Реконструкция костной ткани с использованием скелета натуральных кораллов Acropora cervicornis у больных с доброкачественными образованиями костей (экспериментально-клиническое исследование)

Доклинические исследования остеопластических свойств натурального коралла семейства Acroporidae были проведены на базе отделения «Прогноза эффективности консервативного лечения» ФГУ «Московский научно исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена» МЗ и CP РФ. Согласно разработанному алгоритму испытания НК, на первом этапе в экспериментах in vitro проводили оценку острой токсичности и матриксных свойств поверхности НК, а также их способности поддерживать пролиферацию ФЧ и пролиферацию/дифференцировку ММСК, а далее — в экспериментах in vivo на мелких и крупных лабораторных животных — исследовали биосовместимость этого материала и его остеозамещающие потенции.

В клиническую часть исследования было включено 20 больных с доброкачественными и опухолеподобными заболеваниями костей, которым в отделении «онкологической ортопедии» ФГУ «МНИОИ им П. А. Герцена МЗ и CP РФ» в 2006;2010гг. были выполнены 20 оперативных вмешательств.

2.2 Доклинические исследования натурального коралла семейства Acroporidae в экспериментах in vitro и in vivo 2.2.1 Подготовка и стерилизация натуральных кораллов.

Очистку НК семейства Acroporidae от мелких органических остатков и от коралловой пыли проводили в несколько этапов. На первом этапе ветви скелета НК подвергали грубой механической очистке щеткой с жесткой синтетической щетиной под струей проточной воды, осуществляя на этапах микроскопический контроль. Далее дополнительно производили ультразвуковую очистку НК (ультразвуковая мойка Finn Sonic m 15, t — 60 °C, 20 минут). После высушивания образцы подвергали механическому измельчению до заданного размера частиц (0,2−0,6 мм, 0,6−0,8 мм, 0,8−1,2 мм, 1,2−1,5 мм, 1,-3,0 мм, >3,0мм) на планетарной шаровой мельнице РМ 200- затем каждую фракцию частиц НК промывали в течение 3−4 часов в холодной проточной воде. На заключительном этапе частицы НК замачивали на 8 часов при комнатной температуре в дистиллированной воде в соотношении НК/Н20 (по объему) 1:10, заменяя дистиллированную воду каждые 2 часа на свежую порцию, затем высушивали их в сухожаровом шкафу при температуре 50−60°С в течение 8 часов и раскладывали по стеклянным флаконам объемом 10 см³.

Далее проводили стерилизацию частиц НК 7-облучением в дозе 20−25 кГр на установке РХМу -20. На заключительном этапе осуществляли бактериологический контроль стерильности НК (15% образцов из каждой партии, анализатор бактериологический «BioTrack 4250», SY-LAB GmbH, Австрияанализатор бактериологический «Bactec 9120», Becton Dickinson, США), в соответствии с требованиями.

2.2.2 Исследования in vitro острой цитотоксичности и матриксных свойств поверхности образцов НК.

За сутки перед началом опыта стерильные коралловые частицы размером 0,2−0,6 мм помещали в 24-х луночные культуральные планшеты (Costar, США) и заливали полной ростовой средой (ПРС) следующего состава: среда ДМЕМ (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова, РАМН, Москва), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ПанЭко, Москва), глютамин (бООмг/л). Каждый образец НК в платах был представлен в триплетах.

Оценку острой цитотоксичность НК и динамики нарастания на них клеток выполнены на клеточной линии иммортализованных нормальных фибробластов человека (ФЧ, клон № 1608), полученной из Медико-Генетического научного центра РАМН, г. Москва. Клеточную линию поддерживали в ПРС на основе среды ДМЕМ (см. выше).

В экспериментах использовали клетки в логарифмической фазе роста (предконфлюэнтный монослой). Для получения суспензии одиночных клеток монослой ФЧ обрабатывали 0,25% раствором трипсина (Sigma, США), затем полученную взвесь клеток тщательно дважды отмывали центрифугированием в большом объеме ПРС, производили их подсчет и оценку жизнеспособности, окрашивая клеточную суспензию 0,04% раствором трипаново синего. Затем в платы с НК (опыт) и без них (контроль) помещали ФЧ (400тыс.кл. на лунку) в объеме 2мл ПРС и инкубировали: для определения острой цитотоксичности в течение 24 часов, для оценки матриксных свойств НК — 3, 7, 10, 14, 17, 21 и 28 суток. Полную замену ПРС осуществляли дважды в неделю на протяжении первых 10-и суток эксперимента, а далее — вплоть до окончания опытаежедневно. Все операции с НК и ФЧ осуществляли в стерильных условиях, культивирование — в атмосфере влажного воздуха, содержащего 5% СО2 при 37 °C.

