Молекулярно-генетический анализ структуры природной популяции Sinorhizobium meliloti Европейско-Сибирского генцентра люцерны

Актуальность темы

Клубеньковые бактерии (ризобии) — микроорганизмы, фиксирующие в симбиозе с бобовыми растениями молекулярный азот атмосферы. В настоящее время ризобии являются одним из наиболее изученных биологических объектов. Интерес к ризобиям вызван, во-первых, сельскохозяйственной значимостью симбиотической азот-фиксации, во-вторых, тем, что бобово-ризобиальный симбиоз является одним из наиболее интересных видов растительно-микробного взаимодействия. Изучение этого взаимодействия может дать ответ на целый ряд вопросов, касающихся процессов, ответственных за формирование генетического разнообразия природных популяций микроорганизмов и их эволюцию.

Одним из наиболее эффективных подходов к изучению природных популяций бактерий является анализ их генетического разнообразия, результатом которого может явиться понимание процессов возникновения новых генотипов (мутации, генетические перестройки, горизонтальный перенос генов) и процессов, определяющих судьбу генотипов в популяции (отбор, конкуренция, миграция штаммов, генетический дрейф). К настоящему времени большое число природных популяций ризобий охарактеризовано с использованием изоферментного анализа. Проанализированы основные параметры популяционной структуры — гетерогенность популяции и неравновесие по сцеплению хромосомных генетических маркеров. Анализ факторов, определяющих генетический полиморфизм ризобий, показал, что растение-хозяин является ключевым фактором как для динамики ризобий в природных популяциях (поддержание численности и стабильности ризобий), так и для увеличения их генетического разнообразия.

В настоящее время для характеристики ризобий широко используются различные методы анализа ДНК. Преимущество этих методов состоит в том, что они позволяют получать стабильные характеристики, независящие от физиологического статуса микроорганизма, более тесно связанные с генотипом и позволяющие анализировать любые участки ризобиального генома. С помощью методов анализа ДНК впервые стало возможным проанализировать участки генома, содержащие симбиотические гены, изучение которых было невозможно с использованием других методов. Анализ симбиотических участков генома ризобий особенно важен для выявления роли растения-хозяина в процессах формирования генетической структуры природных популяций клубеньковых бактерий. Представляет большой интерес использовать методы анализа ДНК для изучения основных параметров популяции — гетерогенности и неравновесия по сцеплению между хромосомными и плазмидными маркерами. Однако работы, сочетающие использование методов анализа ДНК с эффективными методическими подходами к анализу популяционной структуры и процессов, ее определяющих, единичны.

Цель и задачи исследования

Целью нашей работы являлся молекулярно-генетический анализ популяции S. meliloti Европейско-Сибирского генцентра люцерны. В задачу исследований входило:

— выделить природные штаммы клубеньковых бактерий люцерны на двух удаленных участках из-под растений-хозяев двух различных видов — дикорастущих люцерны и донника, входящих в группу перекрестной инокуляции люцерны;

— определить видовую принадлежность штаммов с помощью рестрикционного анализа гена 16SpPHK;

— изучить генетическое разнообразие популяции с помощью RFLP-анализа 5 участков генома (leu, г ее, А — хромосома- /ioe/DIABC, nodDl — мегаплазмида-1- ехр — ме-гаплазмида-2), анализа плазмидного состава штаммов и геномного ISi? m2011;2 фингерпринтинга;

— изучить влияние растения-хозяина и географического происхождения штаммов на генетическое разнообразие популяции клубеньковых бактерий люцерны;

— с использованием современных статистических методов оценить основные параметры генетической структуры популяции — гетерогенность и неравновесие по сцеплению между RFLP-типами.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые:

— изучена природная популяция клубеньковых бактерий S. meliloti, относящаяся к Ев-ропейско-Сибирскому генцентру люцерны. 56 природных штаммов S. meliloti охарактеризованы с использованием метода RFLP, анализа состава криптических плазмид и ISi? w2011 -2-фингерпринтинга;

— в геноме S. meliloti выявлен участок (фрагмент симбиотической плазмиды, содержащий гены лойЮ1АВС), структура которого существенно различается у штаммов, выделенных из-под донника и люцерны;

— с помощью метода RFLP определены основные параметры структуры изученной популяции: гетерогенность популяции по пяти различным участкам ризобиального генома (leu, reck. — хромосомаnodDIABC, nodD2 — мегаплазмида-1- ехр — мега-плазмида-2) и неравновесие по сцеплению между RFLP-типами;

— показано, что хромосомные гесА. RFLP-типы и Sym-плазмидные ио<�Ю1АВС и nodD2 RFLP-типы ассоциированы у штаммов данной популяции случайным образом, на основании чего сделан вывод о возможности переноса симбиотических плазмид между штаммамипоказано, что в данной популяции существуют две генетически обособленные группы штаммов, контрастно различающихся по ряду молекулярно-генетических признаков: leu RJFLP-типу, наличию криптических плазмид, числу копий ISi? m2011;2-элемента.

