Поиск и исследование природных штаммов-деструкторов 2, 4, 5-трихлорфеноксиуксусной кислоты

Актуальность проблемы. Давно известно, что широкое и разностороннее применение достижений органической химии в практической деятельности человека сопровождается непрерывным поступлением в окружающую среду синтетических органических соединений, с которыми ранее живые организмы не встречались. 7.

Производство и применение таких веществ, названных ксенобиотиками (от гр. ксенос — чужой, биос — жизнь), в количественном отношении составляет доли процента по отношению к количеству органической материи, ежегодно включающейся в круговорот веществ. Тем не менее, к настоящему моменту становится все более очевидным, что даже эти относительно небольшие количества небезразличны для биосферы. Дело в том, что значительная часть ксенобиотиков применялась для борьбы с определенными группами организмов, но, как оказалось со временем, они или продукты их разложения, обладающие непредсказуемыми свойствами, способны оказать отрицательное действие на многие формы живой материи. Последствием присутствия загрязнителей явилось создание специфических условий окружающей среды, при которых жизнедеятельность многих членов естественных сообществ, включая человека, оказывается подавленной.

Одну из крупнейших групп экотоксикантов составляют производные ароматического ряда, содержащие в своем составе галогены. Соединения этой группы практически постоянно присутствуют в окружающей среде, т.к. входят в состав медицинских препаратов, пестицидов, растворителей, лаков, красителей, огнетушителей.

Усилиями ряда авторов были раскрыты некоторые механизмы действия ксенобиотиков упомянутой группы на биологические объекты. Получены свидетельства того, что большинство из них высокотоксично и обладает канцерогенными свойствами. Поэтому действие галогенсодержащих ароматических соединений пролонгировано и имеет необратимый характер. Особо опасно совместное действие нескольких агентов. Например, одновременным воздействием молекул гербицидов 2,4-Д и 2,4,5-Т, а также хлорфенолов и диоксинов объясняют крайне сложный характер первичных поражений организма человека и тяжесть отдаленных последствий такого воздействия.

Для уничтожения галогенсодержащих производных ароматического ряда в окружающей среде в настоящее время используют метод сжигания остатков, накапливаемых в результате производственных процессов, а также обжигание загрязненных почв. К сожалению, указанные подходы имеют существенные ограничения и не исключают возможности вторичного загрязнения окружающей среды продуктами сжигания.

Альтернативный метод очистки среды основан на использовании микроорганизмов, обладающих специальными системами акцептирования и превращения молекул ксенобиотиков в безопасные формы, а также способностью полностью расщеплять опасные соединения. Использование микроорганизмов позволяет осуществить переработку значительных объемов загрязнений без образования продуктов вторичного загрязнения. Поэтому современный этап исследований микробиологического воздействия на ксенобиотики характеризуется выраженным практическим интересом к изучению физиологических, биохимических и генетических особенностей штаммов-деструкторов.

Одновременно с этим нужно принять ко вниманию, что исследование микроорганизмов, утилизирующих синтетические соединения, имеет не только большое практическое значение, но и является одним из фундаментальных направлений биологии, т.к. связано с изучением разнообразия свойств микроорганизмов, находящихся в условиях сильного антропогенного пресса.

Вместе с тем следует отметить, что число изученных и применяемых штаммов-деструкторов галогенорганических соединений ограничено. Недостаточно сведений о распространении сдособности осуществлять конверсию таких соединений среди микроорганизмов-членов природных сообществ. Неполны представления, раскрывающие особенности биологических механизмов разложения ксенобиотиков.

Цель и задачи исследования

Цель данной работы — получение новых штаммов бактерий, обладающих способностью осуществлять процессы деградации 2,4,5-Т.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выделить новые природные штаммы-деструкторы 2,4,5-Т;

2. Определить культурально-морфологические, физиолого-биохимичес-кие и генетические признаки штаммов-деструкторов 2,4,5-Т;

3. Выявить особенности процессов деградации 2,4,5-Т штаммов-деструкторов в водной среде;

4. Установить возможности применения штаммов-деструкторов для деградации 2,4,5-Т в почве.

