Белки пшеничного зерна, образующие клейковину, отличаются от запасных белков семян других злаков, прежде всего своими уникальными реологическими свойствами. В зависимости от сорта и условий выращивания пшеницы в зерне формируются белковые комплексы клейковины с очень разными физико-химическими и реологическими свойствами, совокупность которых принято обозначать технологическим термином «качество клейковины». Выделенная из пшеничной муки обычными методами клейковина содержит 80−85% белка, 10−15% углеводов и 2−8% лииидов (Вакар, 1961). В клейковине высокого качества содержание SS-связей на 22.
31% выше (Кретович, Вакар, 1974). Разнокачественность клейковины у сортов пшениц связана с содержанием и соотношением в ней SS-связей и SI 1-групп (Кретович, 1987, 1991; Труфанов и др., 1993). Существующая в зерновках пшеницы специфическая система ферментов тиол-дисульфидного метаболизма катализирует образование, распад и изомеризацию (перегруппировку) SS-связей в запасных белках, т. е. имеет прямое отношение к созданию SM/SS-статуса запасных белков и, следовательно, к формированию структур!, I белкового комплекса клейковины (Труфанов,.
1994).
В этом отношении представляют интерес данные о функционировании в зерновке пшенице системы НАДФН-зависимой тиоредоксинредуктазы (Suskc et al., 1979; Kobrehel et al., 1992; Wong et al., 1996), НАДФН-зависимой иротеиидисульфид оксидоредуктазы (Hatch et al., 1960; Горпинчснко и др., 1972, 1975), глутатион-зависимой протеиндисульфид оксидоредуктазы (Кузнецов, Труфанов, 1981; Труфанов, Кичатинова, 1989), восстанавливающих SS-связи в запасных белках пшеницы, и НАДФНзависимой глутатионредуктазы, восстанавливающей SS-связи окисленного глутатиона (Проскуряков, Зуева, 1963, 1964; Lascano et. al., 2001). НАДФНзависимая протеин-дисульфид изомераза катализирует перегруппировку в белках термодинамически напряженных SS-связей (Grynberg et al., 1977; Shimoni et al., 1995; Galili et al., 1996).
Имеются сведения об участии линоксигеназы в образовании SS-связей в запасных белках пшеницы путем опосредованного окисления SH-групп перекисями и гидроперекисями ненасыщенных жирных кислот (Кретович, 1991; Shiiba, 1991).
Ферментативное окисление сульфгидрильных групп запасных белков может происходить с помощью кислород-зависимых тиолоксидаз (Труфанов и др., 1989), подобных тиолоксидазам животных клеток (Lash, Jones, 1984, 1986). Участие в тиол-дисульфидных реакциях в запасных белках пшеницы могут принимать также глутатионтрансфераза (Pascal et al., 1988) и глугатион-зависимая дегидроаскорбат оксидоредуктаза (Every, 1996; De Gara et al., 2002).
Таким образом, в зерновке пшеницы одновременно функционирует сложная система специфических ферментов, относящихся к классу оксидоредуктаз и регулирующих SH/SS-статус белков в клетке. Катализируя образование, распад пли перегруппировку термодинамически напряженных SS-связей и обеспечивая оптимальный уровень низкомолекулярных тиолоиых кофакторов (например, глутатионредуктаза), эти ферменты участвуют в регуляции процессов тиол-дисульфидного обмена в зерновках in vivo.
Одни из этих ферментов изучены более хорошо, другие недостаточно. Так, протеин-дисульфид редуктаза, катализирующая восстановление SS-связей в белках, слабо изучена в объектах растительного происхождения. Линоксигеназа, наоборот, являясь многофункциональным ферментом, часто привлекает внимание исследователей.
Цель настоящей работы заключалась в изучении физиолого-биохимических аспектов регуляции тиол-дисульфидного обмена в развивающейся зерновке пшеницы на примере трех ферментов: протеин-дисульфид редуктазы, глутатионредуктазы и липоксигеназы участвующих в создании БМ/БЗ-статуса запасных белков.
Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Изучить динамику протеин-дисульфид редуктазной активности и содержание небелковых БН-групп в процессе созревания зерновки пшеницы.
2. Выделить в гомогенном состоянии протеин-дисульфид редуктазу пшеницы с использованием методов солевого фракционирования, колоночной хроматографии и электрофореза в ПААГ.
3. Изучить биохимические характеристики очищенного фермента.
4. Изучить компонентный состав ферментного экстракта методами нативного и денатурирующего электрофореза в пластинках ПААГ.
5. Выявить молекулярные формы исследуемых ферментов в созревающей зерновке пшеницы.
6. Изучить особенности проявления активности липоксигеназы у разнокачественных сортов и линий пшеницы с межсортовым замещением хромосом 4 и 5 гомеологических групп.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, главы с результатами и их обсуждением, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 150 страницах машинописного текста, включая восемь таблиц и 32 рисунка.
