Сравнение каталитических механизмов растворимых пирофосфатаз двух семейств

Выводы.

1. Сродство к фосфату поддентра Р2 активного центра пирофосфатаз семейства I (из дрожжей и Е. coli) резко возрастает в присутствии ионов.

2 j л | л | переходных металлов (Мп, Со и Zn) по сравнению с Mg. Это приводит к тому, что стадия выхода Р, из подцентра Р2 замедляется и становится скорость-определяющей, что объясняет низкую эффективность гидролиза PPj РРазами семейства I в присутствии ионов переходных металлов. Для пирофосфатаз семейства II (из S. gordonii и S. mutans) замена Mg на ионы переходных металлов не оказывает такого влияния на сродство к фосфату, которое в присутствии всех проверенных ионов металлов ниже, чем для пирофосфатаз семейства I.

2. Порядок выхода двух молекул фосфата, образующихся при гидролизе пирофосфата, из активного центра пирофосфатазы дрожжей зависит от природы металла-кофактора: молекула фосфата, образовавшаяся из электрофильной группы субстрата и занимающая подцентр Р2, покидает фермент первой в присутствии Mg2+ и второй в присутствии ионов переходных металлов. Для пирофосфатазы S. gordonii порядок выхода двух молекул фосфата не зависит от природы металла-кофактора в центре Ml — первой всегда выходит молекула фосфата, образовавшаяся из электрофильной группы субстрата.

3. Активность пирофосфатаз двух семейств в гидролизе АТР коррелирует со сродством к фосфату подцентра Р2, откуда следует, что его взаимодействие с терминальной группой АТР является ключевым для продуктивного связывания этого объемистого субстрата.

4. Каталитический цикл пирофосфатаз семейства I содержит стадию изомеризации комплекса с пирофосфатом. Катализ пирофосфатазами семейства II не содержит этой стадииследовательно, одна из форм комплекса с пирофосфатом отсутствует или присутствует в стехиометрически незначимых количествах.

5. Из всех проверенных металловкофакторов (Мп, Со, Zn, Mg, CaZT) Zn2″ связывается с пирофосфатазой S. gordonii с наибольшим сродством (Кл = 1,4−10″ 1:2 М) и стабилизирует особую, малоактивную конформацию фермента.

Заключение

.

РРазы образуют два семейства, внутри каждого из которых наблюдается гомология по первичной и пространственной структурам, но между членами разных семейств гомологии нет. Несмотря на это, основной принцип строения активного центра одинаков для двух семейств, что предполагает сходство механизмов катализа. С другой стороны, важные характеристики фермента (зависимость от природы иона метала-активатора, величины ксп, и др.) у представителей различных семейств существенно различаются. Изучение кинетических характеристик ферментов двух семейств, проведенное в настоящей работе, позволило внести ясность в этот вопрос.

Наиболее существенное различие кинетических схем катализа для ферментов двух семейств заключается в числе интермедиатов катализа. Анализ ингибирования Р'-ионом и компьютерное моделирование показывают, что РРазы семейства I образуют два последовательных интермедиата, содержащие молекулу пирофосфата — ЕРРи ЕРР-. В случае же РРаз семейства II кинетически виден только один интермедиат, т. е. на энергетическом профиле между состояниями Е + РРи ЕРР, имеется только один энергетический барьер.

Каковы возможные структурные основы этого различия? В обоих ферментах связывание субстрата вызывает изменение конформации активного центра (см. обзор литературы). В случае семейства I активный центр представляет собой полость на поверхности фермента, и в результате связывания субстрата происходит уплотнение структуры активного центра, сопровождающееся вытеснением нескольких молекул Н2О. В отсутствие субстрата между ионами М1 и М2 (рис. 1, 2) располагаются две молекулы Н20, но при связывании субстрата одна из них вытесняется, и это превращает оставшуюся молекулу в активный нуклеофил. По современным представлениям [42, 43, 120], в интермедиате ЕРР-, который образуется после связывания РР-, между ионами металлов М1 и М2 сохраняются две молекулы Н20. Далее одна из них вытесняется в результате конформационных изменений, вызванных молекулой субстрата, и интермедиат.

EPPj переходит в EPPj. У РРаз семейства II активный центр расположен между двумя доменами и его структура в гораздо большей степени индуцируется субстратом, вызывающим их сближение. В отсутствие субстрата домены «раскрыты» на угол в 90−100° относительно общего «шарнира». Таким образом, наличие только одного интермедиата ЕРР, в кинетической схеме катализа Sg-РРазой означает, что сближение доменов с образованием структуры, способной к гидролизу PPj, протекает в одну стадию. Вероятно, взаимодействие PPj с «открытой» конформацией фермента достаточно слабое, так что интермедиат, соответствующий EPPj, не имеет минимума на кривой энергия — «координата реакции». Связывание субстрата с одновременным образованием «закрытой» конформации соответствует непосредственному переходу в EPPj.