Научная новизна исследования. Выделены новые штаммы-деструкторы 2,4,5-Т Bacillus cereus В-7164, Bacillus cereus ЗЗТ, Gluconobacter oxydans B-7170, Klebsiella terrigena 36T. Показано, что штаммы Bacillus cereus B-7164, Bacillus cereus ЗЗТ, Gluconobacter oxydans B-7170, Klebsiella terrigena 36T обладают полисубстратной активностью в отношении фенола и его хлорированных производных. Полисубстратная активность в отношении фенола и его хлорпроизводных для представителей родов Bacillus, Gluconobacter и Klebsiella установлена впервые.

Показано, что детерминанты деградации 2,4,5-Т штаммов Bacillus cereus ЗЗТ, Bacillus cereus 34 Т, Gluconobacter oxydans 2T и Klebsiella terrigena 36T располагаются на плазмидах pBCN ЗЗТ, pBCS 34T, pGOS 2T и pKTD 36T, соответственно.

Практическая значимость. Проведены испытания штаммов-деструкторов Bacillus cereus В-7164, Bacillus cereus ЗЗТ, Gluconobacter oxydans B-7170, Klebsiella terrigena 36T по очистке почвы от 2,4,5-Т. Полученные результаты показали, что с помощью штаммов-деструкторов Bacillus cereus В-7164 и Gluconobacter oxydans В-7170 можно существенно снизить концентрацию 2,4,5-Т в почве. Использование штамма Bacillus cereus В-7164 позволило в течение 14 дней снизить концентрацию 2,4,5-Т в почве на 50% по отношению к контролю. Применение штамма Gluconobacter oxydans В-7170 позвлило в течение 48 дней снизить концентрацию 2,4,5-Т в почве на 67% по отношению к контролю.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались и обсуждались на Республиканской конференции «Современные проблемы биологически активных веществ и биотехнологии» (Уфа, 1990), на 2-м Биохимическом съезде (Москва, 1997), на научно-практической конференции «Экологический императив сельского хозяйства Республики Башкортостан» (Уфа, 1998), на XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (С.- Петербург, 1998), на II съезде Вавиловского общества генетиков и селекционне-ров (С.- Петербург, 2000).

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 7 печатных работах.

выводы.

1. Из смешанных популяций почвенных микроорганизмов промзоны г. Уфы выделены новые штаммы бактерий Bacillus cereus ЗЗТ, Bacillus cereus В-7164, Gluconobacter oxydans B-7170 и Klebsiella terrigena 36T.

2. Установлено, что штаммы Bacillus cereus ЗЗТ, Bacillus cereus B-7164, Gluconobacter oxydans B-7170 и Klebsiella terrigena 36T способны использовать 2,4,5-Т в качестве единственного источника углерода и энергии. Показано, что в течение 9 дней в культуральных средах штаммов Bacillus cereus ЗЗТ, Bacillus cereus В-7164, Gluconobacter oxydans B-7170 и Klebsiella terrigena 36T количество 2,4,5-Т снижалось на 76%, 61%, 81% и 51%), соответственно.

3. Выявлено, что катаболизм 2,4,5-Т штаммов Bacillus cereus ЗЗТ, Bacillus cereus В-7164, Gluconobacter oxydans B-7170 и Klebsiella terrigena 36T происходит с образованием феноксиуксусной кислоты, которая впоследствии культурами Bacillus cereus ЗЗТ и Bacillus cereus В-7164 подвергается расщеплению до альдегида гексеновой кислоты, а культурами Gluconobacter oxydans В-7170 и Klebsiella terrigena 36T — до образования 3-метил-2,6-диоксо-4-гексеновой кислоты. Штамм Gluconobacter oxydans В-7170 в качестве интермедиатов образует 2,4-дихлорфеноксиуксусную и 4-хлорфенокси-уксусную кислоты.

4. Показано, что штаммы Bacillus cereus ЗЗТ, Bacillus cereus В-7164, Gluconobacter oxydans B-7170 и Klebsiella terrigena 36T обладают активностью в отношении фенола, 4-хлорфеноксиуксусной и 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислот. Штаммы Bacillus cereus ЗЗТ и Klebsiella terrigena 36 Т активны в отношении 2,4-дихлорфенола.

