.I., Xie W., Johnson F., Grollman A.P., Iden C.R., Zharkov D.O. Proteomic approach to identification of proteins reactive for abasic sites in DNA. // Mol. Cell. Proteomics. 2006. 5(5):858−867.

43. Ходырева C.H., Лаврик О. И. Аффинная модификация в протеомном исследовании ансамблей репарации ДНК. // Биоорган, химия. 2011. 37(1): 91−107.

44. Prasad R., Longley M.J., Sharief F.S., Hou E.W., Copeland W.C., Wilson S.H. Human DNA polymerase 0 possesses 5'-dRP lyase activity and functions in single-nucleotide base excision repair in vitro. II Nucleic Acids Res. 2009. 37(6): 1868−1877.

45. Ilina E.S., Lavrik O.I., Khodyreva S.N. Ku antigen interacts with abasic sites. // Biochim. Biophys. Acta. 2008.1784(11): 1777−1785.

46. Grin I.R., Khodyreva S.N., Nevinsky G.A., Zharkov D.O. Deoxyribophosphate lyase activity of mammalian endonuclease VHI-like proteins. IIFEBS Lett. 2006. 580(20): 4916−4922.

47. Verdine G.L., Norman D.P. Covalent trapping of protein-DNA complexes. // Annu. Rev. Biochem. 2003. 72: 337−366.

48. Rohs R., Jin X., West S.M., Joshi R., Honig B., Mann R.S. Origins of specificity in proteinDNA recognition. II Annu. Rev. Biochem. 2010. 79: 233−269.

49. Hrmova M., Fincher G.B. Functional genomics and structural biology in the definition of gene function. II Methods Mol. Biol. 2009. 513: 199−227.

50. Dauter Z. Current state and prospects of macromolecular crystallography. // Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 2006. 62(Pt 1): 1−11.64. http://www.bnl.gov/discover/Spring04/crystallography.asp.

51. Hollis T. Crystallization of protein-DNA complexes. // Methods Mol. Biol. 2007. 363: 225 237.

52. He C., Verdine G.L. Trapping distinct structural states of a protein/DNA interaction through disulfide crosslinking. // Chem. Biol. 2002. 9(12): 1297−1303.

53. Banerjee A., Yang W., Karplus M., Verdine G.L. Structure of a repair enzyme interrogating undamaged DNA elucidates recognition of damaged DNA. II Nature. 2005. 434(7033): 612−618.

54. Yi C., Jia G., Hou G., Dai Q., Zhang W., Zheng G., Jian X., Yang C.G., Cui Q., He C. Iron-catalysed oxidation intermediates captured in a DNA repair dioxygenase. // Nature. 2010. 468(7321): 330−333.

55. Yang C.G., Yi C., Duguid E.M., Sullivan C.T., Jian X., Rice P.A., He C. Crystal structures of DNA/RNA repair enzymes AlkB and ABH2 bound to dsDNA. II Nature. 2008. 452(7190): 961−965.

56. Malecka K.A., Ho W.C., Marmorstein R. Crystal structure of a p53 core tetramer bound to DNA. // Oncogene. 2009. 28(3): 325−333.

57. Tahirov T.H., Babayeva N.D., Varzavand K., Cooper J.J., Sedore S.C., Price D.H. Crystal structure of HIV-1 Tat complexed with human P-TEFb. II Nature. 2010. 465(7299): 747−751.

58. Opalka N., Brown J., Lane W.J., Twist K.A., Landick R., Asturias F.J., Darst S.A. Complete structural model of Escherichia coli RNA polymerase from a hybrid approach. // PLoS Biol. 2010. 8(9): el000483.

59. Zhang A.P., Pigli Y.Z., Rice P.A. Structure of the LexA-DNA complex and implications for SOS box measurement. II Nature. 2010. 466(7308): 883−886.

60. Ochi T., Sibanda B.L., Wu Q., Chirgadze D.Y., Bolanos-Garcia V.M., Blundell T.L. Structural biology of DNA repair: spatial organisation of the multicomponent complexes of nonhomologous end joining. II J. Nucleic Acids. 2010. 2010: 621 695.

61. Pingoud A., Jeltsch A. Structure and function of type II restriction endonucleases. // Nucleic Acids Res. 2001. 29(18): 3705−3727.

62. Obayashi E., Oubridge C., Pomeranz Krummel D., Nagai K. Crystallization of RNA-protein complexes. II Methods Mol. Biol. 2007. 363: 259−276.

63. Dupureur C.M. NMR studies of restriction enzyme-DNA interactions: role of conformation in sequence specificity. // Biochemistry. 2005. 44(13): 5065−5074.