Список литературы
включает 246 наименований, из них 46 на русском языке.
выводы.
1. В созревающей зерновке пшеницы одновременно присутствуют липоксигеназа, способная окислять SII-группы белков и системаНАДФН, НАДФН-зависимая глутатиоиредуктаза, глутатиои и протеин-дисульфид редуктаза — катализирующая реакции восстановления SS-связей в белковых молекулах и регенерацию окисленного глутатиона.
2. Из зерновок пшеницы выделен в гомогенном состоянии фермент с тиол: протеиндисульфид оксидоредуктазной активностью, подобный глутатион: инсулин трансгидрогеназе из животных и микробиологических объектов.
3. Протеин-дисульфид редуктаза пшеницы имеет коистаиту Михаэлиса-Меитои 2.18 мкМ для инсулина и 570 мкМ для БСА. Фермент имеет оптимум рН от 6.5 до 7.5 (max 7.0), а температуры от 33 до 38 С° (шах 36 С0). Молекулярная масса фермента, состоящего из двух субъединиц с молекулярной массой 73 и 77 кДа, составляет 167 кДа.
4. Динамика активности протеин-дисульфид редуктазы в ходе развития зерновки пшеницы тесно коррелирует с активностью глутатионредуктазы (г = 0.76), а также с содержанием в запасных белках SS-связей и SH-групп.
5. В модельных экспериментах in vitro протеии-дисульфид редуктаза оказывает существенное влияние на SH/SS-баланс в белковом комплексе клейковины, изменяя агрегирующую способность запасных белковсилу муки, упругость, растяжимость, устойчивость и величину P/L. При этом степень изменений зависит от генотииических особенностей пшеницы и сорта муки.
6. В зерновках мягкой яровой пшеницы полной спелости, вероятно, присутствуют три молекулярные формы протеин-дисульфид редуктазы и две — глутатионредуктазы. Установлено, что специфическая активность протеин-дисульфид редуктазы не зависит от типа глутатионредуктазы.
В зерновках мягкой яровой пшеницы различных сортов и линий с межсортовым замещением хромосом присутствуют 3 формы лииоксигеназы, различающиеся поверхностным зарядом молекулы. Наибольший вклад в проявление активности липоксигеназы оказывают структурные гены, локализованные на хромосомах 4А и 5А.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
.
В результате проведенных экспериментов по изучению тиол-дисульфидного обмена в запасных белках зерновки пшеницы, установлено, что в регуляции этого процесса решающее значение имеют тиоловые кофакторы, такие как глутатион, выполняющий донорно-акценторные функции в ферментативном катализе при расщеплении ЗБ-связей. Глутатион-зависимая протеин-дисульфид редуктаза проявляет наибольшую активность в присутствии восстановленного глутатиоиа, регенерация которого происходит с помощью глутатионредуктазы, расщепляющей окисленный глутатион. При исследовании серии генотипически различных сортов мягкой яровой пшеницы выявлена тесная сопряженность содержания низкомолекулярных БН-соединений (восстановленного глугатиона) с активностью протеин-дисульфид редуктазы. При этом на физиологически разных стадиях развития зерновки у различных сортов наблюдалась однотипная зависимость. С фазы формирования зерновок начинался интенсивный синтез низкомолекулярных БН-соединений, в основном Г-БНтиолового кофактора ферментативного восстановления ББ-связей в белках. В ходе дальнейшего развития зерновки количество низкомолекулярных БН-соединений возрастало и на стадии молочной спелости (при влажности зерновки около 50%) достигало максимума, а с наступлением фазы тестообразной спелости содержание низкомолекулярных БН-груин снижалось параллельно со снижением протеин-дисульфид редуктазной активности. Интенсивное образование небелковых БН-соединепий сопровождалось увеличением активности протеин-дисульфид редуктазы, при этом максимум содержания тиоловых кофакторов совпадал с максимумом БЗ-редуктазной активности. Наличие сильной корреляционной связи (г=0.76) свидетельствует о важной роли глутатионредуктазы в регуляции нрогеин-дисульфид редуктазной функции фермента, т. е. о функциональной взаимосвязи этих ферментов в процессах создания и регуляции SII/SS-статуса запасных белков.