5. Установлено, что штаммы Bacillus cereus В-7164 и Gluconobacter oxydans В-7170 способны метаболизировать 2,4,5-Т в почве (тип серая лесная). Показано, что культура Bacillus cereus ЗЗТ в течение 14 дней снижает концентрацию 2,4,5-Т на 50% от контроля, а культура Gluconobacter oxydans В-7170 в течение 48 дней утилизирует 67% ксенобиотика от контроля.

1.6.

Заключение

.

Анализируя данные, касающиеся биологической конверсии хлорсодержащих ксенобиотиков, можно отметить, что число микроорганизмов, способных осуществлять подобные процессы невелико.

В качестве штаммов-деструкторов фенола и его хлорпроизводных упоминается менее 50 штаммов бактерий, относящихся к 15 родам. Большей частью сведения касаются представителей рода Pseudomonas (17 штаммов). На долю рода Rhodococcus приходится 9 штаммов, в 2 раза меньше на роды Acinetobacter и Alcaligenes. К родам Arthrobacter, Flavobacterium и Bacillus отнесено по 3 штамма-деструктора. Еще меньше, по 2 штамма, — к родам Azotobacter и Burkholderia. Среди представителей родов Desulfomonile, Sarcina, Streptomyces, Klebsiella, Nocardiodes обнаружено по одному штамму-деструктору. Отмечено, что фенол и его хлорпроизводные способны метаболизировать 4 штамма грибов, а именно: Aspergillus niger [Shailubhai et al., 1983], Candida tropicalis № 15 [Krug et al., 1985], Rhodotorula rubra [Katayama-Hirayama et al., 1991], Trichosporon cutaneum [Gaal et al., 1979; Neujahr et al., 1990].

Согласно имеющимся публикациям метаболизм фенола наиболее подробно описан на примере штаммов рода Rhodococcus [Hensel et al., 1983; Горлатов и др., 1989; Соляникова и др., 1999]. Большинство данных, раскрывающих этапы метаболизма 2,4-Д, получено для штаммов Alcaligenes eutrophus [Ghosal et al., 1985], Arthrobacter sp. [Sandman et al., 1988] и Pseudomonas aeruginosa PAOI [Kukor et al., 1989; Kaphammer et al., 1990]. Раскрыта природа некоторых метаболитов 2,4,5-Т штаммов Burkholderia cepacia АС1100 [Daubaras et al., 1996] и Pseudomonas sp. [Ghosal et al., 1985]. По заключению ряда авторов отмечены различия в характере интермедиатов, образующихся на начальных этапах расщепления указанных ксенобиотиков. В то время как в качестве более поздних метаболитов образуются продукты типа катехола и (3-кетоадипата.

Для некоторых штаммов выявлена полисубстратная активность. Так, штаммы Acinetobacter sp. [Beadle et al., 1982] и Desulfomonile tiedjei DSB.

Madsen et al., 1992] подвергают орто-расщеплению различные дихлорфенолы и трихлорфенолы [Горлатов и др., 1989]. Следует отметить штаммы.

Streptomyces rohei 303 [Golovleva et al., 1992] и Rhodococcus chlorophenolicus.

Apajalahti et al., 1986], способные к разложению целого спектра от дидо полихлорированных фенолов. Штамм Pseudomonas cepacia AC 1100 также способен разлагать полихлорированные фенолы, -включая дихлорфенолы, трихлорфенол, пентахлорфенол, и, кроме этого, 2,4,5-Т [Tomasi et al., 1995].

Полисубстратная специфичность отмечена также для эукариотических микроорганизмов, а именно, для штамма Aspergillus niger, способного метаболизировать такие хлорпроизводные фенола как 2,4-Д, 2,4-дихлорфенол, 0.

4-хлорфенол, 4-хлорфеноксиуксусную кислоту [Shailubhai et al., 1983], и для Candida tropicalis НР15, разлагающего фенол и ряд его производных [Krug et al., 1985].