64. Eilebrecht S., Smet-Nocca C., Wieruszeski J.M., Benecke A. SUMO-1 possesses DNA binding activity. // BMC. Res. Notes. 2010. 3(1): 146.

65. Volkov A.N., Ubbink M., van Nuland N.A. Mapping the encounter state of a transient protein complex by PRE NMR spectroscopy. // J. Biomol. NMR. 2010. 48(4): 225−236.

66. Iwahara J., Clore G.M. Detecting transient intermediates in macromolecular binding by paramagnetic NMR. II Nature. 2006. 440(7088): 1227−1230.

67. Iwahara J., Schwieters C.D., Clore G.M. Characterization of nonspecific protein-DNA interactions by 1H paramagnetic relaxation enhancement. // J. Am. Chem. Soc. 2004. 126(40): 12 800−12 808.

68. Varani G., Chen Y., Leeper T.C. NMR studies of protein-nucleic acid interactions. // Methods Mol. Biol. 2004. 278: 289−312.

69. Volkov A.N., Worrall J. A., Holtzmann E., Ubbink M. Solution structure and dynamics of the complex between cytochrome c and cytochrome c peroxidase determined by paramagnetic NMR. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2006.103(50): 18 945−18 950.

70. Galius V., Leontiou C., Richmond T., Wider G. Projected 'H, 15N.-HMQC-[ 'H,^j-NOESY for large molecular systems: application to a 121 kDa protein-DNA complex. // J. Biomol. NMR. 2008. 40(3): 175−181.

71. Iwahara J., Zweckstetter M., Clore G.M. NMR structural and kinetic characterization of a homeodomain diffusing and hopping on nonspecific DNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. 103(41): 15 062−1507.

72. Fraenkel E., Pabo C.O. Comparison of X-ray and NMR structures for the Antennapedia homeodomain-DNA complex. II Nat. Struct. Biol. 1998. 5(8): 692−697.

73. Du Z., Lee J.K., Fenn S., Tjhen R., Stroud R.M., James T.L. X-ray crystallographic and NMR studies of protein-protein and protein-nucleic acid interactions involving the KH domains from human poly (C)-binding protein-2. H RNA. 2007.13(7): 1043−1051.

74. Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L. Section 4.5. Three-dimensional protein structure can be determined by NMR spectroscopy and X-ray crystallography// Biochemistry. 5th edition. / New York: W. H. Freeman. 2002.

75. Matzapetakis M., Turano P., Theil E.C., Bertini I. 13C-13C NOESY spectra of a 480 kDa protein: solution NMR of ferritin. II J. Biomol. NMR. 2007. 38(3): 237−242.

76. Fiaux J., Bertelsen E.B., Horwich A.L., Wuthrich K. NMR analysis of a 900K GroEL GroES complex. II Nature. 2002. 418(6894): 207−211.

77. Frank J. Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy -30 years. // Q. Rev. Biophys. 2009. 42(3): 139−158.

78. Rambo R.P., Tainer J.A. Bridging the solution divide: comprehensive structural analyses of dynamic RNA, DNA, and protein assemblies by small-angle X-ray scattering. // Curr. Opin. Struct. Biol. 2010. 20(1): 128−137.

79. Сердюк И. Н. Физические методы в структурной молекулярной биологии начала XXI века. // Успехи биол. химии. 2002. 42: 3−28.

80. Szymczyna B.R., Taurog R.E., Young M.J., Snyder J.C., Johnson J.E., Williamson J.R. Synergy of NMR, computation, and X-ray crystallography for structural biology. // Structure. 2009. 17(4): 499−507.

81. Tang L., Johnson J.E. Structural biology of viruses by the combination of electron cryomicroscopy and X-ray crystallography. // Biochemistry. 2002. 41(39): 11 517−11 524.

82. Altman S. A view of RNase P. // Mol. Biosyst. 2007. 3(9): 604−607.

83. Ellis JC, Brown JW. The RNase P family. // RNA Biol. 2009. 6(4): 362−369.

84. Esakova O., Krasilnikov A.S. Of proteins and RNA: the RNase P/MRP family. // RNA. 2010. 16(9): 1725−1747.

85. Jarrous N., Gopalan V. Archaeal/Eukaryal RNase P: subunits, functions and RAN diversification. 11 Nucleic Acids Res. 2010. 38(22): 7885−7894.

86. Altman S. Ribonuclease P. // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sei. 2011. 366(1580): 29 362 941.

87. Robertson H.D., Altman S., Smith J.D. Purification and properties of a specific Escherichia coli ribonuclease which cleaves a tyrosine transfer ribonucleic acid precursor. // J. Biol. Chem. 1972. 247(16): 5243−5251.

