Новый метод создания нормализованных библиотек КДНК с использованием дуплекс-специфической нуклеазы камчатского краба

ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Описание кинетики процесса реассоциации нуклеиновых кислот в растворе. Подходы к созданию нормализован! 1ых библиотек. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ1. 1. Экспрессия генов в эукариотической клетке. Проверка пригодности ДСН для изоляции оц- ДНК из смеси нуклеиновых кислот. Способы отделения одноцепочечной фракции нормализованных молекул к ДНК. Создание нормализованных библиотек для направленного… Читать ещё >

Новый метод создания нормализованных библиотек КДНК с использованием дуплекс-специфической нуклеазы камчатского краба (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Содержание

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
- 1. 1. Экспрессия генов в эукариотической клетке
- 1. 2. подходы к поиску дифференциально экспрессирующихся генов и определению характерных профилей экспрессии
- 1. 3. подходы к поиску редких генов и крупномасштабные проекты по секвенированию
- 1. 4. подходы к созданию нормализован! 1ых библиотек
- 1. 5. описание кинетики процесса реассоциации нуклеиновых кислот в растворе
- 1. 6. Способы отделения одноцепочечной фракции нормализованных молекул к ДНК
ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
- 2. 1. ДСН
- 2. 2. проверка пригодности ДСН для изоляции оц- ДНК из смеси нуклеиновых кислот
- 2. 3. Создание нормализованных библиотек кДНК
- 2. 4. модельный эксперимент-создание нормализованной библиотеки КДНК из скелетной мышцы человека
- 2. 5. проверка воспроизводимости метода- создание нормализованных библиотек из КДНК различных тканей человека
- 2. 6. создание нормализованной библиотеки КДНК из нейронов АРЕУ51А са1лроим1са
- 2. 7. Создание нормализованных библиотек для направленного клонирования
- 2. 8. Направленное удаление определенных последовательностей

Одним из самых значительных достижений науки XX века стала расшифровка генома человека, и научное сообщество оказалось перед лицом новых глобальных проектов. В настоящее время значительные силы тратятся на секвенирование геномов животных, растений и микроорганизмов. Однако создание каталога генов и карты их расположения на хромосомах не раскрывает принципов функционирования генома. Даже вопрос о количестве генов человека до сих пор остается открытым.

Среди основных направлений современных масштабных исследований функционирования генома можно назвать проекты по выявлению всех экспрессиругащихся в организме последовательностей (EST, от английского expressed sequence tag) — исследования профилей экспрессии генов и проекты, посвященные экспрессионному клонированию, когда в ходе функционального скрининга экспрессируемых библиотек кДНК идентифицируют гены, отвественные за определенный клеточный фенотип (в частности гены-мишени для лекарственных препаратов).

Все указанные типы проектов сталкиваются со значительными трудностями, связанными с гетерогенностью популяций мРНК, экспрессирующихся в клетке и большими различиями в уровне представленности различных типов мРНК. Эффективным решением проблем, связанных с необходимостью анализа чрезвычайно большого количества клонов для исчерпывающего изучения библиотеки является нормализация библиотеки кДНК (выравнивание уровня представленности различных генов в библиотеке).

Несмотря на то, что за последние 15 лет был разработан целый ряд методов создания нормализованных библиотек кДНК, все они имеют существенные недостатки. Основная цель данной работы состояла в разработке нового метода нормализации библиотек кДНК, который лишен недостатков уже существующих методов, сочетает в себе простоту и эффективность и может быть применен при решении самых разнообразных задач.

выводы.

Показана возможность изоляции одноцепочечной ДНК из смеси с двуцепочечной ДНК и гетеродуплексами ДНК/РНК при помощи дуплекс-специфической нуклеазы из гепатопанкреаса камчатского краба. Показана высокая специфичность ДСН по отношению к дцДНК.

Предложен новый метод, позволяющий создавать библиотеки кДНК обогащенные полноразмерными последовательностями с приблизительно равной представленностью всех видов транскриптов. В серии модельных экспериментов показана высокая эффективность и хорошая воспроизводимость метода. С использованием предложенного метода создана нормализованная библиотека кДНК из гигантских метацеребральных клеток Ар1у$ 1а саН/огтса. Анализ результатов секвенирования полученной библиотеки кДНК подтвердил высокую эффективность разработанного метода.