В дополнение к изложенному можно отметить, что детерминанты начальных этапов катаболизма ксенобиотиков, как правило, были локализованы на генетически подвижных элементах, обозначаемых термином «Д-плазмиды». Отмечено, что более поздние этапы метаболизма находятся под контролем хромосомных генов. В определенной мере данные о размерах и характеристиках плазмид противоречивы. Это обстоятельство, скорее всего, является следствием того, что проблема генетического контроля процессов конверсии ксенобиотиков еще недостаточно изучена.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1. Объекты исследований.

Объектами исследований служили природные штаммы смешанных популяций микроорганизмов промзоны химического и нефтехимического производства г. Уфы.

Штамм Bacillus cereus 34 Т был выделен из образцов почвы берега реки Шугуровка промзоны г. Уфы.

Штамм Bacillus cereus ЗЗТ был выделен из образцов почвы промзоны АО НУНИЗ.

Штамм Gluconobacter oxydans 2 Т был выделен из образцов почвы берега реки Шугуровка промзоны г. Уфы.

Штамм Klebsiella terrigena 36 Т был выдлен из образцов почвы промзоны ОАО «Дубитель» г. Уфы.

2.2. Выделение чистых культур штаммов-деструкторов.

Отбор проб почвы производили согласно стандартным методикам: после удаления верхнего 2-х сантиметрового слоя почвы стерильной лопаткой брали образец и помещали его в заранее приготовленный стерильный бюкс [Звягинцев, 1980].

Выделение чистых культур микроорганизмов из почв проводили по методу Коха с модификациями [Теппер и др., 1987]. В стерильных условиях 10 г почвенного образца помещали в ступку, добавляли 5−15 мл стерилизованной воды и 5 мин мягко растирали до пастообразного состояния. Затем растертую почвенную массу смывали 95−85 мл стерильной воды в колбу. Колбу с суспензией встряхивали 15 мин в качалке УВМТ-12−250 со скоростью 150 об/мин. После этого делали последовательные разведения полученной суспензии. Из колбы брали 1 мл суспензии и переносили в пробирку с 9 мл автоклавированной воды (10'1 разведение), 1 мл из 10″ 1 разведения переносили в пробирку с 9 мл автоклавированной воды (10″ 2 разведение) и т. д. Затем делали посев 500 мкл почвенной суспензии из 10″ 3 разведения на подсушенный мясопептонный агар, растирали стерильным шпателем каплю досуха. Посев проводили на 3-х параллельных чашках Петри, помещали в термостат и инкубировали в течение 3−5 суток при температуре +30°С. Через 3−5 дней инкубации отдельные колонии с МПА засевали в 3 мл синтетической среды следующего состава в г/л: 2,4,5-Т — 100 мг, Na2HP04 — 6,0 г, КН2Р04 -3,0 г, NaCl — 0,5 г, NH4C1 — 1,0 г, микроэлементы по МБ. Федорову, рН 6,8−7,0 [Федоров, 1956]. Посевы производили в 3-х повторах для каждой отдельной колонии. Культуры инкубировали при +30°С, визуальную оценку роста проводили через сутки инкубации.

2.3. Учет численности бактерий в почве методом Коха.

Определение количества клеток микроорганизмов проводили с использованием метода Коха [Теппер и др., 1987].

Проводили поверхностный посев на плотные среды почвенной суспензии из разведений, полученных, как описано выше (раздел 2.2). Посев из каждого разведения проводили в 3 параллельных чашках. При определении количества бактерий в почве для посева на МПА использовали разведения 10″ 3. Для учета спорообразующих форм микроорганизмов применяли смешанный агар: МПА +сусло в отношении 1:1. Перед посевом почвенную суспензию из разведения 10″ 2 пастеризовали при 70 °C 15 мин. Учет численности грибов проводили на среде Чапека, используя разведение 10″ 2. Через 3−5 суток инкубации проводили подсчет числа колоний, выросших на поверхности засеянной среды. Данные выражали в виде средних величин с расчетом среднеквадратичных отклонений.

2.4. Идентификация штаммов.

Идентификацию штаммов проводили, руководствуясь стратегией фенотипической дифференциации бактерий, изложеннной в руководствах: «Идентификация почвенных бактерий рода Bacillus» [Скворцова, 1984], «Краткий определитель бактерий [Bergey, 1986], «Методы общей бактериологии» [Герхард, 1990].