Жизнеспособность ФЧ в динамике культивирования с НК оценивали с помощью МТТ метода, который основан на способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать 3-(-4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолий бромистый (МТТ, Sigma, США) в голубые кристаллы формазана, нерастворимые в воде [119]. Как было показано ранее [37], количество образовавшегося формазана отражает пролиферативную активность (жизнеспособность/количество) различных клеток человека и животных in vitro. Для проведения МТТ-теста в опытах in vitro по окончанию срока культивирования ФЧ на культуральном пластике-полистерене (контроль) и на образцах НК в полистереновых лунках (опыт) из каждой лунки отбирали по 1,5 мл среды и вносили по 125мкл раствора МТТ в концентрации 5мг/мл. Через 3 часа инкубации (5% С02, 37°С) из каждой пробы полностью декантировали ПРС и осуществляли растворение образовавшегося формазана с помощью изопропилового спирта (1 мл на лунку). От осадка, образующегося в результате преципитации белков в изопропаноле, освобождались центрифугированием плат в течение Юмин. при ЗОООоб/мин. Далее из каждой лунки переносили по ЮОмкл супернатант в 96-луночный плоскодонный планшет (Costar, США) и оценивали оптическую плотность раствора формазана на спектрофотометре.

МСС-340 (Швеция) при длине волны 540нм. В качестве спектрофотометрических контролей (бланк) использовали пробы с чистой ПРС и пробы, содержащие тестируемые образцы НК в ПРС (без клеток).

Для определения цитотоксичности материалов рассчитывали пул жизнеспособных клеток через 24 часа инкубации с ними по формуле:

ОД* опыт.

Пул жизнеспособных клеток (ПЖК) = - X 100%.

ОД контр.

ОД*- оптическая плотность раствора формазана).

При оценке матриксных свойств НК определяли изменение пула ФЧ (А) в каждый конкретный срок по формуле:

ОД+, — ОД,.

А = - х 100%,.

ОДп.

ОД п+1 — величина оптической плотности в конкретный срок, ОД п — величина оптической плотности в предыдущий срок.

Положительная величина пула свидетельствовала о приросте популяции ФЧ, отрицательная — о гибели части популяции.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерных программ Statistica и Biostat Exe.

2.2.3 Исследование остеоиндуцирующих свойств скелета НК как матрикса для культур ММСК.

Этот раздел работы был выполнен совместно с сотрудниками лаборатории факультета фундаментальной медицины МГУ им М. В. Ломоносова. Для оценки остеогенной дифференцировки ММСК человека была проанализирована транскрипция ряда маркерных генов: Osteoc (остеокальцина), AlcPho (щелочной фосфатазы), ВМР2, Sialopr II (костного сиалопротеина II типа), коллагена I типа и остеопонтина.