88. Altman S., Robertson H.D. RNA precursor molecules and ribonuclease in E. coli. II Mol. Cell. Biochem. 1973.1(1): 83−93.

89. Doudna J.A., Cech T.R. The chemical repertoire of natural ribozymes // Nature. 2002. 418(6894): 222−228.

90. Guerrier-Takada C., Altman S. Catalytic activity of an RNA molecule prepared by transcription in vitro. II Science. 1984. 223(4633): 285−286.

91. Peck-Millert K., Altman S. Kinetics of the processing of the precursor to 4.5 S RNA, a naturally occurring substrate for RNase P from Escherichia coli. II J. Mol. Biol. 1991. 221(1): 1−5.

92. Bothwell A.L., Garber R.L., Altman S. Nucleotide sequence and in vitro processing of a precursor molecule to Escherichia coli 4.5 S RNA. II J. Biol. Chem. 1976. 251(23): 7709−7716.

93. Komine Y., Kitabatake M., Yokogawa T., Nishikawa K., Inokuchi H. A tRNA-like structure is present in lOSa RNA, a small stable RNA from Escherichia coli. II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1994. 91(20): 9223−9227.

94. Li Y., Altman S. A specific endoribonuclease, RNase P, affects gene expression of polycistronic operon mRNAs. II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2003. 100(23): 13 213−13 218.

95. Li Y., Altman S. Polarity effects in the lactose operon of Escherichia coli. II J. Mol. Biol. 2004. 339(1): 31−39.

96. Altman S., Wesolowski D., Guerrier-Takada C., Li Y. RNase P cleaves transient structures in some riboswitches. II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2005. 102(32): 11 284−11 289.

97. Seif E., Altman S. RNase P cleaves the adenine riboswitch and stabilizes pbuE mRNA in Bacillus subtilis. II RNA. 2008.14(6): 1237−1243.

98. Willkomm D.K., Hartmann R.K. An important piece of the RNase P jigsaw solved. // Trends Biochem. Sei. 2007. 32(6): 247−250.

99. Salavati R., Panigrahi A.K., Stuart K.D. Mitochondrial ribonuclease P activity of Trypanosoma brucei. II Mol. Biochem. Parasitol. 2001.115(1): 109−117.

100. Holzmann J., Frank P., Loffler E., Bennett K.L., Gerner C., Rossmanith W. RNase P without RNA: identification and functional reconstitution of the human mitochondrial tRNA processing enzyme. // Cell. 2008. 135(3): 462−474.

101. Holzmann J., Rossmanith W. tRNA recognition, processing, and disease: hypotheses around an unorthodox type of RNase P in human mitochondria. // Mitochondrion. 2009. 9(4): 284−288.

102. Wang M.J., Gegenheimer P. Novel mechanisms for maturation of chloroplast transfer RNA precursors. HEMBO. J. 1988. 7(6): 1567−1574.

103. Thomas B.C., Li X., Gegenheimer P. Chloroplast ribonuclease P does not utilize the ribozyme-type pre-tRNA cleavage mechanism. II RNA. 2000. 6(4): 545−553.

104. Kirsebom L.A., Trobro S. RNase P RNA-mediated cleavage. // IUBMB Life. 2009. 61(3): 189 200.

105. Baird N.J., Fang X.-W., Srividya N., Pan T., Sosnick T.R. Folding of a universal ribozyme: The ribonuclease P RNA. // Q. Rev. Biophys. 2007. 40(2): 113−161.

106. Kazantsev A.V., Krivenko A.A., Pace N.R. Mapping metal-binding sites in the catalytic domain of bacterial RNase P RNA. II RNA. 2009.15(2): 266−276.

107. Stark B.C., Kole R., Bowman E.J., Altman S. Ribonuclease P: an enzyme with an essential RNA component. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1978. 75(8): 3717−3721.

108. Brown J.W., Pace N. Ribonuclease P RNA and protein subunits from bacteria. // Nucleic Acids Res. 1992. 20(7): 1451−1456.

109. Guerrier-Takada C., Gardiner K., Marsh T., Pace N., Altman S. The RNA moiety of Ribonuclease P is the catalytic subunit of the enzyme. // Cell. 1983. 35(3 Pt. 2): 849−857.

110. Kole R., Altman S. Properties of purified ribonuclease P from Escherichia coli. II Biochemistry. 1981. 20(7): 1902;1906.

111. Hall T.A., Brown J.W. Archaeal RNase P has multiple protein subunits homologous to eukaryotic nuclear RNase P proteins. // RNA. 2002. 8(3): 296−306.