2.5. Определение устойчивости штаммов к антибиотикам.

Определение устойчивости бактерий к антибиотикам проводили методом диффузии в агар с применением дисков [Лабинская, 1978]. Для этого в стерильные чашки Петри наливали 2% мясопептонный агар до оптимальной толщины слоя агара, равной 4−5 мм. Перед посевом чашки подсушивали в термостате для лучшей диффузии засеваемого материала в питательную среду. Для засева использовали по 1 мл 18−20 часовой культуры бактерий. Культуру равномерно распределяли по поверхности среды. Засеянные чашки 30−40 мин подсушивали в стерильных условиях при комнатной температуре. Затем на поверхности среды с помощью стерильного пинцета располагали диски, пропитанные антибиотиком. Диски с антибиотиками располагали на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии 2 см от края чашки. В каждую чашку помещали по 6 дисков. Чашки на 18 часов помещали в термостат при +30иС вверх дном, чтобы избежать попадания конденсата на поверхности посевов. Бактерии, чувствительные к антибиотикам, образовывали вокруг соответствующих дисков зоны угнетения роста, четко выделяющиеся на фоне сплошного роста культуры. Измерение зоны угнетения производили с помощью циркуля, учитывая, что диаметр зоны проходит через центр диска.

При зоне задержки роста бактерий диаметром до 10 мм штамм расценивался как малочувствительный, более 10 мм как чувствительный.

2.6. Выделение внехромосомных элементов генома бактерий.

Выделение внехромосомных элементов генома бактерий проводили с использованием метода щелочного лизиса с модификациями [Маниатис и др, 1984; Герхард, 1990]. Предварительно проводили проверку условий лизиса клеток исследуемых штаммов. Для этого клетки бактерий помещали на часовые стекла и обрабатывали лизирующими растворами, включая лизоцим в концентрации 10 мг/мл, раствор Brij, смесь 1% SDS и 0,2 М NaOH. Характер и степень лизиса оценивали визуально. Для выделения внехромосомных элементов генома биомассу наращивали при +30°С в условиях аэрации на термостатированной качалке УВМТ-12−250 до достижения значения оптической плотности клеточной суспензии ОДбоо 0,8 ОЕ. Далее клетки собирали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 минут, суспензировали в 1 мл буфера, содержащем 50 мМ глюкозы, 25 мМ Трис-НС1 рН 8,10 мМ ЭДТА. К суспензии клеток добавляли лизоцим, согласно подобранным ранее условиям, и далее инкубировали во льду. Затем к лизату добавляли 3 мл 0,2 М NaOH и 1% SDS, инкубировали до посветления лизата. Далее вносили 1,5 мл 5 М охлажденного ацетата калия. После 10-минутной инкубации в таящем льду лизат центрифугировали при 12 000 об/мин при +4°С 60 минут. К супернатанту добавляли РНКазу, А до конечной концентрации 2 мкг/мл и инкубировали 40 минут при комнатной температуре. Смесь депротенизировали 2 раза фенолом рН 8 и 1 раз хлороформом. Нуклеиновые кислоты осаждали 2,5 объемами этанола, осадок собирали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 минут, подсушивали на воздухе и растворяли в буфере 10 мМ Трис-HCl рН 7,4- 1 мМ ЭДТА, 10 мМ NaCl. Этот препарат использовали в дальнейшей работе.

2.7. Фракционирование препаратов ДНК в агарозном геле.

Фракционирование препаратов ДНК осуществляли методом электрофореза [Маниатис Т., 1984.], который проводили в трис-ацетатном (ТАЕ) буфере следующего состава: 15 мМ ЭДТА, ЮОмМ CH3COONa, 400 мМ Трис-HCl рН 7,5. Агарозный гель готовили из расчета 1 г агарозы на 100 мл раствора ТАЕ. Взвесь нагревали в бане с кипящей водой до гомогенного состояния. В заранее приготовленную плашку с гребенкой заливали раствор агарозы. После формирования геля осторожно удаляли гребенку и пластину помещали в камеру для электрофореза. Исследуемые пробы нуклеиновых кислот смешивали с буфером, содержащим 5% глицерина или 7% сахарозы и краситель (0,025% бромфенолового синего или 0,025% ксиленцианола). Пробы осторожно вносили в лунки геля, электрофорез проводили при напряжении 22 В в течение 16 часов. По окончании гель окрашивали в растворе бромистого"? этидиума в концентрации 0,5 мкг/мл [Sharp et al., 1973]. После окрашивания гель просматривали в проходящем УФ-свете и фотографировали на пленку «Микрат-300» через светофильтр ОС -12.