Практическая значимость.

— Установлено, что методом, позволяющим наиболее точно идентифицировать штаммы S. meliloti, является ISi? m2011;2-фингерпринтинг, обладающий большой разрешающей способностью. Данный метод может быть использован для идентификации и мониторинга штаммов 5. meliloti.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на 1-ом Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов, 1994), 1st European nitrogen fixation conference (Szeged, Hungary 1994), 10th International congress on nitrogen fixation (St.Petersburg, 1995), 2nd European nitrogen fixation conference and NATO advanced research workshop (Poznan, Poland, 1996), 2-ом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, 2000).

ВЫВОДЫ.

— Проведен молекулярно-генетический анализ 56 симбиотически активных штаммов S. meliloti, выделенных в Европейско-Сибирском генцентре люцерны. По результатам RFLP-анализа по участкам leu, гесА, ехр, шсЮ1АВС и посЮ2 ризобиального генома выявлено 24 RFLP-генотипа. На основании анализа состава криптических плазмид выявлено 11 плазмидных типов. По результатам IS-типирования выявлено 42 ISi? m2011;2-фингерпринта.

— Показано, что главным фактором, определяющим генетическое разнообразие данной популяции, является растение-хозяин. Различия между штаммами, выделенными из-под различных растений-хозяев (D=0,15- Р<0,01), по результатам RFLP-анализа, более существенны, чем различия между штаммами, выделенными на различных участках (D=0,07- Р<0,05). Штаммы, выделенные из-под различных растений-хозяев, достоверно различаются по составу крип-тических плазмид (х2=23,74- df=8- Р<0,01), в то время как между штаммами, выделенными на различных участках, не выявлено различий по данному признаку (%2=8,07- df=8- РОД).

Штаммы, выделенные из-под донника, имеют четкие отличия от штаммов, выделенных из-под люцерны, по структуре симбиотического участка генома, на котором локализованы гены nodDl ABC (D-0,52- Р<0,005).

Показано, что у штаммов S. meliloti наиболее гетерогенными являются сим-биотические участки генома nodD 1АВС (Н=0,78) и nodDl (Н=0,66), в то время как гетерогенность по участкам leu, гесА (хромосома) и ехр (мегаплазми-да-2) значительно меньше (Н= 0,51- 0,42 и 0,52, соответственно). Анализ неравновесия по сцеплению с учетом всех 5 участков генома показал, что популяция характеризуется высоким значением индекса ассоциации (1д=1,42±-0,04), что свидетельствует о небольшом вкладе рекомбинантных генотипов в структуру популяции. Однако поскольку RFLP-типы в парах гесА-nodDXABC и recA-nodD2 ассоциациированы случайным образом (Р=0,53 и 0,24, соответственно), это указывает на то, что имел место перенос симбиоти-ческой плазмиды между штаммами.