112. Hartmann E., Hartmann R.K. The enigma of ribonuclease P evolution. // Trends Genet. 2003. 19(10): 561−569.

113. Terada A., Honda T., Fukuhara H., Hada K., Kimura M. Characterization of the archaeal ribonuclease P proteins from Pyrococcus horikoshii OT3. // J. Biochem. 2006.140(2): 293−298.

114. Cho I.M., Lai L.B., Susanti D., Mukhopadhyay В., Gopalan V. Ribosomal protein L7Ae is a subunit of archaeal RNase P. //Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2010. 107(33): 14 573−14 578.

115. Chamberlain J.R., Lee Y., Lane W.S., Engelke D.R. Purification and characterization of the nuclear RNase P holoenzyme complex reveals extensive subunit overlap with RNase MRP. // Genes Dev. 1998. 12(11): 1678−1690.

116. Jarrous N. Human ribonuclease P: subunits, function, and intranuclear localization. // RNA. 2002. 8(1): 1−7.

117. Marvin M.C., Engelke D.R. Broadening the mission of an RNA enzyme. // J. Cell. Biochem. 2009.108(6): 1244−1251.

118. Kikovska E., Svard S.G., Kirsebom L.A. Eukaryotic RNase P RNA mediates cleavage in the absence of protein. //Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2007.104(7): 2062;2067.

119. Pannucci J.A., Haas E.S., Hall T.A., Harris K., Brown J.W. RNase P RNAs from some Archaea are catalytically active. //Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1999. 96(14): 7803−7808.

120. Thomas B.C., Chamberlain J., Engelke D.R., Gegenheimer P. Evidence for an RNA-base catalytic mechanism in eukaryotic nuclear ribonuclease P. // RNA. 2000. 6(4): 554−562.

121. Li D., Willkomm D.K., Hartmann R.K. Minor changes largely restore catalytic activity of archaeal RNase P RNA from Methanothermobacter thermoautotrophicus. // Nucleic Acids Res. 2009. 37(1): 231−242.

122. Haas E.S., Banta A.B., Harris J.K., Pace N.R., Brown J.W. Structure and evolution of ribonuclease P RNA in Gram-positive bacteria. // Nucleic Acids Res. 1996. 24(23): 4775−4782.

123. Kazantsev A.V., Pace N.R. Bacterial RNase P: a new view of an ancient enzyme. //Nat. Rev. Microbiol. 2006. 4(10): 729−740.

124. Chen J.L., Nolan J.M., Harris M.E., Pace N.R. Comparative photocross-linking analysis of the tertiary structures of Escherichia coli and Bacillus subtilis RNase P RNA. // EMBO. J. 1998. 17(5): 1515−1525.

125. Massire С., Jaeger L., Westhof E. Derivation of the three-dimensional architecture of bacterial ribonuclease P RNAs from comparative sequence analysis. // J. Mol. Biol. 1998. 279(4): 773−793.

126. Waugh D.S., Pace N.R. Complementation of an RNase P RNA (rnpB) gene deletion in Escherichia coli by homologous genes from distantly related eubacteria. // J. Bacteriol. 1990. 172(11): 6316−6322.

127. Wegscheid В., Condon С., Hartmann R.K. Type A and В RNase P RNA are interchangeable in vivo despite substsntial biophysical differences. // EMBO Rep. 2006. 7(4): 411−417.

128. Loria A., Pan T. Recognition of the T stem-loop of a pre-tRNA substrate by the ribozyme from Bacillus subtilis ribonuclease P. // Biochemistry. 1997. 36(21): 6317−6325.

129. Odell L., Huang V., Jakacka M., Pan T. Interaction of structural modules in substrate binding by the ribozyme from Bacillus subtilis RNase P. II Nucleic Acids Res. 1998. 26(16): 3717−3723.

130. Reiter N.J., Osterman A., Torres-Larios A., Swinger K.K., Pan T., Mondragon A. Structure of a bacterial ribonuclease P holoenzyme in complex with tRNA. II Nature. 2010. 468(7325): 784−789.

131. Zahler N.H., Christian E.L., Harris M.E. Recognition of the 5' leader of pre-tRNA substrates by the active site of ribonuclease P. // RNA. 2003. 9(6): 734−745.

132. Loria A., Pan T. Modular construction for function of a ribonucleoprotein enzyme: the catalytic domain of Bacillus subtilis RNase P complexed with B. subtilis RNase P protein. // Nucleic Acids Res. 2001.29(9): 1892−1897.

133. Pan T. Higher order folding and domain analysis of the ribozyme from Bacillus subtilis ribonuclease P. II Biochemistry. 1995. 34(3): 902−909.