2.8. Элиминация плазмид, индуцированная бромистым этидием.

Элиминацию плазмид проводили по стандартной методике с небольшими модификациями [Герхард, 1990]. Процесс элиминации индуцировали бромистым этидием. На первом этапе работы проводили подбор оптимальной концентрации элиминирующего агента. Для этого из культуры исследуемого бактериального штамма, находившейся в фазе логарифмического роста, отбирали аликвоты и вносили по 103 -104 клеток в ряд пробирок с мясо-пептонным бульоном (МПБ). В МПБ отдельно добавляли бромистый этидий в различных концентрациях: 5мкг/мл, 50мкг/мл, 500мкг/мл, 5000мкг/мл. Культуры инкубировали в течение ночи при температуре +30 °С. После этого выбирали образец, в котором появлялась едва заметная мутность, и высевали его аликвоту на мясопептонный агар. Далее проверяли отдельные колонии на потерю функций, определяемых плазмидами. С целью подтверждения потери плазмид, проводили выделение и фракционирование препаратов плазмидной ДНК по методике, описанной выше (раздел 2.6.).

2.9. Рост культур в жидкой питательной среде и его учет.

Посевной материал бактерий получали выращиванием культур в разбавленном мясопептонном бульоне (1МПБ:7Н20) с добавлением 2,4,5-Т до конечной концентрации 100 мг/л при температуре +30°С. Полученный посевной материал засевали в количестве 0,01% от объема в жидкую питательную среду следующего состава в г/л: NH4CI — 1 г, К2НРО4 — 5 г, MgS04−7H20 — 50 мг, FeS04−7H20 — 5 мг CuS04−5H20 -1 мг, ZnS04 — 0,8 мг, 2,4,5-Т — 100 мг, рН — 6,8−7,0.

Культивирование проводили в термостатированных установках УВМТ-12−250 при 115−120 об/мин. Рост контролировали по изменению оптической плотности клеточной суспензии ОД590 с использованием фотоколориметра КФК-2 при длине волны 590 нм и чувствительности равной 2.

2.10. Рост культур в почве.

Посевной материал бактерий получали как описано в разделе 2.4. Далее в почву, содержащую 2,4,5-Т в концентрации 100 мг/кг, вносили посевной материал культур из расчета 105−106 колониеобразующих единиц на 1 г почвы.

Культивирование проводили в течение 48 суток в условиях естественного суточного колебания температур.

2.11. Определение количества 2,4,5-Т в культуральной жидкости.

Определение количества 2,4,5-Т в культуральной жидкости проводили согласно методам определения микроколичеств 2,4,5-Т с небольшими модификациями [Клисенко, 1984]. Для анализов отбирали пробы 10 мл культуральной жидкости. Пробы освобождали от клеток штамма центрифугированием при 5 тыс. об. / мин в течение 30 мин. Далее жидкость подкисляли до рН2 добавлением нескольких капель 1Н соляной кислоты. В каждую пробу добавляли в качестве стандарта 2,4-Д до конечной концентрации 100 мг/л. Затем из проб проводили 3-кратную экстракцию 2,4,5 Т и 2,4-Д равными объемами хлороформа. После экстракции хлороформ удаляли отгонкой на вакуумном роторном испарителе. Экстракты 2,4.5-Т и 2,4-Д метилировали, переводили в гексан и фракционировали методом тонкослойной хроматографии. Тонкослойную хроматографию проводили на пластинах силуфол UV-254 (Чехия). Сканирование образцов проводили при длине волны 260−280 нм в камере Хромоскана (Jouce-Loebl). Для визуальной оценки результатов хроматографии пластины обрабатывали 0,001% раствором бромкрезолового зеленого в 96% этаноле. Содержание 2,4,5-Т определяли по калибровочному графику для чистого стандарта 2,4-Д.