Источником ММСК человека служила подкожная жировая ткань (9 образцов, возраст доноров 17−64 года), которую получали во время лапаротомии при проведении оперативных вмешательств. Образцы ЖТ весом 7,0−41,0гр. помещали в стерильную емкость со средой следующего состава: среда ДМЕМ (ПанЭко, Россия), гентамицин (100 мкг/мл) и транспортировали в лабораторию, где они сохранялись при температуре +4°С не более 1 часа до начала процедуры выделения клеток. Для выделения ММСК из ЖТ использовали сочетание механической и ферментативной дезагрегации. Для этого в чашке Петри образцы ЖТ тщательно измельчали ножницами на холоде в фосфатно-солевом буфере с антибиотиками до получения грубой гомогенной взвеси. К измельченной ткани добавляли равный объем 0,025% раствора трипсина (ПанЭко, Россия) и помещали на шейкер (25 мин., температура 37°С). Полученную в результате трипсинизации клеточную взвесь фильтровали через сито (размер пор 70 цт) и отмывали от трипсина центрифугированием в течении 10 минут, при 1000об./мин. Для отмывки использовали ПРС следующего состава: среда ДМЕМ/Р12 (1:1), глутамин (65 мг/мл), 10 мм буфера Hepes (все реактивы фирмы ПанЭко, Россия), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Eurobio, Франция) и гентамицин 50 мкг/мл (Респ. Беларусь). Осадок клеток ресуспендировали в 5 мл ПРС и оставляли при температуре +4°С для последующего объединения с новыми порциями выделенных клеток. Для этого циклы ферментативной дезагрегации повторяли дважды, используя во втором цикле раствор трипсина с коллагеназой, а третьем — 0,075% раствор коллагеназы. Полученные фракции клеток объединяли, повторно отмывали, супернатант декантировали, осадок тщательно ресуспендировали в ПРС и производили подсчет жизнеспособных клеток (0,4% раствор трипанового синего) в камере Горяева. Из одного грамма ЖТ таким способом удавалось выделять от 60 до 270 тысяч клеток с 95% жизнеспособностью. Клеточную суспензию рассеивали по культуральным флаконам при плотности посева 10,0 тыс. ядросодержащих клеток на см поверхности флакона и помещали в С02 инкубатор (37°С, 7,5% СО2). Через двое суток производили удаление неприкрепившихся клеток из флаконов и добавляли свежую порцию ПРС. По достижении культурой состояния предконфлюэнтного монослоя (70−80% культуральной поверхности занято клетками) проводили перепассирования. Для эксперимента использовали культуры ММСК III (7 обр.) и V (2обр.) пассажей.

При индукции остеогенной дифференцировки культуры ММСК III и V пассажей наращивали до состояния монослоя в обычных условиях, а затем культивировали в течении 14 суток в присутствии соответствующих дифференцирующих агентов: 15% Osteogenic Stimulatory Supplements, 3.5mM /?о.

Glycerophosphate, 10″ M Dexamethasone, 50|ig/mL Ascorbic Acid в MesenCult Basal Medium (все реактивы фирмы StemCell Technologies, Канада).

Далее из клеток, культивированных в дифференцировочных условиях, была выделена РНК и методом ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ ПЦР) было проанализировано содержание транскриптов этих генов.

Выделение РНК осуществляли с использованием коммерческих реагентов «RNeasy Miny Kit (50)», QIAGEN, США. Выделенную РНК обрабатывали ДНКазой для исключения загрязнений геномной ДНК.

Качество РНК оценивали электрофоретически в агарозном геле, количество — спектрофотометрически. Синтез первых цепей кДНК проводили согласно стандартному протоколу фирмы «Fermentas», используя олиго-dT-праймеры. Реакцию проводили в ПЦР — амплификаторе с горячей крышкой. Все манипуляции проводили в перчатках и в ламинарном боксе во избежание контаминации.

Для анализа экспрессии генов проводили ПЦР в реальном времени с интеркалирующим красителем Sybr Green («Синтол», Россия) в амплификаторе «ВЮRAD iQ5. Multicolor Real-time PCR detection system». Праймеры к анализируемым генам подбирали в программе DNASTAR (табл. 1).

ПЦР в реальном времени осуществляли в соответствии со стандартным протоколом фирмы «Синтол». Реакцию проводили с использованием градиента температур (подобранной для каждой пары праймеров — табл. 1). Схема реакции включала: первичную денатурацию (95°С, 5 мин), денатурацию (95°С, 20 сек), отжиг праймеров (59−64°С, 20 сек), элонгацию (72°С, 20 сек -40 циклов) и плавление продуктов амплификации. Для дополнительного контроля чистоты реактивов и работы проводили контрольную реакцию, в которой присутствовали все компоненты, кроме матрицы. Для анализа специфичности амплификации по окончании ПЦР-РВ проводили плавление продуктов с постоянным анализом флуоресценции и построение кривых плавления.

Таблица 1.

Праймеры к остеогенным маркерным генам.

Рогшагё рптег Яеуегзе рптег Т отж. Ампликон (п.н.)*.

С^еос САСТССТСОСССТАТТ всс вССТСООТСТСТТСА СТАССТ 62.2 138.

А1сРЬо АТСООАТСООТОТСТ ССАСА ССАССААвССОАЛСТ тете 62.5 108.