134. Loria A., Pan T. Domain structure of the ribozyme from eubacterial ribonuclease P. // RNA. 1996. 2(6): 551−563.

135. Chen J.L., Pace N.R. Identification of the universally conserved core of ribonuclease P RNA. II RNA. 1997. 3(6): 557−560.

136. Reich C., Olsen G.J., Pace B., Pace N.R. Role of the protein moiety of ribonuclease P, a ribonucleoprotein enzyme. // Science. 1988. 239(4836): 178−181.

137. Gossringer M., Far R.K.-K., Hartmann R.K. Analysis of RNase P protein (rnpA) expression in Bacillus subtilis utilizing strains withsuppressible rnpA expression. // J. Bacteriol. 2006. 188(19): 6816−6823.

138. Kurz J.C., Niranjanakumari S., Fierke C.A. Protein component of Bacillus subtilis RNase P specifically enhances the affinity for precursor-tRNAAsp. // Biochemistry. 1998. 37(8): 2393−2400.

139. Sun L., Campbell F.E., Yandek L.E., Harris M.E. Binding of C5 protein to P RNA enhances the rate constant for catalysis for P RNA processing of pre-tRNAs lacking a consensus G+l/C+72 pair. II J. Mol. Biol. 2010. 395(5): 1019−1037.

140. Buck A.H., Dalby A.B., Poole A.W., Kazantsev A.V., Pace N.R. Protein activation of a ribozyme: The role of bacterial RNase P protein. // EMBO. J. 2005. 24(19): 3360−3368.

141. Kim J.J., Kilani A.F., Zhan X., Altman S., Liu F. The protein cofactor allows the sequence of an RNase P ribozyme to diversify by maintaining the catalytically active structure of the enzyme. // RNA. 1997. 3(6): 613−623.

142. Peck-Miller K.A., Altman S. Kinetics of the processing of the precursor to 4.5 S RNA, a naturally occurring substrate for RNase P from Escherichia coli. II J. Mol. Biol. 1991. 221(1): 1−5.

143. Sun L., Campbell F.E., Zahler N.H., Harris M.E. Evidence that substrate-specific effects of C5 protein lead to uniformity in binding and catalysis by RNase P. // EMBO. J. 2006. 25(17): 39 984 007.

144. Koutmou K.S., Zahler N.H., Kurz J.C., Campbell F.E., Harris M.E., Fierke C.A. Protein-precursor tRNA contact leads to sequence-specific recognition of 5' leaders by bacterial ribonuclease P. II J. Mol. Biol. 2010. 396(1): 195−208.

145. Niranjanakumari S., Stams T., Crary S.M., Christianson D.W., Fierke C.A. Protein component of the ribozyme ribonuclease P alters substrate recognition by directly contacting precursor tRNA. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1998. 95(26): 15 212−15 217.

146. Rueda D., Hsieh J., Day-Storms J.J., Fierke C.A., Walter N.G. The 5' leader of precursor tRNAAsp bound to the Bacillus subtilis RNase P holoenzyme has an extended conformation. // Biochemistry. 2005. 44(49): 16 130−16 139.

147. Kurz J.C., Fierke C.A. The affinity of magnesium binding sites in the Bacillus subtilis RNase P*pre-tRNA complex is enhanced by the protein subunit. // Biochemistry. 2002. 41(30): 9545−9558.

148. Sun L., Harris M.E. Evidence that binding of C5 protein to P RNA enhances ribozyme catalysis by influencing active site metal ion affinity. II RNA. 2007.13(9): 1505−1515.

149. Kazantsev A.V., Krivenko A.A., Harrington D.J., Carter R.J., Holbrook S.R., Adams P.D., Pace N.R. High-resolution structure of RNase P protein from Thermotoga maritima. II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2003.100(13): 7497−7502.

150. Stams T., Niranjanakumari S., Fierke C.A., Christianson D.W. Ribonuclease P protein structure: Evolutionary origins in the translational apparatus. // Science. 1998. 280(5364): 752−755.

151. Niranjanakumari S., Day-Storms J.J., Ahmed M., Hsieh J., Zahler N.H., Venters R.A., Fierke C.A. Probing the architecture of the B. subtilis RNase P holoenzyme active site by cross-linking and affinity cleavage. // RNA. 2007.13(4): 521−535.

152. Koutmou K.S., Day-Storms J.J., Fierke C.A. The RNR motif of B. subtilis RNase P protein interacts with both PRNA and pre-tRNA to stabilize an active conformer. // RNA. 2011. 17(7): 1225−1235.

153. Smith J.K., Hsieh J., Fierke C.A. Importance of RNA-protein interactions in bacterial ribonuclease P structure and catalysis. // Biopolymers. 2007. 87(5−6): 329−338.