Показано, что в данной популяции имеется две группы штаммов «I» (26 штаммов) и «II» (30 штаммов), контрастно различающихся по ряду молеку-лярно-генетических признаков: RFLP-типу (в первой группе представлены штаммы leu RFLP-типа «а», во второй — leu RFLP-типа «b») — наличию крип-тических плазмид (в первой группе только один штамм (4%) не содержит криптических плазмид, во второй — 12 штаммов (40%)) — числу копий ISi! w2011;2-элемента (в первой группе среднее число копий ISi? w2011;2 составило 13,3±0,6, во второй — 6,5±0,7). Анализ неравновесия по сцеплению между RFLP-типами свидетельствует о том, что перенос Sym-генов имел место только между штаммами, принадлежащими к одной группе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Заключая настоящий обзор, отметим, что молекулярные методы дают уникальную возможность всестороннего анализа природных популяций клубеньковых бактерий — генетической структуры и основных ее параметровфакторов, определяющих генетический состав популяциипроцессов, обуславливающих возникновение новых генотипов и их судьбу в популяции. К преимуществам молекулярных методов необходимо отнести их универсальность — с их помощью может быть охарактеризован как небольшой участок генома, так и геном в целом. Что особенно важно, молекулярные методы дают возможность проанализировать любые участки геномане только хромосомные, но и симбиотические. Такие преимущества уже реализуются в современных исследованиях. Так, при использовании изоферментного анализа было показано, что природные популяции ризобий гетерогенны, однако оставалась неизвестной гетерогенность популяций по симбиотическим участкам генома. Последние исследования показали, что симбиотические участки, по всей видимости, более гетерогенны, чем хромосомные — и этот факт весьма важен для понимания механизмов эволюции клубеньковых бактерий. Ранее на основании результатов изоферментного анализа было показано, что структура природных популяций клубеньковых бактерий в основном клональна. Однако теперь появилась возможность проанализировать неравновесие по сцеплению не только между хромосомными, но и Sym-плазмидными маркерами. Такие исследования показали, что симбиотические маркеры гораздо более подвижны, чем хромосомные. Наконец, целый ряд ранее полученных результатов, указывал на то, что растение-хозяин является важнейшим фактором, определяющим генетический состав популяций ризобий. Молекулярные методы дают возможность проанализировать влияние растения-хозяина, изучая разнообразие популяции по симбиотическим участкам генома — именно там, где и следовало бы искать наиболее ясные свидетельства такого влияния. Однако работ по изучению генетического разнообразия ризобий, использующих все преимущества молекулярных методов все еще крайне мало и данные работы, как правило, затрагивают только один из аспектов изучения генетического разнообразия.

Таким образом, необходимы комплексные исследования природных популяций ризобий, использующих все преимущества молекулярных методов и отвечающих на следующие вопросы: какова генетическая структура природных популяций клубеньковых бактерий, каковы ее основные параметры (гетерогенность, неравновесие посцеплению), каковы основные факторы, влияющие на формирование генетической структуры популяции.

ГЛАВА 2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Отбор проб почв.

Рис. 4. Географическая карта района, где были отобраны пробы почвы.

Образцы почв отбирали летом 1996 года в Иркутской области на двух участках, А и Б, расположенных примерно в 80 км один от другого (рис. 4). На каждом из участков пробы отбирали из-под растений дикорастущих форм многолетней люцерны (Medicago varia) и донника (Melilotus officinalis) на глубине 15−20 см и на расстоянии не менее 50 м друг от друга. На участке, А пробы отбирали из-под люцерны (пробы № 1−9) и донника (пробы № 2730) — на участке Б из-под люцерны (пробы № 10−18) и донника (пробы № 20−26). Пробы хранили при +4°С в течение 14 дней.

2.2. Выделение клубеньковых бактерий из почв.

Из каждой пробы была приготовлена почвенная суспензия, содержащая 1 г почвы на 10 мл воды (Young et al., 1987), которой были инокулированы стерильные двухдневные проростки люцерны. Для выделения штаммов клубеньковых бактерий использовали 2 вида люцерны — многолетняя форма М. sativa сорт Вега и однолетняя форма M. truncatula сорт Jemalong. Растения выращивали в условиях стерильного микровегетационного опыта в течение 6 недель (Федоров и др., 1983). На корнях всех растений, кроме контрольных растений, инокуляция которых не проводилась, а также растений, инокулированных суспензией пробы № 17, были обнаружены розовые клубеньки. Выделение бактерий из клубеньков проводили в соответствии с обычной методикой (Young et al., 1987). Бактерии рассевали истощающим штрихом на твердой среде TY (Beringer, 1974) и выращивали при 28 °C в течение 3 суток. Затем отдельные колонии повторно рассевали истощающим штрихом до образования отдельных колоний. Далее, после второго рассева, отбирали по одной колонии из каждого варианта для последующего анализа. Симбиотические свойства отобранных штаммов повторно проверяли в стерильном микровегетационном опыте с люцерной. Всего было отобрано 56 штаммов, образующих эффективные клубеньки на растениях М. sativa, т. е. по 2 штамма от каждой из 28 исходных проб почв, из которых один штамм был выделен из клубеньков М. sativa, а другой — из клубеньков M.truncatula. В дальнейшем штаммы хранили как на косяках с агаризованной средой TY (Beringer, 1974) при +4°С, так и в жидкой среде TY, содержащей глицерин в концентрации 15%, при -70°С (Маниатис и др., 1984).

2.3. Нумерация штаммов.

Все отобранные штаммы обозначили индексом SB (с SB011 по SB302). Первые две цифры после индекса соответствуют номеру пробы почвы, из которой была приготовлена почвенная суспензия. Третья цифра обозначает растение, которое ино-кулировали соответствующей почвенной суспензией и из клубеньков которого впоследствии был выделен штамм: 1 — M. sativa, 2 — M.truncatula.