Разработана модификация метода, позволяющая существенно упростить поиск новых генов путем функционального скрининга с помощью удаления известных нуклеотидных последовательностей из анализируемых библиотек кДНК.

Показать весь текст

Список литературы

Akowitz A, Manuelidis L. A novel cDNA/PCR strategy for efficient cloning of small amounts of undefined RNA. Gene, 1989- 81: 295−306.
Antequera F, Bird A. Number of CpG islands and genes in human and mouse. Proc Natl AcadSci USA., 1993- 90: 11 995−11 999.
Ayoubi ТА, Van De Ven WJ. Regulation of gene expression by alternative promoters. FASEBJ., 1996- 10:453−460.
Bals R, Jany Identification of disease genes by expression profiling. Eur Respir J, 2001- 18: 882−889.
Balzer HJ, Baumlein H. An improved gene expression screen. Nucleic Acids Res., 1994- 22: 2853−2854.
Belyavsky A, Vinogradova T, Rajewsky K. PCR-based cDNA library construction: general cDNA libraries at the level of a few cells. Nucleic Acids Res., 1989- 17: 29 192 932.
Bertioli D, Schlichter U, Adams M, Burrows P, Steinbis H, Antoniw J. An analysis of differential display shows a strong bias towards high copy number mRNAs. Nucleic Acids Res., 1995−23:4520−4523.
Bishop JO, Morton JG, Rosbash M, Richardson M Three abundance classes in HeLa cell messenger RNA. Nature, 1974- 250: 199−204.
Bonaldo MF, Lennon G, and Soares MB. Normalization and subtraction: Two approaches to facilitate gene discovery. Genome Res., 1996- 6: 791−806.
Britten RJ, Kohne DE. Repeated sequences in DNA. Hundreds of thousands of copies of DNA sequences have been incorporated into the genomes of higher organisms. Science, 1968- 161:529−540.
Caetano AR, Johnson RK, Pomp D. Generation and sequence characterization of a normalized cDNA library from swine ovarian follicles. Mamm Genome, 2003- 14: 65−70.
Chenchik A, Zhu YY, Diatchenko L, Li R, Hill J, Siebert PD. Generation and use of high-quality cDNA from small amounts of total RNA by SMART PCR. In Gene cloning and analysis by RT-PCR. BioTechniques Books, MA- 305−319.
Davidson E, Britten R. Regulation of gene expression: possible role of repetitive sequences. Science, 1979- 204: 1052−1059.
Draper MP, August PR, Connolly T, Packard B, Call KM. Efficient cloning of full-lengthcDNAs based on cDNA size fractionation. Genomics, 2002- 79: 603−607.
Duguid J. R., Rohwer R. G. and Seed B. Isolation of cDNAs of scrapie-modulated RNAsby subtractive hybridization of a cDNA library. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988- 85:5738−5742.
Edery I, Chu LL, Sonenberg N, Pelletier J. An efficient strategy to isolate full-length cDNAs based on an mRNA cap retention procedure (CAPture). Mol Cell Biol., 1995- 15: 3363−3371.
Engler-Blum G, Meier M, Frank J, Muller G. Reduction of background problems in nonradioactive Northern and Southern blot analysis enables higher sensitivity then 32P-based hybridizations. Anal. Biochem, 1993- 44: 235−244.
Fields C, Adams MD, White O, Venter JC. How many genes in the human genome? Nat Genet., 1994- 7: 345−346.
Franz O, Bruchhaus II, Roeder T. Verification of differential gene transcription using virtual northern blotting. Nucleic Acid. Res, 1999- 27, e3.
Galau GA, Klein WH, Britten RJ, Davidson EH. Significance of rare m RNA sequences in liver. Arch. Biochem. Biophys., 1977- 179: 584−599.
Hampsey M. Molecular genetics of the RNA polymerase II general trancriptional machinery. Microbiol Mol Biol Rev 1998- 62: 465−503.
Harrington CA, Rosenow C, Retief J. «Monitoring gene expression using DNA microarrays» Curr Opin Microbiol., 2000- 3: 285−291.
Kato K. RNA fingerprinting by molecular indexing. Nucleic Acids Res., 1996- 24: 394 395.
Kato S, Sekine S, Oh SW, Kim NS, Umezawa Y, Abe N, Yokoyama-Kobayashi M, Aoki
