Создание нового ингибитора Сурвивина на основе изучения опухолеспецифичных функций этого белка

V. Выводы.

1. Мутант Сурвивина, не способный к днмеризацин, эффективнее, чем Сурвивин дикого типа, защищает опухолевые клетки от каспаззависимого и каспазнезависимого апоптоза, однако, только Сурвивин дикого типа способен увеличивать стабильность микротрубочек в интерфазе. Таким образом, димеризация Сурвивина имеет важное значение для регуляции активности этого белка в клетках.

2. В ходе данной работы был синтезирован низкомолекулярный ингибитор Сурвивина, получивший название «LLP-3» и взаимодействующий с участком димеризации Сурвивина с константой диссоциации Kd ~ 0.2 цМ. Это соединение показало высокую способность ингибировать пролиферацию клеток глиобластомы и фибросаркомы человека in vitro и in vivo, вызывая нарушения в процессе митоза, остановку клеточного цикла и апоптоз. Такой эффект LLP-3 связан с ингибированием взаимодействия белков Сурвивин и Ran.

3. Белок Smac/DIABLO способен ингибировать взаимодействие Сурвивина и Ran in vitro и при индукции апоптоза in vivo.

4. Сурвивин, взаимодействуя с Ran, усиливает экспорт из ядра некоторых белков и РНК, что приводит к повышению экспрессии таких онкогенов как Трансглутаминаза 2 и SMOC2.

5.

Заключение

.

Экспрессия Сурвивина многократно повышена в раковых клетках, однако значит ли это, что Сурвивин жизненно необходим для опухолевой трансформации или же он всего лишь является маркёром некоторых событий, происходящих при превращении нормальных клеток в раковые? Ответ на этот вопрос был получен уже давно. Подавление экспрессии Сурвивина с помощью миРНК, вирусных частиц или рибозимов действительно приводит к гибели раковых клеток, что говорит о безусловной важности этого белка для опухолей. Однако ни один из перечисленных методов не применим для лечения больных, а все разработанные к настоящему моменту низкомолекулярные ингибиторы Сурвивина оказались недостаточно эффективны. На наш взгляд причина этих неудач может крыться в недостаточном понимании функций Сурвивина в клетках. До настоящего момента все усилия были направлены исключительно на поиск соединений, ингибирующих антиапоптозную активность этого белка. Но является ли это «самой важной» функцией Сурвивина в опухолевых клетках? Данные, впервые приведённые в этой работе, свидетельствуют об обратном. Мы показали, что Сурвивин через взаимодействие с малой вТРазой Ran способен регулировать процесс ядерного экспорта, вызывая целый каскад событий, придающих опухолям ряд наиболее опасных черт. Более того, в отличие от всех прочих функций Сурвивина, его взаимодействие с белком Ran является в полной мере опухолеспецифичным, так как только в раковых клетках экспрессия этих белков повышена настолько, что они могут взаимодействовать в интерфазе. Все эти данные, на наш взгляд, представляют большой фундаментальный интерес, а также могут послужить основой для создания новых противоопухолевых препаратов. Более того, исследования впервые описанного в данной работе ингибитора Сурвивина под названием «LLP-3» без сомнения будут продолжены, и, как мы надеемся, принесут ещё немало интересных результатов, так, например, нам уже удалось показать, что LLP-3 способен препятствовать росту опухолей in vivo (рис. 45).

Рис. 45. Влияние ЬЬР-З на размер опухоли при введении в мозг голым мышам стволовых клеток глиомы человека.

1. Dieuwke Engelsma, Jose A. Rodriguez, Alexander Fish, Giuseppe Giaccone, Maarten Fornerod. Homodimerization Antagonizes Nuclear Export of Survivin. (2007) Traffic. 8, 1495−1502.

2. Roland H. Stauber, Wolf Mann, and Shirley K. Knauer. Nuclear and Cytoplasmic Survivin: Molecular Mechanism, Prognostic, and Therapeutic Potential. (2007) Cancer Res. 67(13), 5999−6002.

3. С Mahotka, J Liebmann, M Wenzel, CV Suschek, M Schmitt, HE Gabbert, CD Gerharz. Differential subcellular localization of functionally divergent survivin splice variants. (2002) Cell Death and Differentiation. 9, 1334−1342.

4. Ambrosini, G., Adida, C., and Altieri, D. C. A novel anti-apoptosis gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma. (1997) Nat. Med. 3, 917−921.