154. Gopalan V., Kuhne H., Biswas R., Li H., Brudvig G.W., Altman S. Mapping RNA-protein interactions in ribonuclease P from Escherichia coli using electron paramagnetic resonance spectroscopy. // Biochemistry. 1999. 38(6): 1705−1714.

155. Biswas R., Ledman D.W., Fox R.O., Altman S., Gopalan V. Mapping RNA-protein interactions in ribonuclease P from Escherichia coli using disulfide-linked EDTA-Fe. // J. Mol. Biol. 2000. 296(1): 19−31.

156. Tsai T.-Y., Masquida B., Biswas R., Westhof E., Gopalan V. Molecular modeling of the three-dimensional structure of the bacterial RNase P holoenzyme. II J. Mol. Biol. 2003. 325(4): 661−675.

157. Buck A.H., Kazantsev A.V., Dalby A.B., Pace N.R. Structural perspectives on the activation of RNase P RNA by protein. II Nat. Struct. Mol. Biol. 2005. 12(11): 958−964.

158. Christian E.L., Zahler N.H., Kaye N.M., Harris M.E. Analysis of substrate recognition by the ribonucleoprotein nuclease RNase P. // Methods. 2002. 28(3): 307−322.

159. Masquida B., Westhof E. RNase P: at last, the key finds its lock. II RNA. 2011. 17(9): 16 151 618.

160. Kendrew J.C., Bodo G., Dintzis H.M., Parrish R.G., Wyckoff H., Phillips D.C. A three-dimensional model of the myoglobin molecule obtained by X-ray analysis. // Nature. 1958. 181(4610): 662−666.

161. Muirhead H., Perutz M. Structure of hemoglobin. A three-dimensional Fourier synthesis of reduced human hemoglobin at 5.5 A resolution. II Nature. 1963. 199: 633−638.

162. Dolinnaya N.G., Zubin E.M., Kubareva E.A., Zatsepin T.S., Oretskaya T.S. Design and synthesis of 2'-functionalized oligonucleotides. Their application for covalent trapping the proteinDNA complexes. // Curr. Org. Chem. 2009. 13(11): 1029−1049.

163. Казанова Е. В. Производные нуклеиновых кислот, содержащие модифицированные звенья 2'-0-алкильного типа: 2'-аминокислотные и 2'-альдегидные олигонуклеотиды. // Дисс. канд. хим. наук. МГУ. Москва. 2010. 142 с.

164. Качалова А. В., Зубин Е. М., Орецкая Т. С. Методы синтеза олигонуклеотидов, содержащих реакционноспособные электрофильные группировки. // Успехи химии. 2002. 71(12): 1173−1192.

165. Ермолинский Б. С., Михайлов С. Н. Реакция периодатного окисления в химии нуклеиновых кислот. Диальдегидные производные нуклеозидов, нуклеотидов и олигонуклеотидов. // Биоорг. химия. 2000. 26(7): 483−504.

166. Baouz S., Woisard A., Sinapah S., Le Caer J.P., Argentini M., Bulygin K., Aguie' G., Hountondji C. The human large subunit ribosomal proteinL36A-like contacts the CCA end of P-site bound tRNA. // Biochimie. 2009. 91(11−12): 1420−1425.

167. Pfander S., Fiammengo R., Kirin S.I., Metzler-Nolte N., Jaschke A. Reversible site-specific tagging of enzymatically synthesized RNAs using aldehyde-hydrazine chemistry and protease-cleavable linkers. // Nucleic Acids Res. 2007. 35(4): e25.

168. Никольская И. И., Карташова И. М., Лопатина Н. Г. Ферменты новой системы хозяйской специфичности Sso47II. // Молекулярн. генетика. 1983.12(1): 5−10.

169. Achilles К., Kiedrowski G.V. Kinetic model studies on the chemical ligation of oligonucleotides viahydrazone formation. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2005.15(4): 1229−1233.

170. Ghosh S.S., Kao P.M., Kwoh D.Y. Synthesis of 5'-oligonucleotide hydrazide derivatives and their use in preparation of enzyme-nucleic acid hybridization probes. // Anal. Biochem. 1989. 178(1): 43−51.

171. Oshevski S.I. Concept of «Binary oligonucleotide reagent». // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 1998.17(9−11): 1969;1975.

172. Freier S.M., Altmann K.H. The ups and downs of nucleic acid duplex stability: structure-stability studies on chemically-modified DNA: RNA duplexes. // Nucleic Acids Res. 1997. 25(22): 4429−4443.

173. Gyi J.I., Lane A.N., Conn G.L., Brown T. Solution structures of DNA’RNA hybrids with purine-rich and pyrimidine-rich strands: comparison with the homologous DNA and RNA duplexes. //Biochemistry. 1998. 37(1): 73−80.