T. Construction of a human full-length cDNA bank. Gene, 1994- 150: 243−250.
Kim AS. Clinical impact of gene expression profiling on oncology diagnosis, prognosis, and treatment. Comb Chem High Throughput Screen., 2004- 7: 183−206.
Ko MS. An 'equalized cDNA library' by the reassociation of short double-strandedcDNAs. Nucleic Acids Res., 1990- 18: 5705−5711.
Kohne D, Levison S and Byers M. Room temperature method for increasing the rate of DNA reassociation by many thousandfold: the phenol emulsion reassociation technique. Biochemistry, 1977- 16: 5329.
Madden SL, Wang CJ, Landes G. Serial analysis of gene expression: from gene discovery to target identification. Drug Discov Today 2000- 5: 415−425
Roses AD. Pharmacogenetics and the practice of medicine. Nature, 2000- 405: 857−865. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. N. Y., Cold Spring Harbor, 1989.
Sargent T, Dawid IB. Differencial gene expression in the gastrula of Xenopus laevis. Science, 1983- 222:135−139.
Sasaki YF, Dai Ayusawa and Michio Oishi «Construction of a normalized cDNA library by introduction of a semi-solid mRNA-cDNA hybridization system» Nucleic Acids Res., 1994- 22:987−992.
Shagin DA, Lukyanov KA, Vagner LL, Matz MV. Regulation of average length of complex PCR product. Nucleic Acids Res., 1999- 27(18): e23.
Snider BJ, Morrison-Bogorad M. Brain non-adenylated mRNAs. Brain Res Rev. 1992- 17: 263−282.
Soares M, Bonaldo M, Jelene P, Su L, Lawton L, and Efstratiadis A. Construction and characterization of a normalized cDNA library. Proc. Natl. Acad. Sci., 1994- 91: 92 289 232.
Spiess AN, Ivell R. «A highly efficient method for long-chain cDNA synthesis using trehalose and betaine» Anal Biochem., 2002,301: 168−174.
Suzuki H, Yaoi T, Kawai J, Hara A, Kuwajima G, Wantanabe S. Restriction landmark cDNA scanning (RLCS): a novel cDNA display system using two-dimensional gel electrophoresis. Nucleic Acids Res., 1996- 24: 289−294.
Suzuki Y, Yoshitomo-Nakagawa K, Maruyama K, Suyama A, Sugano S. Construction and characterization of a full length-enriched and a 5'-end-enriched cDNA library. Gene, 1997- 200: 149−156.
Tanaka T, Ogiwara A, Uchiyama I, Takagi T, Yazaki Y, and Nakamura Y. Construction of a normalized directionally cloned cDNA library from adult heart and analysis of 3040 clones by partial sequencing. Genomics, 1996- 35: 231−235.
Timberlake WE. Developmental gene regulation in Aspergillus nidulans. Dev. Biol., 1980- 78: 497−500.
Timblin C, Battley J, Kuehl WH. Application of PCR technology to subtractive cDNA cloning: identification of genes expressed specifically in murine plasmacytoma cells. Nucl. Acids Res., 1990- 18: 1587−1593.
Travis GH and Sutcliffe JG. Phenol emulsion-enchanced DNA-driven subtractive cDNAcloning: Isolation of low-abundance monkey cortex-specific mRNA. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1988- 85: 1696−1700. /.
Urmenyi TP, Bonaldo MF, Soares MB, Rondinelli E. Construction of a normalized cDNA library for the Trypanosoma cruzi genome project. J Eukaryot Microbiol., 1999- 46: 542 544.
Velculescu VE, Zhang L, Vogelstein B, Kinzler KW. Serial analysis of gene expression. Science, 1995- 270: 484−487.
Wang Z, Brown DD. A gene expression screen. Proc.Natl. Acad. USA, 1991- 88: 1 150 511 509.
Warrington JA, Archana N, Mamatha M, Tsyganskaya M. Comparision of human adult and fetal expression and identification of 535 hosekeeping/maintenance genes. Physiol Genomics, 2000- 2: 143−147.
Weissman SM. Molecular genetic techniques for mapping the human genome. Mol Biol Med., 1987- 4: 133−143.
Welsh J, Chada K, Dalai SS, Cheng R, Ralph D, McClelland M. Arbitrarily primed PCR fingerprinting of RNA. Nucleic Acids Res., 1992- 20: 4965−4970.

Заполнить форму текущей работой