5. Tong Liu, Brook Brouha, Douglas Grossman. Rapid induction of mitochondrial events and caspase-independent apoptosis in Survivin-targeted melanoma cells. (2004) Oncogene. 23, 39−48.

6. Ченцов Ю. С. «Введение в клеточную биологию». 2004, Академкнига, Москва, 494 с.

7. Hans Kristian Lorenzo, Santos A. Susin, Josef Penninger, Guido Kroemer. Apoptosis inducing factor (AIF): a phylogenetically old, caspase-independent effector of cell death. (1999) Cell Death and Differentiation. 6, 516−524.

8. Cristian Obiol-Pardo, Jose Manuel Granadino-Rolda'n, Jaime Rubio-Martinez. Proteinprotein recognition as a first step towards the inhibition of XIAP and Survivin anti-apoptotic proteins. (2008) J. Mol. Recognit. 21, 190−204.

9. Douglas J. Kominsky, l Ryan J. Bickel, l and Kenneth L. Tyler. Reovirus-Induced Apoptosis Requires Mitochondrial Release of Smac/DIABLO and Involves Reduction of Cellular Inhibitor of Apoptosis Protein Levels. (2002) J Virol. 76 (22), 11 414−11 424.

10. Takehiko Dohi, Elena Beltrami, Nathan R. Wall, Janet Plescia, and Dario C. Altieri. Mitochondrial survivin inhibits apoptosis and promotes tumorigenesis. (2004) J. Clin. Invest. 114, 1117−1127.

11. Zhiyin Song, Xuebiao Yao, Mian Wu. Direct Interaction between Survivin and Smac/DIABLO Is Essential for the Anti-apoptotic Activity of Survivin during Taxol-induced Apoptosis. (2003) J Biol Chem. 278 (25), 23 130−23 140.

12. Hetz C. BCL-2 protein family. Essential regulators of cell death. Preface. Adv Exp Med Biol. 2010;687: vii-viii.

13. Byoung Heon Kang, Dario C. Altieri. Regulation of Survivin Stability by the Aryl Hydrocarbon Receptor-interacting Protein. (2006) J Biol Chem. 281 (34), 24 721−24 727.

14. Paola Fortugno, Elena Beltrami, Janet Plescia, Jason Fontana, Deepti Pradhan, Pier Carlo Marchisio, William C. Sessa, Dario C. Altieri. Regulation of survivin function by Hsp90.2003) PNAS. 100, 13 791−13 796.

15. Zhiyin Song, Shixin Liu, He He, Naser Hoti, Yi Wang, Shanshan Feng, Mian Wu. A Single Amino Acid Change (Asp 53—>Ala53) Converts Survivin from Anti-apoptotic to Pro-apoptotic. (2004) Molecular Biology of the Cell. 15, 1287−1296.

16. Jian Zhao, Tencho Tenevl, Luis M. Martins, Julian Downward, Nicholas R. Lemoine. The ubiquitin-proteasome pathway regulates survivin degradation in a cell cycle-dependent manner. (2000) Journal of Cell Science 113, 4363−4371.

17. A. Arockia Jeyaprakash, Ulf R. Klein, Doris Lindner, Judith Ebert, Erich A. Nigg, Elena Conti. Structure of a Survivin-Borealin-INCENP Core Complex Reveals How Chromosomal Passengers Travel Together. (2007) Cell. 131, 271−285.

18. Chaohong Sun, David Nettesheim, Zhihong Liu, Edward T. Olejniczak. Solution Structure of Human Survivin and OOOOIts Binding Interface with Smac/Diablo. (2005) Biochemistry. 44, 11−17.

19. John Silke, David L. Vaux. Two kinds of BIR-containing protein inhibitors of apoptosis, or required for mitosis. (2000) Journal of Cell Science. 114, 1821−1827.

20. Marlene Delacour-Larose, My-Nhung Hoang Thi, Stefan Dimitrov, Annie Molla. Role of Survivin Phosphorylation by Aurora B in Mitosis. (2007) Cell Cycle. 6, 1878−1885.

21. Susanne M.A. Lens. Rene H. Medema. The Survivin/Aurora B Complex Its Role in Coordinating Tension and Attachment. (2003) Cell Cycle. 2, 507−510.

22. Keen N., Taylor S. Aurora-kinase inhibitors as anticancer agents. (2004) Nat Rev Cancer. 4, 927−936.

23. Sally P. Wheatley, Iain A. McNeish. Survivin: A Protein with Dual Roles in Mitosis and Apoptosis. (2005) Int. Rev. Cytol. 247, 35−88.