ВМР2 СОТОТССССОСОТСС ТТСТТАв тсстооооотссотс ТСТвТТТСА 62.5 261.

81а1орг II ТООАТОААААСОААС ААСвСА АААСССАССАТТГСО ЛвЛввТ 60.4 200.

Со1^еп I АТООАТТССАОТТСО АвТАТССС САТСОАСАОТОАССС ТвТАвв 62.1 246.

СЫепх ССТСТОССвОАСТСА АСААС ТАААОвОООСТООАТ ААвСАТ 62.8 112.

С^еоропйп СТССАТГСАСТСОАА СвАСТС САСОТСТССОАААСТ ТСТТАвАТ 60.2 230 п.н. — пара нуклеотидов.

Анализ проводили методом ПЦР в реальном времени, уровень мРНК анализируемых генов выравнивали по отношению к двум генам неизменного уровня экспрессии (house keeping genes) (GAPDH, jS-actin), (* - p<0,05, n=12 (количество проанализированных образцов X количество измерений)).

Для оценки влияния условия культивирования дифференцированных ММСК на матриксе из коралла был также проведен сравнительный анализ транскрипции маркерных генов.

Статистический анализ данных осуществляли с использованием программы SigmaStat9.0- для сравнения групп использовали U-критерий Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при уровне значимости р<0,05.

2.2.4 Оценка биосовместимости образцов коралла семейства Acroporidae в экспериментах in vivo.

Для исследования биосовместимости образцов НК в экспериментах in vivo использовали модель подкожной трансплантации. Для этого крысам-самкам линии Wistar весом 180−200г под наркозом (кетамин/реланиум в отношении 1:1, внутрибрюшинно по 0,05мл) делали кожный надрез в области грудного отдела позвоночника. Тупым концом скальпеля кожу отсепаровывали от прилегающего слоя подкожной клетчатки и мышц и в образованный «карман» имплантировали предварительно подготовленный образец материала. Вес образцов НК был приблизительно одинаковым для всех животных и составлял ~ 120 мг. На область раны накладывали 2 операционных шва, после чего животных оставляли под наблюдением. Далее крыс выводили из эксперимента с помощью летальной дозы эфира для наркоза через 2-, 4-, 8-, 10-ть недель эксперимента (по два животных на каждый срок, всего — 8 животных), образцы материалов извлекали и проводили их визуальную оценку (видеокомплекс на основе стереомикроскопа и цифровой видеокамеры.

Olympus, Япония). После фиксации образцов в 10% растворе формалина осуществляли декальцинацию материалов (0,3 М раствор ЭДТА, 37 °C -30 дней), затем изготавливали из них парафиновые блоки, а далеегистологические препараты. Препараты окрашивали гематоксилин-эозином, по стандартной методики и анализировали путем световой микроскопии (микроскоп Axioplan, OPTON, Германия).

2.2.5 Исследование остеозамещающих потенций образцов коралла семейства Acroporidae на модели дефекта большеберцовой кости крысы в экспериментах in vivo.

Работа выполнена на крысах — самках линии Wistar, массой 180−200г (по 20 животных в каждой серии экспериментов). Операции (краевую резекцию большеберцовой кости) осуществляли под наркозом. Для этого животным проводили предварительную седацию 0,25% раствором дроперидола (0,5мл внутрибрюшинно) и 0,25% раствором кетамина (0,25мл внутримышечно). Далее, в положении животного на спине, по внутренней медиальной поверхности голени, отступая от коленного сустава приблизительно на 8 мм, производили кожный разрез протяженностью 2,0 -2,5 см. Кожу отсепаровывали, производили мобилизацию мышц голени отведением их в сторону и обнажали болыпеберцовую кость. Для исключения физиологической регенерации костной ткани отсепаровывали и удаляли надкостницу. Затем на границе верхней и средней трети кости посредством фрезы диаметором 2,5 мм формировали «окончатый» дефект следующего размера: длина 6−8мм, ширина 1,5−2мм, глубина 2,5-Змм, то есть с проникновением в костномозговой канал. Область дефекта полностью заполняли пластическим материалом во II группе (20 крыс), в I — контрольной группе (20 крыс) дефект не заполнялся. На заключительном этапе послойно накладывали швы на мышцы (укрывая место дефекта) и кожу голени (рис.1).

2.2.6 Исследование остеозамещающих потенций НК на модели критического дефекта бедренной кости барана.