2.4. Тестерные штаммы.

В работе использованы три тестерных штамма: Rm2011 S. meliloti (Casse et al., 1979), MVII S. meliloti (Kosier et al., 1993) и CC169 S. medicae (Eardly et al., 1990).

2.5. Методы работы с ДНК.

Общую ДНК клубеньковых бактерий выделяли по следующей методике. 1,5 мл ночной культуры клеток ризобий, выращенных в жидкой среде TY при 28 °C на качалке (180 об/мин), центрифугировали при 14 000 об/мин в течение 2 мин. Надоса-дочную жидкость удаляли, а клетки ресуспендировали в 500 мкл буфера ТЕ (10 ммоль TRIS-HC1, 5 ммоль ЭДТА, рН-8,0). К суспензии добавляли лизоцим (1мг/мл) и инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляли SDS до концентрации 0,5% и протеиназу К до концентрации 0,05 мг/мл и инкубировали при 37 °C в течение 1 ч. Для уменьшения вязкости, образовавшийся прозрачный лизат замораживали при -20°С, и после этого замороженный лизат размораживали. Дважды экстрагировали смесью фенола, хлороформа и изоамилового спирта (24:24:2). ДНК осаждали двумя объемами этанола 5 мин при комнатной температуре. Раствор центрифугировали 2 мин при 14 000 об/мин, удаляли надосадочную жидкость, осадок осторожно промывали 70% этанолом, подсушивали и растворяли в 100 мкл дистиллированной воды. Концентрация ДНК в каждой из проб составляла примерно 0,5 — 1 мкг/мл.

Рестрикцию общей ДНК клубеньковых бактерий проводили по стандартной методике (Маниатис и др., 1984). 2 мкг ДНК обрабатывали 10 ед. ЕсоШ-эндонуклеазы в 20 мкл соответствующего буфера в течение 15−20 ч. Электрофорети-ческое разделение и перенос фрагментов рестрикции ДНК на нейлоновую мембрану проводили обычным способом (Маниатис и др., 1984). При этом на одну дорожку 1% агарозного геля наносили 0,5−1 мкг рестрицированной ДНК. Электрофоретиче-ское разделение фрагментов рестрикции проводили в течение 5 часов при 5 в/см.

Для проведения блоттинг-гибридизации по Саузерну использовали пробы, меченные дигоксигенином, в соответствии с рекомендациями изготовителя (Boehringer Mannheim GmBH). Для приготовления гибридизационных проб были использованы следующие фрагменты ДНК: 1) 4.4 тпн ü-coRI-фрагмент плазмиды pSUP202:/eM+, содержащий гены, влияющие на биосинтез лейцина штамма СХМ1 S. meliloti (Аронштам и др., 1993) — 2) 3.3 тпн jBg/I/EcoRI-фрагмент плазмиды pKSK5, включающий nodABC гены штамма 41 S. meliloti (Румянцева и др., 1999) — 3) в качестве единой пробы были использованы 5 фрагментов ДНК, каждый из которых был клонирован в одной из следующих плазмид: pARX:2.7 тпн, pARI:9.5 тпн, pARII/l:3.4 тпн, pARIV/l:2.9 тпн, рАВ57−1:10.9 тпн. Все 5 фрагментов составляют большую часть ехр-кластера (32 тпн) штамма Rm2011 S. meliloti (Becker et al., 1997) — 4) ПЦР-амплифицированный фрагмент ДНК (223 пн) штамма Rm2011 S. meliloti, содержащий внутренний фрагмент гена nodD 1 (Румянцева и др., 1999) — 5) ПЦР-амплифицированный фрагмент ДНК (около 1.0 тпн) штамма Rm2011 S. meliloti, содержащий ген гесА (Румянцева и др., 1999) — 6) ПЦР-амплифицированный ISRm2011;2 элемент (Selbitschka et al., 1995).

Размеры гибридизующихся фрагментов определяли относительно электрофо-ретической подвижности Hindillили Ä-y/EII-фрагментов ДНК фага X, используя линейную регрессию (logM от электрофоретической подвижности).

2.6. Рестрикционный анализ ПЦР-амплифицированных фрагментов гена 16S рРНК.

Фрагмент общей ДНК размером 1.5 тпн, содержащий последовательность гена 16S рРНК, был амплифицирован методом ПЦР с помощью праймеров Ю1 (5-CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') и rDl (5'-CCCGGGATCCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCC-3'), содержащих последовательности гена 16S рРНК E. coli 8−27 и 1541−1525, соответственно, а также линкер-ные последовательности для клонирования (Weisburg et al., 1991). Аликвоты ам-плифицированной ДНК переваривали с помощью эндонуклеазы Rsal. Реакцию ПЦР и электрофоретическое разделение полученных фрагментов ДНК проводили в соответствии со стандартной методикой (Terefework et al., 1998).