24. Ambrosini G, Adida C, Altieri DC. A novel anti-apoptosis gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma. (1997) Nat Med. 3,917−21.

25. Hsu, Y. T., K. G. Wolter, and R. J. Youle. (1997). Cytosol-to-membrane redistribution of Bax and Bcl-X (L) during apoptosis. (1997) Proc Natl Acad Sci USA. 94(8): 3668−72.

26. Srinivasa M. Srinivasula and Jonathan D. Ashwell. IAPs: What’s in a name? (2008) Mol Cell. 25- 30(2): 123−135.

27. Jack Rosa, Pedro Canovas, Ashraful Islam, Dario C. Altieri, Stephen J. Doxsey. Survivin Modulates Microtubule Dynamics and Nucleation throughout the Cell Cycle. (2006) Molecular Biology of the Cell. 17, 1483−1493.

28. Altieri DC. Survivin, versatile modulation of cell division and apoptosis in cancer. (2003) Oncogene. 24−22(53):8581−9.

29. Takehiko Dohi, Fang Xia, Dario C. Altieri. Compartmentalized phosphorylation of IAP by protein kinase A regulates cytoprotection. (2007) Mol Cell. 27 (1), 17−28.

30. Shirley K. Knauer, Carolin Bier, Negusse Habtemichael, Roland H. Stauber. (2006) EMBO reports. 7: 1259−1265.

31. Shirley K. Knauer, Wolf Mann, Roland H. Stauber. Survivin’s Dual Role (2007) Cell Cycle 6:5,518−521,.

32. Jagadish C. Ghosh, Takehiko Dohi, Byoung Heon Kang, Dario C. Altieri. Hsp60 Regulation of Tumor Cell Apoptosis. (2008) J Biol Chem. 283 (8), 5188−519 496.

33. Queenie P. Vong, Kan Cao, Hoi Y. Li, Pablo A. Iglesias, Yixian Zheng. Chromosome Alignment and Segregation Regulated by Ubiquitination of Survivin (2005) Science 310, 1499−1504.

34. Boyce M, Yuan J. Cellular response to endoplasmic reticulum stress: a matter of life or death. (2006) Cell Death Differ. 13(3), 363−73.

35. Hiroyuki Marusawa, Shu-ichi Matsuzawa, Kate Welsh, Hua Zoul, Robert Armstrong, Ingo Tamm, John C.Reed. HBXIP functions as a cofactor of survivin in apoptosis suppression. (2003) The EMBO Journal 22 (11). 2729−2740.

36. Xiaomei Yan, Lihuan Cao, Qiang Li, Yanhua Wu, Haoxing Zhang, Hexige Saiyin, Xianghua Liu, Xuqing Zhang, Qinghua Shi, Long Yu. Aurora C is directly associated with Survivin and required for cytokinesisn. (2005) Genes to Cells 10, 617−626.

37. Oliver J. Gruss, Isabelle Vernos. The mechanism of spindle assembly: functions of Ran and its target TPX2. (2004) The Journal of Cell Biology, Volume 166, Number 7, 949−955.

38. Fang Xia, Pedro M. Canovas, Thomas M. Guadagno, Dario C. Altieri. A Survivin-Ran Complex Regulates Spindle Formation in Tumor Cells. (2008) Mol Cell Biol. 28 (17), 52 995 311.

39. Dario C Altieri. The case for survivin as a regulator of microtubule dynamics and cell-death decisions. (2006) Current Opinion in Cell Biology. 18:609−615.

40. Dario C Altieri. New wirings in the survivin networks. (2008) Oncogene. October 20- 27(48): 6276−6284.

41. Grossman D, McNiff JM, Li F, Altieri DC. Expression and targeting of the apoptosis inhibitor, survivin, in human melanoma. (1999) J Invest Dermatol. 113(6): 1076−81.

42. Ling X, Li F. Silencing of antiapoptotic survivin gene by multiple approaches of RNA interference technology. (2004) Biotechniques. 36(3):450−4, 456−60.

43. Mesri M, Wall NR, Li J, Kim RW, Altieri DC. Cancer gene therapy using a survivin mutant adenovirus. (2001) J Clin Invest. 108 (7). 981−90.

44. Michael D. Wendt, Chaohong Sun, Aaron Kunzer, et al. Discovery of a novel small molecule binding site of human survivin. (2007) Bioorg. Med. Chem. Lett. 17. 3122−3129.