Работа выполнена на половозрелых баранах (8−12 месяцев- 40−60 кг). Перед операцией каждому животному по рентгенограммам производили замер бедренной кости для изготовления из НК индивидуальных имплантатов и подбора пластин для накостного остеосинтеза. Подготовленный коралловый имплантат представлял собой цилиндр с выступами для фиксации в костномозговом канале (рис. 2а): высота цилиндра 2,0 см с радиусом 0,88 смвысота выступов 1,4 см, с радиусом 0,68 см. Далее НК имплантаты очищали по разработанной и описанной выше методике и стерилизовали их у-облучением (доза 25 кГр).

Операцию (сегментарную резекцию бедренной кости) осуществляли под наркозом. В положении животного на боку производили разрез кожи и подкожно-жировой клетчатки в проекции бедренной кости от тазобедренного до коленного сустава. После выделения бедренной кости, при помощи распатора, в средней трети удаляли надкостницу. Далее при помощи пилы Джильи, в средней трети диафиза производили сегментарную резекцию бедренной кости (Зсм). После чего в область дефекта устанавливали имплантат (НК) и фиксировали его при помощи накостного металлостеосинтеза (пластина — ЬСР, БупШеБ, Швейцария) и серкляжной проволоки (рис. 26). Далее рану послойно ушивали. Описанное оперативное вмешательство проведено у трех баранов.

Асгорога), предназначенный для восстановления костной ткани при реконструктивно-пластических операциях, разработанный ФГУ МНИОИ им П. А. Герцена, нетоксичен, стерилен, отвечает требованиям, предъявляемым к медицинским материалам для внутреннего протезирования" [приложение 1].

Для апробации разработанных подходов в практике был подготовлен протокол клинического исследования: «Применение имплантатов на основе скелета натурального коралла вида Асгорога сегасотеБ для реконструкции костей», утвержденный Этическим комитетом и Ученым советом ФГУ «МНИОИ им. П. А. Герцена «Минздравсоцразвития России. Протокол клинического исследования:

ПРИМИНЕНИЕ ИМПЛАНТАТОВ НА ОСНОВЕ СКЕЛЕТА НАТУРАЛЬНОГО КОРАЛЛА вида АСКОРОЯА СЕЮТСОКМЕЗ ДЛЯ РЕКОНСТРУКЦИИ КОСТЕЙ".

Цель исследования:

Исследование возможности использования скелета коралла Асгорога сетсогпеБ для восстановления костной ткани с определением времени до исчезновения клинических проявлений основного заболевания и оценкой эффективности проведенного лечения. Исследуемая популяция:

В исследование будет включено 10 пациентов с поражением костной ткани различной локализации с доброкачественными (энхондрома, остеоид-остеома и т. д.) и кистоподобными процессами (аневризмальная киста, фиброзная дисплазия и т. д.) с подтвержденным гистологическим диагнозом. Критерии включения:

Для включения в исследование пациенты должны удовлетворять следующим критериям: 1. Мужчины и женщины в возрасте от 14 до 60 лет- 2. Гистологически подтвержденный диагноз доброкачественного или кистоподобного процесса (энхондрома, остеоид-остеома, аневризмальная киста, фиброзная дисплазия и т. д.).

Критерии исключения:

Пациенты, которые соответствуют любому из указанных ниже критериев, не могут быть включены в настоящее исследование:

1. Вовлечение в процесс суставных поверхностей;

2. Предполагаемое несоблюдение пациентом процедур протокола;

3. Беременные и кормящие грудью женщины;

4. Наличие в анамнезе какого-либо злокачественного новообразования (кроме адекватно леченных базально-клеточного рака или рака шейки матки in situ);

5. Нестабильное, требующее постоянного мониторинга и корригирующей терапии состояние при заболеваниях сердца, включающее застойную сердечную недостаточность или стенокардию, инфаркт миокарда в течение 1 года до включения в настоящее исследование, неконтролируемая артериальная гипертензия или аритмия;

6. Активный вирусный гепатит, острое или хроническое заболевание печени;

7. Активная гастродуоденальная язва;

8. Сахарный диабет;

9. Острое или хроническое заболевание почек;

10. Сопутствующая активная и/или неконтролируемая инфекция с поражением костной ткани (остеомиелит);

11. Тяжелое системное заболевание. Планируемое оперативное вмешательство:

Оперативное лечение предусматривает проведение резекции сегмента кости с доброкачественным образованием и замещение его кораллом, соответствующим по форме и протяженности дефекту или экскохлеацию (внутрикостную резекцию) с заполнением образовавшейся полости гранулами коралла размером от 1 до 4 мм в диаметре. Оценка эффективности лечения: щ.