2.12. Анализ содержания 2,4,5-Т в почве.

Исследования процесса разложения 2,4,5-Т в почве проводили в условиях серой лесной почвы (горизонт А1). Для определения количества 2,4,5-Т в почве проводили отбор проб почвы в количестве 2 г. Пробы анализировали согласно стандартным методам с небольшими модификациями.

Клисенко, 1984]. К каждой пробе почвы добавляли по 10 мл дистиллированной воды. Суспензию встряхивали 20 минут на качалке при комнатной температуре. Данную процедуру повторяли 3 раза. Водную вытяжку объединяли и осветляли центрифугированием при 5 тыс. об. в мин. в течение 30 мин. Далее жидкость подкисляли до рН 2 добавлением нескольких капель 1Н соляной кислоты. В каждую пробу добавляли в качестве стандарта 2,4-Д до конечной концентрации 100 мг/л. Затем из проб 3-кратно экстрагировали 2,4,5-Т и 2,4-Д равными объемами хлороформа. После экстракции хлороформ удаляли отгонкой на вакуумном роторном испарителе. л.

Экстракты 2,4,5-Т и 2,4-Д метилировали, переводили в гексан и фракционировали методом тонкослойной хроматографии. Тонкослойную хроматографию и анализ содержания 2,4,5-Т проводили как описано выше в разделе 2.10.

2.13. Идентификация продуктов метаболизма 2,4,5-Т.

Для идентификации продуктов метаболизма в ходе инкубации штаммов отбирали пробы культуральной жидкости. Клетки бактерий из проб удаляли центрифугированием при 5 тыс.об. в мин. в течение 30 мин, затем 2,4,5-Т и продукты ее деградации трижды экстрагировали из проб равными объемами хлороформа и эфира. Хлороформ и эфир отгоняли на роторном вакуумном испарителе. Экстракты метилировали свежеприготовленным диазометаном, переводили в гексан, затем пробу подвергали анализу.

Анализ проб проводили на хроматомасс-спектрометре NERMAG R-30−10 с хроматографом Carlo Erba MEGA 5360. Условия анализа: капиллярная колонка 15 м х 0,25 мм, привитая фаза ДВ-1, растворитель — гексан, температура инжектора +200°С, интерфейса +250°С, колонки от +80°С до 250 °C, скорость нагрева 3,5 мин. Масс-спектры электронного удара получали при температуре источника ионов, равной +250°С, энергии электронов, равной 70 эВ.

Идентификацию полученных соединений осуществляли тю совокупности данных о временах удерживания соединений в хроматографической колонке, данных анализа масс-спектров, основанных на зависимости структура — характер распада. Интерпретацию данных проводили с использованием «внутреннего интеллекта» системы MS HP ChemStation. Система обработки данных MS HP ChemStation содержала библиотеку из 138 тыс. масс-спектров Base Date WILEY138L.

2.14. Физико-химические свойства и область применения фенола и его хлорированных производных.

Фенол — мол. вес 94, образует бесцветные кристаллы, розовеющие при хранении на воздухе. При температуре +65,3 °С фенол смешивается с водой в любых отношениях. Ниже этой температуры при растворении фенола в воде образуются два слоя: фенольная и водная фазы. При комнатной температуре фенол растворяется в воде до концентрации 7%. Хорошо растворим в спирте, эфире, ацетоне, хлороформе и других органических растворителях.

Фенол используется в качестве бактерицида и фунгицида. ЛД50 фенола составляет 427 мг/кг для мышей.

4-хлорфенол (4-ХФ) — мол. вес 128,56, обладает неприятным навязчивым запахом, температура плавления +32,8 °С, температура кипения +214 °С. Константа диссоциации 14×10″ 10. Трудно растворим в воде, хорошо растворим в спирте и эфире. Присутствует в качестве примеси в препарате гербицида 2,4-Д (А).