45. Altieri D. C. Survivin, cancer networks and pathway-directed drug discovery. (2008) Nat. Rev. Cancer 8, 61−70.

46. Wang H., Holloway M. P., Ma L., Cooper Z. A., Riolo M., Samkari A., Elenitoba-Johnson K. S., Chin Y. E., and Altura R. A. Acetylation directs survivin nuclear localization to repress STAT3 oncogenic activity. (2010) J. Biol. Chem. 285, 36 129−36 137.

47. Henkels K. M., and Turchi J. J. Cisplatin-induced apoptosis proceeds by caspase-3-dependent andindependent pathways in cisplatin-resistant andsensitive human ovarian cancer cell lines. (1999) Cancer Res. 59, 3077−3083.

48. Yang X., Fraser M., Abedini M. R., Bai T., and Tsang B. K. Regulation of apoptosis-inducing factor-mediated, cisplatin-induced apoptosis by Akt. (2008) Br. J. Cancer 98, 803 808.

49. Chen J. T., Huang C. Y., Chiang Y. Y., Chen W. H., Chiou S. H., Chen C. Y., and Chow K. C. HGF increases cisplatin resistance via down-regulation of AIF in lung cancer cells. (2008) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 38, 559−565.

50. Watanabe A., Taniguchi F., Izawa M., Suou K., Uegaki T., Takai E., Terakawa N., and Harada T. The role of survivin in the resistance of endometriotic stromal cells to drug-induced apoptosis. (2009) Hum. Reprod. 24, 3172−3179.

51. Chantalat L., Skoufias D. A., Kleman J. P., Jung B., Dideberg O., and Margolis R. L. Crystal structure of human survivin reveals a bow tie-shaped dimer with two unusual alpha-helical extensions. (2000) Mol. Cell 6, 183−189.

52. Pavlyukov MS, Antipova NV, Balashova MV, Vinogradova TV, Kopantzev EP, Shakhparonov MI. Survivin monomer plays an essential role in apoptosis regulation. (2011) J Biol Chem. 286 (26), 23 296−23 307.

53. Pathria G, Wagner C, Wagner SN. Inhibition of CRM 1-mediated nucleocytoplasmic transport: triggering human melanoma cell apoptosis by perturbing multiple cellular pathways. (2012) J Invest Dermatol. 132(12), 2780−90.

54. Barres V, Ouellet V, Lafontaine J, Tonin PN, Provencher DM, Mes-Masson AM. An essential role for Ran GTPase in epithelial ovarian cancer cell survival. (2010) Mol Cancer. 9, 272.

55. Milano SK, Kwon W, Pereira R, Antonyak MA, Cerione RA. Characterization of a novel activated Ran GTPase mutant and its ability to induce cellular transformation. (2012) J Biol Chem. 287 (30), 24 955−66.

56. Ly TK, Wang J, Pereira R, Rojas KS, Peng X, Feng Q, Cerione RA, Wilson KF. Activation of the Ran GTPase is subject to growth factor regulation and can give rise to cellular transformation. (2010) J Biol Chem. 285 (8), 5815−26.

57. Hutchins JR, Moore WJ, Clarke PR. Dynamic localisation of Ran GTPase during the cell cycle. (2009) BMC Cell Biol. 10, 66.

58. Arnaoutov A, Dasso M. Ran-GTP regulates kinetochore attachment in somatic cells. (2005) Cell Cycle. 4(9), 1161−5.

59. Melchior F, Guan T, Yokoyama N, Nishimoto T, Gerace L. GTP hydrolysis by Ran occurs at the nuclear pore complex in an early step of protein import. (1995) J Cell Biol. 131 (3), 57 181.

60. Melchior F. Ran GTPase cycle: One mechanism two functions. (2001) Curr Biol. 11 (7), R257−60.

61. Gorlich D, Pante N, Kutay U, Aebi U, Bischoff FR. Identification of different roles for RanGDP and RanGTP in nuclear protein import. (1996) EMBO J. 15 (20), 5584−94.

62. Iyer J, Tsai MY. A novel role for TPX2 as a scaffold and co-activator protein of the Chromosomal Passenger Complex. (2012) Cell Signal. 24 (8), 1677−89.

63. Nguyen KT, Holloway MP, Altura RA. The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease. (2012) Int J Biochem Mol Biol. 3 (2), 137−51.