174. Карягина A.C. Структурно-функциональная характеристика систем рестрикции-модификации ДНК штамма Shigella sonnei 47. // Дисс. докт. биол. наук. ВНИИ РАСХН. Москва. 1997. 331 с.

175. Тедиашвили М. И., Упорова Т. М., Никольская И. И., Дебов С. С. Обнаружение системы хозяйской специфичности у шигелл. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1980. 90(9): 324 325.

176. Упорова Т. М., Карташова И. М., Скрипкин Е. А., Лопарева Е., Никольская И. И. Эндонуклеазы рестрикции из Shigella sonnei 47. // Вопросы медицинской химии. 1985. 31(2): 131−136.

177. Федотова E.A., Ян Ф., Кубарева Е. А., Романова Е. А., Проценко А. С., Вирясов М. Б., Гианик Т., Орецкая Т. С. Синтез и свойства модифицированных ДНК-фрагментов с включениями тимидингликоля. // Биоорг. химия. 2008. 34(2): 236−244.

178. Громова Е. С., Хорошаев А. В. Прокариотические ДНК-метилтрансферазы: структура и механизм взаимодействия с ДНК. //Молекуляр. биология. 2003. 37(2): 300−314.

179. Воробьева О. В., Карягина А. С., Волков Е. М., Вирясов М. Б., Орецкая Т. С., Кубарева Е. А. Анализ контактов метилтранеферазы SsoII с ДНК в фермент-субстратном комплексе. // Биоорг. химия. 2002. 28(5): 402−410.

180. Судьина А. Е., Зацепин Т. С., Пингоуд В., Пингоуд А., Орецкая Т. С., Кубарева Е. А. Аффинная модификация эндонуклеазы рестрикции SsoII ДНК-дуплексами, содержащими 2'-альдегидную группу. // Биохимия. 2005. 70(8): 1137−1144.

181. Романенков А. С., Устюгов А. А., Зацепин Т. С., Никулова А. А., Колесников И. В., Метелев В. Г., Орецкая Т. С., Кубарева Е. А. Анализ белково-нуклеиновых контактов в комплексах фактора транскрипции NF-кВ с ДНК. // Биохимия. 2005. 70(11): 1474−1487.

182. Романенков А. С. ДНК-дуплексы, содержащие реакционноспособные группировки в углеводофосфатном остове, как реагенты для аффиной модификации остатков цистеина и лизина белков. // Дисс. канд. хим. наук. МГУ. Москва. 2006. 156 с.

183. Shilov I., Tashlitsky V., Khodoun M., Vasil’ev S., Alekseev Y., Kuzubov A., Kubareva E., Karyagina A. DNA-methyltransferase SsoII interaction with own promoter region binding site. // Nucleic Acids Res. 1998. 26(11): 2659−2664.

184. Karyagina A.S., Alexeevski A.V., Golovin A.V., Spirin S.A., Vorob’eva O.V., Kubareva E.A. Computer modeling of complex of (C5-cytosine)-DNA methyltransferase SsoII with target and regulatory DNAs. // Biophysics. 2003. 48(Suppl. 1): 45−55.

185. Clamp J.R., Hough L. The periodate oxidation of amino acids with reference to studies on glycoproteins. //Biochem. J. 1965.94: 17−24.

186. Haynes S.R. // RNA-Protein Interaction Protocols. Humana Press. 1999. 481 p.

187. Wang Z, Wang X, Rana TM. Protein orientation in the Tat-TAR complex determined by psoralen photocross-linking. II J. Biol. Chem. 1996.271(29): 16 995−16 998.

188. Bochkareva E., Korolev S., Lees-Miller S.P., Bochkarev A. Structure of the RPA trimerization core and its role in the multistep DNA-binding mechanism of RPA. // EMBO. J. 2002. 21(7): 18 551 863.

189. Zhao X., Herr W. A regulated two-step mechanism of TBP binding to DNA: A solventexposed surface of TBP inhibits TATA box recognition. // Cell. 2002.108(5): 615−627.

190. Wenz C., Jeltsch A., Pingoud A. Probing the indirect readout of the restriction enzyme EcoKV. II J. Biol. Chem. 1996. 271(10): 5565−5573.

191. Kazantsev A.V., Krivenko A.A., Harrington D.J., Holbrook S.R., Adams P.D., Pace N.R. Crystal structure of a bacterial ribonuclease P RNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. 102(38): 13 392−13 397.

192. Moore M.J., Sharp P.A. Site-specific modification of pre-mRNA: the 2'-hydroxyl groups at the splice sites. II Science. 1992. 256(5059): 992−997.