Будет осуществляться путем выполнения рентгенологического или КТ исследований области имплантации НК. Лабораторные анализы и клинические исследования: 1. Общий анализ крови — перед началом лечения.

2.Биохимический анализ крови — перед началом лечения (с обязательным определением ЩФ).

3.Клинические и инструментальные исследования (оценка эффективности лечения):

• R-графия первичной опухоли в двух проекциях — перед началом лечения и после операции (не позднее чем через 7-х суток).

• R-графия легких — перед лечением,.

• КТ и МРТ первичной опухоли — по показаниям,.

• РИД скелета — в начале исследования,.

• ЭКГ и Эхо-КГ — перед началом лечения и по показаниям,.

• КТ грудной, брюшной полости — по показаниям. Динамическое наблюдение:

Динамическое наблюдение после окончания первичного лечения (оперативное вмешательство) осуществляется с частотой 1 раз в 1 месяц в течение первых 6 месяцев после окончания лечения, затем 1 раз в 6 месяцев в течение 5 лет.

Объем лабораторных и инструментальных обследований — общий, биохимический анализы крови, R-графия скелета. КТ, РИД скелета, R-графия легких, УЗИ брюшной полости — 1 раз в год или по показаниям.

В рамках разработанного и утвержденного протокола НК был использован для реконструкции костных структур у 10 больных с доброкачественными новообразованиями костной ткани (основная группа). В эту группу были включены 9 — женщин, 1 — мужчинав возрасте от 21 до 54 летсредний возраст — 35 лет с доброкачественными (энходрома — 5, остеобластокластома — 1, костно-хрящевой экзостоз — 1) и опухолеподобными (костная киста — 3) образованиями костей. У шести пациентов процесс локализовался в области фаланг пальцевпо одному — в крыле подвздошной и бедренной костяхдвое больных имели поражение плечевой кости (табл. 2). Согласно протоколу, больным была произведена внутрикостная резекция очага поражения с реконструкцией гранулами НК семейства Асгоропёае, вида Асгорога сегласогпеБ (размер гранул — от 0,1 см³ до 0,5см3) — основная группа.

В группе сравнения 10 больным для восстановления костной ткани использовали /3-трикальцийфосфат (объем использованого материала 0,5см3 — 1 см3- /З-ТКФ — СЬгопОБ, БупШез, Швейцария). Эта группа включала 6 — мужчин и 4 — женщины в возрасте от 19 до 62 лет, средний возраст — 37 лет. У девяти из десяти больных оперативное вмешательство осуществлено по поводу доброкачественных образований костей (энходрома — 1, гигантоклеточная опухоль — 2, костно-хрящевой экзостоз — 1, костная киста — 3 и фиброзная дисплазия — 2). У десятого пациента выполнена резекция проксимального отдела бедренной кости с эндопротезированием тазобедренного сустава, по поводу метастаза рака предстательной железы в головку бедренной кости. Для имплантации чашки эндопротеза, выполнена остеопластика дна вертлужной впадины блоками /3-трикальцийфосфата. У пяти пациентов процесс локализовался в бедренной кости и по одному пациенту имели поражение лучевой кости, ключицы, фаланги пальца, пяточной и большеберцовой костей (табл. 2).

Таким образом, в основной и группе сравнения преобладали (-60%) пациенты в возрасте от 19 до 40 лет. То есть, по возрасту эти группы были сопоставимы и представлены преимущественно лицами молодого возраста. Среди патологических процессов в обеих группах преобладали костные кисты и энхондромы (табл. 2).

Таблица 2.

Распределения больных по локализации поражений костной ткани доброкачественными и опухолеподобными процессами в основной группе и группе сравнения Локализация Заболеваний Основная группа -1- Группа сравненияII. Фаланга Пальца Ключица Лучевая кость Пяточная Кость Больше-берцовая кость Бедренная кость Плечевая кость Подвздошна я кость.