2.7. Определение плазмидного состава штаммов.

Плазмидный состав природных штаммов S. meliloti определяли по модифицированному методу Экхардта (Eckhardt, 1978). Примерно 50 |il ночной культуры штамма, выращенной в жидкой среде TY при 28 °C на качалке (180 rpm), добавляли к 2 ml свежей жидкой среды TY и инкубировали при 2 8° С на качалке еще 2 часа. После этого полученную культуру инкубировали 30 мин при 4 °C в холодильнике. Затем ее центрифугировали при 14 000 rpm в течение 2 мин. Надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспендировали в 30 лизирующего буфера IxTBE (Манниатис и др., 1984): 20% (w/v) сахароза- 1 mg/ml лизоцим- 0,1 mg/ml РНК-за. Суспензию немедленно вносили в лунку геля (IxTBE- 0,6% агароза- 0,4% SDS). Электрофорез проводили в IxTBE буфере: префорез в течение 30 мин при напряжении 0,5 v/cmдалее плазмидную ДНК разделяли в течение 10−14 часов при напряжении 3 v/cm. Гель окрашивали бромистым этидием, отмывали в воде и фотографировали. Размер плазмид определяли относительно электрофоретической подвижности плазмид тес-терного штамма МУП, используя линейную регрессию (^М от электрофоретической подвижности).

2.8. Статистическая обработка данных.

На основании результатов гибридизационного анализа для каждой из использованных проб вычисляли коэффициент гетерогенности Н (генное разнообразие): где р~ частота Ш^ЬР типа в популяции, А — число М^ЪР-типов, а п — число штаммов (Вейр Б., 1994; ВготйеИ <* а1., 1998).

Чтобы определить, насколько штаммы из двух различных субпопуляций отличаются друг от друга по частотам Ю^ЪР-типов, вычисляли коэффициент различия /)=1-/, где 1- коэффициент идентичности М. Нея (Вейр Б., 1994): где а, и ?>, — частоты 1УРЬР типов в сравниваемых субпопуляциях, А и Б, к — число Ш^Р-типов (Вейр Б., 1994). Коэффициенты ?> определяли как для каждого из изучаемых генетических районов, так и для всех пяти районов в совокупности (Д?), исходя из значения Значения Б могут варьировать от 0 (частоты всех ЫГЬР-типов одинаковы в субпопуляциях) до 1 (субпопуляции не имеют общих ИРЬГ-типов). к =.

Достоверность определенных значений И оценивали по^{-критерию} сходства между вариационными рядами (Лакин, 1990): к к где щ и hi — частоты RFLP типов в сравниваемых субпопуляциях, А и Б, к — число RFLP-типов, щчисло штаммов с г-тым RFLP-типом.

Для того, чтобы определить, насколько случайно ассоциированы RFLP-типы в RFLP-генотипах, вычисляли индекс ассоциации Ia (Maynard Smith et al., 1993; Gordon et al., 1995). Для каждой пары штаммов определяли число несовпадений (mismatches) в составе RFLP-генотипов по RFLP-типам. Затем для всей популяции вычисляли дисперсии: а) для наблюдаемого числа несовпадений (Vo) и б) для числа несовпадений, распределенного по нормальному (гауссовому) закону (Ve), что ожидается при полной панмиктичности популяции. Показателем (индексом) неравновесия по сцеплению (linkage disequilibrium) является величина Ia=Vo /Ve, при этом нулевая гипотеза о панмиктической структуре популяции отвергается при Ia> 1.

Vexp и ее стандартная ошибку вычисляли следующим образом: где pi — частота /-того RFLP-типа по /-тому локусут — число локусовк — число RFLP-типов по данному локусу. т к.

К, Р= где hj = 1 — J] Р? i ' сту=1/и hj0—hj)2.

Для оценки сцепления между локусами использовали программу Arlequin 1.1. (Schneider et al., 1997), позволяющую проводить точный тест сцепления между локусами при вычислении точного значения критической вероятности Р.

Для построения дендрограммы родства использовали невзвешенный парно-групповой метод кластеризации с арифметическим средним (UPGMA) (Вейр Б., 1994), при этом за меру генетического сходства между двумя RFLP-генотипами принималось число (доля) общих RFLP-типов.

Глава 3.