Эксперименты по очистке протеин-дисульфид редуктазы из зерновок пшеницы методами дробного фракционирования сульфатом аммония, ионообменной хроматографии на ДЕЛЕ А-50, позволили очистить этот фермент до электрофоретически чистого состояния. В результате были изучены некоторые биохимические характеристики и свойства протеин-дисульфид редуктазы пшеницы и сопоставлены с аналогичными по функциям ферментами. Так при молекулярной массе нативного белка 167 кДа и субъединичиому составу 73 и 77 кДа, протеин-дисульфид редуктаза пшеницы отличается от подобных ферментов из других объектов. По молекулярной массе протеин-дисульфид редуктаза не является протеин-дисульфид изомеразой (57 кДа (Freedman et al., 1994) и 60 кДа (Shimoni et al., 1995)), и тиоредоксииредутазой (35 кДа (Kobrehel et al., 1992)), способных, по литературным данным также восстанавливать SS-связи в запаенглх белках зерновки пшеницы. По субстратной специфичности фермент близок к тиол: нротеиндисульфид оксидоредуктазам из различных объектов, способен катализировать инактивацию инсулина путем восстановления SS-мостиков между Аи В-цепочками белка, ио имеет различие в константе Михаэлиса-Ментона. По оптимуму рН 7.0 фермент близок протеин-дисульфид редуктазе из холерного вибриона (Ruddock et al., 1996), а оптимуму температуры 36°Ск ферментам из животных объектов (Carmichael et al., 1979).
При действии протеин-дисульфид редуктазы на уксуснорастворимую фракцию клейковинных белков пшеницы выявлено снижение агрегирующей способности при внесении фермента, но сравнению с контролем. Различие в величине показателя агрегации Тю/С между контролем и опытом составляла в среднем от 15 до 22%. Показатель агрегации Тю/С (за 10 мин процесса) контроля составлял 134.1 ± 4.6 при опыте 114.6 ± 1.2, что говорит о снижении агрегирующей способности клейковинных белков при добавлении фермента. На примере двух сортов разного качества — Granmulino и Мироновская 808 показано изменение физических свойств теста даже при слабом действии протеин-дисульфид редуктазы (малое соотношение фермент/субстрат).
На основе полученных результатов можно предположить, что в зерновках пшеницы (Triticum ciestivum L.) одновременно с двумя системами ферментативного восстановления SS-связей в запасных белках пшеницыПАДФН, НАДФН-зависимая тиоредоксинредуктаза, тиорсдоксин и НАДФН, НАДФН-зависимая глутатионредуктаза, глутатион и глутаредоксин (Rouhier et al., 2002), существует третья система — НАДФН, НАДФН-зависимая глутатионредуктаза, глутатион и протеин-дисульфид редуктаза (рис.32).
Рис. 32. Гипотетическая схема восстановления SS-связей в белках 11 ротеи н-ди сул ьфид реду ктазой.
GR-глутатионредуктазаRED-протеин-дисульфид редуктаза.
Как уже отмечалось, наш интерес к липоксигеназе обусловлен, прежде всего, участием этого фермента в образовании оксидных радикалов, способных окислять in vivo SH-группы запасных белков пшеницы с образованием внутрии межмолекулярных дисульфидных связей, стабилизирующих белковый комплекс клейковины. Это обстоятельство имеет важное значение при разработке теоретических основ для создания новых генотипов (сортов) пшеницы методами хромосомной инженерии. Действительно, межсортовое замещение определенных хромосом у высокобелковых, но с низким качеством клейковины сортов реципиентов, на гомологичные хромосомы высококачественных сортов доноров, несущих основные структурные и/или регуляторные гены липоксигеназы, перспективно для обогащения реципиентов этим ферментом и улучшения реологических показателей теста и качества клейковины на уровне copra.
На примере неродственных сортов мягкой яровой пшеницы Саратовская 29 и Janetzkis Probat и их линий с межсортовым замещением отдельных пар хромосом 4-й и 5-й гомсологических групп нами были изучены вклады хромосом 4А, 4 В, 4D, 5А, 5 В и 5D в проявление активности липоксигеназы. В результате исследований было установлено, что наибольшее влияние на проявление удельной активности липоксигеназы оказывают структурные гены, локализованные на хромосомах 4А и 5А. Однако, учитывая то, что регуляция активности данного фермента носит полигенный характер (Li et al., 1999), возможно важную роль играют также гены-регуляторы, расположенные на других хромосомах.
Снижение удельной активности липоксигеназы при замещении хромосом 4 В, 4D, 5 В и 5D, вероятно, объясняется тем, что хромосомы сорта-донора Janetzkis Probat несут такие аллели липоксигеназы, которые не могут компенсировать активности соответствующих аллелей сорта-реципиента Саратовская 29. Имеются данные, что суммарная генетическая активность липоксигеназы у сорта обеспечивается генами шестью хромосом 4 и 5 гомсологических групп (Li et al., 1999). При замещении отдельных пар хромосом, естественно, нарушается этот генетически сбалансированный комплекс. Тем не менее, исходя из полученных результатов, при создании генотипов с высокой активностью фермента следует учитывать основополагающую роль хромосом 4А и 5А.
При исследовании ферментных экстрактов электрофоретическими методами с селективным окрашиванием в ПААГ нами обнаружено наличие грех, отличающихся по заряду форм липоксигеназы как у разных сортов (Permyakov et al., 2002), так и у замещенных линий по хромосомам 4 и 5 гомсологических групп (Пермяков и др., 2000).