64. Budhu AS, Wang XW. Loading and unloading: orchestrating centrosome duplication and spindle assembly by Ran/Crml. (2005) Cell Cycle. 4 (11), 1510−4.

65. Yamaguchi R, Newport J. A role for Ran-GTP and Crml in blocking re-replication. (2003) Cell. 113 (1), 115−25.

66. Moss DK, Wilde A, Lane JD. Dynamic release of nuclear RanGTP triggers TPX2-dependent microtubule assembly during the apoptotic execution phase. (2009) J Cell Sei. 122 (Pt 5), 644−55.

67. Koyama M, Matsuura Y. An allosteric mechanism to displace nuclear export cargo from CRM1 and RanGTP by RanBPl. (2010) EMBO J. 29 (12), 2002;13.

68. Koffa MD, Casanova CM, Santarella R, Kocher T, Wilm M, Mattaj IW. HURP is part of a Ran-dependent complex involved in spindle formation. (2006) Curr Biol. 16 (8), 743−54.

69. Kalab P, Pralle A, Isacoff EY, Heald R, Weis K. Analysis of a RanGTP-regulated gradient in mitotic somatic cells. (2006) Nature. 440 (7084), 697−701.

70. Abu-Arish A, Kalab P, Ng-Kamstra J, Weis K, Fradin C. Spatial distribution and mobility of the Ran GTPase in live interphase cells. (2009) Biophys J. 97 (8), 2164−78.

71. Xia F, Lee CW, Altieri DC. Tumor cell dependence on Ran-GTP-directed mitosis. (2008) Cancer Res. 68 (6), 1826−33.

72. Silverman-Gavrila RV, Wilde A. Ran is required before metaphase for spindle assembly and chromosome alignment and after metaphase for chromosome segregation and spindle midbody organization. (2006) Mol Biol Cell. 17 (4), 2069;80.

73. Scheffzek K, Klebe C, Fritz-Wolf K, Kabsch W, Wittinghofer A. Crystal structure of the nuclear Ras-related protein Ran in its GDP-bound form. (1995) Nature. 374 (6520), 378−81.

74. Li HY, Ng WP, Wong CH, Iglesias PA, Zheng Y. Coordination of chromosome alignment and mitotic progression by the chromosome-based Ran signal. (2007) Cell Cycle. 6 (15), 1886−95.

75. Di Fiore B, Ciciarello M, Lavia P. Mitotic functions of the Ran GTPase network: the importance of being in the right place at the right time. (2004) Cell Cycle. 3 (3), 305−13.

76. Tedeschi A, Ciciarello M, Mangiacasale R, Roscioli E, Rensen WM, Lavia P. RANBP1 localizes a subset of mitotic regulatory factors on spindle microtubules and regulates chromosome segregation in human cells. (2007) J Cell Sci. 120 (Pt 21), 3748−61.

77. Yudin D, Fainzilber M. Ran on tracks—cytoplasmic roles for a nuclear regulator. (2009) J Cell Sci. 122 (Pt 5), 587−93.

78. Di Fiore B, Ciciarello M, Mangiacasale R, Palena A, Tassin AM, Cundari E, Lavia P. Mammalian RanBPl regulates centrosome cohesion during mitosis. (2003) J Cell Sci. 116 (Pt 16), 3399−411.

79. Kehlenbach RH, Assheuer R, Kehlenbach A, Becker J, Gerace L. Stimulation of nuclear export and inhibition of nuclear import by a Ran mutant deficient in binding to Ran-binding protein 1. (2001) J Biol Chem. 276 (17), 14 524−31.

80. Clarke PR, Zhang C. Spatial and temporal coordination of mitosis by Ran GTPase. (2008) Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (6), 464−77.

81. Renault L, Kuhlmann J, Henkel A, Wittinghofer A. Structural basis for guanine nucleotide exchange on Ran by the regulator of chromosome condensation (RCC1). (2001) Cell. 105 (2), 245−55.

82. Monecke T, Haselbach D, Vol3 B, Russek A, Neumann P, Thomson E, Hurt E, Zachariae U, Stark H, Grubmuller H, Dickmanns A, Ficner R. Structural basis for cooperativity of CRM1 export complex formation. (2013) Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 960−5.

83. Lam AP, Dean DA. Progress and prospects: nuclear import of nonviral vectors. (2010) Gene Ther. 17 (4), 439−47.

84. Cheng Y, Dahlberg JE, Lund E. Diverse effects of the guanine nucleotide exchange factor RCC1 on RNA transport (1995). Science. 267 (5205), 1807−10.