Остеобласто-кластома I 1.

II 1 1.

Энхондрома I 4 1.

II 1.

Костная киста I 1 1 1.

II 1 2.

Фиброзная дисплазия I.

II 1 1.

Костно-хрящевой экзостоз I 1.

11 1.

Метастаз рака предстательной железы I.

11 1.

ВЫВОДЫ.

1. Исследована морфологическая организация, химический, физический состав, пористость и прочностные свойства скелета натуральных кораллов семейства Acroporidae. Установлено, что все образцы (за исключением вида Montipora digitata) представлены закристаллизованным арагонитом, имеют сквозные мелкие и крупные (диаметром от 0,1 до 1,0 мм) поры с тонкими стенками, обладают развитой поверхностью с зерном в нанодиапазоне и по прочностным свойствам (19,2−29,2 МПа) в 4 — 6 раз превосходят традиционно используемые кальций-фосфатные керамические материалы.

2. Показано, что все испытанные образцы натуральных кораллов не токсичны, обладают выраженными матриксными и адгезивными для клеток свойствами, способствуют распластыванию и активной экспансии клетками поверхности кораллов, включая поровые пространства, способствуя их пролиферации. Натуральные кораллы (в отличие от кальций-фосфатных керамических материалов) как матриксы для мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток in vitro обладают остеоиндуктивными свойствами, вызывая экспрессию в этих клетках генов остеодифференцировки, кодирующих щелочную фосфатазу, остеопонтин, сиалопротеин II и коллаген I типа.

3. В эксперименте, на группе лабораторных животных (8 крыс) установлено, что натуральные кораллы семейства Acroporidae являются биосовместимыми: при динамическом морфологическом исследовании подкожно введенных лабораторным животным имплантатов отмечена их постепенная биорезорбция, образование правильно организованной соединительной ткани с выраженной неоваскуляризациейпризнаков воспалительных реакций, некрозов и других проявлений отторжения на всех сроках до 13 недель не выявлено.

4. При репарации окончатого костного дефекта у крыс гранулами натурального коралла установлено, что этот биоматериал ускоряет регенеративные процессы, инициируя органотипическое замещение дефекта путем периостального остеогенеза, в течение 6−9 недель.

5. Рентгенологическая и морфологическая картина реконструкции костной ткани в зоне обширного сегментарного дефекта бедренной кости барана монолитным коралловым имплантатом свидетельствует о том, что скорость биорезорбции этих материалов соответствует скорости неоостеогенеза и натуральные кораллы обладает остеокондуктивными свойствами, что и обеспечивает быстрое органотипическое восстановление костной ткани, в течение 4−6 месяцев.

6. По результатам клинического исследования можно отметить высокую скорость резорбции натуральных кораллов (как вышедших в мягкие ткани, так и в зоне имплантации) сопоставимую со скоростью репарации кости. Так, при динамическом наблюдении (к 18−24 месяцам) у всех пациентов в основной группе определяется практически полная резорбция натуральных кораллов с реконструкцией костной ткани. Положительным моментом этих имплантатов является отсутствие формирования вокруг них соединительнотканной капсулы, которая может отграничивать имплантируемые материалы и снижать их остеопластические свойства.

7. В группе сравнения первые признаки резорбции /З-трикальцийфосфата отмечаются через 8−12 месяцев. Замещение костного дефекта в этой группе идет медленно, в основном за счет разрастания соединительной ткани, что свидетельствует о низких остеоиндуктивных свойствах кальцийфосфатных материалов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Разработанные модели искусственных дефектов костных структур у мелких и крупных лабораторных животных целесообразно использовать для изучения закономерностей посттравматического остеогенеза, влияния на этот процесс различных факторов, в том числе новых методов костной пластики и новых остеопластических материалов.

2. Натуральные кораллы могут быть рекомендованы в качестве остеопластических материалов как в гранулированном виде, так и в виде цельных блоков (в зависимости от места и объема дефекта) для реконструкции костных структур (в том числе несущих осевую нагрузку), т.н. после травматических переломов, остеотомий и резекций при доброкачественных опухолевых поражениях костной ткани.

3. Обязательными условиями костной пластики являются полное заполнение дефекта коралловым имплантатом, плотный контакт с костным ложем, хорошая стабилизация конструкции и достаточная иммобилизация оперированного сегмента.