2,4-дихлорфенол (2,4-ДХФ) — мол. вес 164,91, белое кристаллическое вещество с характерным стойким запахом с температурой плавления +43−45 °С и температурой кипения +206−208 °С. Константа диссоциации 3,1×10″ 8. При температуре выше +25 °С легко дистиллируется с парами различных растворителей. Растворимость в воде при +20 °С составляет 4500 мг/л, в четыреххлористом углероде — 1600 мг/л, хорошо растворим в этаноле, хлороформе, диэтиловом эфире и бензоле. Стабилен при хранении. Присутствует в качестве примеси в препарате 2,4-Д (А).

2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) — м.в. 221, белое кристаллическое вещество, температура плавления +141 °С. Химические свойства обуславливаются ароматическим радикалом и присутствием карбоксильной группы. Представляет собой бесцветные негигроскопичные кристаллы, имеющие слабый фенольный запах. 2,4-Д — относительно сильная.

— 5 кислота (константа диссоциации 2,3×10″). Растворима в этаноле — около 130 г, в ацетоне — 85 г, в диэтиловом эфире — 27 г, в четыреххлористом углероде — 0,1 г на 100 мл, данные показателя растворимости в воде при комнатной температуре колеблются между 0,4 и 0,9 г/л. С органическими и неорганическими основаниями образует соли, достаточно устойчивые в твердом и жидком состоянии, со спиртами образует эфиры. 2,4-Д обладает свойствами гормона растений, (индолуксусной кислоты, ИУК), является действующим веществом препаратов гербицидов, включенных в «Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению в Российской федерации», в том числе следующих: 2,4-Д (А), аминопелик, дезормон, дикамин-Д, дикопур Ф, луварам, октапон, эстерон, лотус Д, диален, чисталан, лонтрим, трезор, ланцет, фенфиз, октиген. ЛД50 2,4-Д составляет 100 мг/кг для собак, 350−560 мг/кг для мышей, 0,35−5,2 мг/кг для рыб, допустимая суточная доза для человека 0,0001 мг/кг тела.

2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т) — мол. вес 255,49, бесцветные кристаллы, температура плавления 158 °C, растворима в ацетоне, хлороформе этаноле, изопропаноле (590 мг/кг), воде (238 мг/л). Обладает свойствами гормона растений, (индолуксусной кислоты, ИУК). Устойчива при хранении, с основаниями образует устойчивые соли. ЛД5о 2,4,5-Т составляет 100 мг/кг для собак, 389 мг/кг для мышей, 500 мг/кг для крыс. Применялась в качестве гербицида. В настоящее время к использованию в РФ запрещена.

Глава 3. Результаты и обсуждение 3.1. Поиск штаммов-деструкторов.

В публикациях, касающихся проблем микробиологической конверсии синтетических соединений, имеются многочисленные свидетельства того, что штаммы-деструкторы могут формироваться в качестве важных составляющих в сообществах микроорганизмов, подвергавшихся длительному воздействию ксенобиотиков [Форстер и др., 1990]. Такие штаммы становятся частью естественной микрофлоры, при этом использование чужеродных соединений в качестве источника углерода и энергии предопределяет их существенные черты и определяет экологическую нишу.

Учитывая приведенные выше наблюдения, для поиска штаммов, способных метаболизировать 2,4,5-Т, было выбрано 17 образцов почвы предприятий г. Уфы, производящих или использующих фенол и его хлорпроизводные в производственных циклах, а именно: УГПП «Химпром», ОАО «Дубитель», АО НУНПЗ, АО НПЗ. В работу также были вовлечены 3 пробы почвы берега реки Шугуровка, прилегающего к промзоне г. Уфы.

На первом этапе работы был проведен сравнительный анализ состава и соотношений некоторых групп микроорганизмов, входящих в биоценозы исследуемых образцов почвы. В качестве контроля использовалась усредненная проба почвы территории Зилаирского района Республики Башкортостан, удаленной от предприятий нефтехимического комплекса г. Уфы.

Из результатов анализа, приведенных в таблице 3, видно, что во всех микробных популяциях почв промзоны г. Уфы отмечалось присутствие сапрофитных бактерий. Вместе с тем, численность этой группы в большинстве случаев (94,1%) была существенно ниже контрольной, и только в одной пробе этот показатель превышал контроль.