193. Vioque A., Arnez J., Altman S. Protein-RNA interactions in the RNase P holoenzyme from Escherichia coll //J. Mol. Biol. 1988. 202(4): 835−848.

194. Talbot S.J., Altman S. Gel retardation analysis of the interaction between C5 protein and Ml RNA in the formation of the ribonuclease P holoenzyme from Escherichia coli. // Biochemistry. 1994. 33(6): 1399−1405.

195. Jeong J.H., Mok H., Oh Y.K., Park T.G. siRNA conjugate delivery systems. // Bioconjug. Chem. 2009. 20(1): 5−14.

196. Oh Y.K., Park T.G. siRNA delivery systems for cancer treatment. // Adv. Drug Deliv. Rev. 2009. 61(10): 850−862.

197. Lonnberg H. Solid-phase synthesis of oligonucleotide conjugates useful for delivery and targeting of potential nucleic acid therapeutics. // Bioconjug. Chem. 2009. 20(6): 1065−1094.

198. Hackenberger C.P., Schwarzer D. Chemoselective ligation and modification strategies for peptides and proteins. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2008. 47(52): 10 030−10 074.

199. Tiefenbrunn T.K., Dawson P.E. Chemoselective ligation techniques: modern applications of time-honored chemistry. // Biopolymers. 2010. 94(1): 95−106.

200. Moses J.E., Moorhouse A.D. The growing applications of click chemistry. // Chem. Soc. Rev. 2007.36(8): 1249−1262.

201. Hein C.D., Liu X.-M., Wang D. Click chemistry, a powerful tool for pharmaceutical sciences. HPharm. Res. 2008. 25(10): 2216−2230.

202. Hill K.W., Taunton-Rigby J., Carter J.D., Kropp E., Vagle K., Pieken W., McGee D.P.C., Husar G.M., Leuck M., Anziano D.J., Sebesta J.P. Diels-Alder bioconjugation of diene-modified oligonucleotides. II J. Org. Chem. 2001. 66(16): 5352−5358.

203. Kohn M., Breinbauer R. The Staudinger ligation a gift to chemical biology. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2004. 43(24): 3106−3116.

204. Hermanson G.T. // Bioconjugate Techniques, 2nd ed. Academic Press. San Diego. CA. 2008. P. 121−123.

205. Zatsepin T.S., Stetsenko D.A., Gait M.J., Oretskaya T.S. 2'-Hydrazine oligonucleotides: synthesis and efficient conjugation with aldehydes. // Nucleic Acids Symp. Ser. (Oxf). 2005. (49): 133−134.

206. Schwartz D.A. Solulink, US patent US 20 030 013 857 (Al). January 2003.

207. Singh Y., Defrancq E., Dumy P. New method to prepare peptide-oligonucleotide conjugates through glyoxylic oxime formation. II J. Org. Chem. 2004. 69(24): 8544−8546.

208. Katajisto J., Virta P., Lonnberg H. Solid-phase synthesis of multiantennary oligonucleotide glycoconjugates utilizing on-support oximation. // Bioconjug. Chem. 2004.15(4): 890−896.

209. Forget D., Boturyn D., Defrancq E., Lhomme J., Dumy P. Highly efficient synthesis of peptide-oligonucleotide conjugates: chemoselective oxime and thiazolidine formation. // Chem. Eur. J. 2001. 7(18): 3976−3984.

210. Belskaya N.P., Dehaen W., Bakulev V.A. Synthesis and properties of hydrazones bearing amide, thioamide and amidine functions. // ARKIVOC. 2010. 275−332.

211. Rivera-Lion R., Green C.J., Void B.S. High-level expression of soluble recombinant RNase P protein from Escherichia coli. II J. Bacteriol. 1995.177(9): 2564−2566.

212. Wegscheid B., Hartmann R.K. The precursor tRNA 3'-CCA interaction with Escherichia coli RNase P RNA is essential for catalysis by RNase P in vivo. IIRNA. 2006.12(12): 2135−2148.

213. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4. II Nature. 1970. 227(5259): 680−685.

214. Busch S., Kirsebom L.A., Notbohm H., Hartmann R.K. Differential role of the intermolecular base-pairs G292-C (75) and G293-C (74) in the reaction catalyzed by Escherichia coli RNase P RNA. II J. Mol. Biol. 2000. 299(4): 941−951.

215. Wegscheid B., Hartmann R.K. In vivo and in vitro investigation of bacterial type B RNase P interaction with tRNA 3'-CCA. II Nucleic Acids Res. 2007. 35(6): 2060;2073.

216. Schagger H., von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. II Anal. Biochem. 1987. 166(2): 368 379.