Слабое связывание субстрата, его аналогов и продукта реакции (Pj) РРазами семейства II по сравнению с РРазами семейства I, вероятно, обусловлено большей открытостью активного центра в свободном ферменте.

РРазы семейства II показывают высокую избирательность центра высокого сродства (М1) к ионам переходных металлов по сравнению с Mg2+, что не наблюдается для РРаз семейства I. Сродство центра М1 РРаз семейства II к ионам переходных металлов на 3−4 (а в случае Zn2+ на 7) порядков выше, чем к иону Mg2+. У РРаз семейства I эта разница составляет всего один порядок [2, 123]. Видимо, это обусловлено тем, в РРазах семейства I центр М1 образован только О-лигандами (Asp и Glu), а в РРазах семейства II также и N-лигандами (His), которые образуют с ионами переходных металлов более прочные комплексы [7, 8].

Исключительная прочность связывания Zn РРазами семейства II, вероятно, является причиной описанных в этой работе особенностях активации ионами Zn2 ', которые вызывает кооперативный переход димера Sg-РРазы в особую, малоактивную форму. Формы Sg-РРазы с Zn и.

Mn2+/Mg2+ в центре M1, предположительно, различаются конформацией, и движущей силой конформационного перехода, вероятно, является очень прочное связывание Zn2+. Интересно, что связывание Zn2+ только в одной субъединице димера, вызывает кооперативный переход всего димера в конформацию, характерную для Zn-Sg-РРазы. Вероятно, это обусловлено тем, что Zn2+ вызывает значительные конформационные изменения, которые не могут произойти независимо в одной субъединице. Эти изменения, по-видимому, отличаются от изменений, вызываемых связыванием других металлов-активаторов в центре М1 (а о том, что они есть, свидетельствует сильная стабилизации димера), о чем свидетельствует то, что активность формы BjZriMn не равна полусумме активностей Е2Мп2 и E2Z112. Таким образом, ион Zn2+ проявляет в отношении Sg-РРазы свойства, характерные для аллостерических лигандов [135].

В присутствии Мп2+ и ионов других переходных металлов связывание P? в центре Р1 РРазами семейства I резко упрочняется. Это приводит к сильному замедлению выхода продуктов реакции гидролиза PP? из активного центра. Кроме того, сильное увеличение сродства центра Р1 к терминальным фосфатным группам полифосфатов, в том числе и органических (АТР), резко увеличивает прочность их связывания в активном центре РРаз семейства I и скорость гидролиза. Таким образом, ключевую роль в изменении субстратной специфичности РРаз семейства I в присутствии ионов переходных металлов играет усиление связывания фосфатной группы субстрата в центре Р1. В случае же РРаз семейства II связывание Р, в активном центре в присутствии ионов переходных металлов изменяется незначительно. Поэтому в присутствии Мп удаление продукта реакции из активного центра РРаз семейства II не замедляется, а гидролиз связанного PP? ускоряется за счет большей поляризующей способности Мп2+.

Интересно, что прочность связывания P? с РРазами семейства I в присутствии ионов различных металлов коррелирует с произведением растворимости фосфатных солей соответствующих металлов. Это согласуется с представлением о фермент-субстратном комплексе РРазы как «миниминерале» с множеством координационных связей металл-Pj [1].

Два семейства РРаз являются ярким примером конвергентной эволюции, в результате которой возникли структурно подобные активные центры [46]. Интересно сравнить эффективность действия РРаз семейств 1 и II in vivo. Известно, что организмы, содержащие РРазы семейства II, в отличие от организмов, содержащих РРазы семейства I, в процессе жизнедеятельности накапливают существенные количества ионов Мп [46]. Таким образом, in vivo, вероятно,.

1. Cooperman В. S., Baykov A. A. and Lahti R. Evolutionary conservation of the active site of soluble inorganic pyrophosphatase. TIBS, 1992, vol.17, pp. 262−266.

2. Buttler L. G. Yeast and other inorganic pyrophosphatases. The enzymes (Boyer, P. D., ed.), 1971, vol. 4., pp. 529−541, Academic Press, New York.

3. Shintani T., Uchiumi T., Yonezava T., Salminen A., Baykov A. A., Lahti R., Hachimori A. Cloning and expression of unique inorganic pyrophosphatase from Bacilus Subtilis: evidence for a new family of enzymes. FEBS Letters, 1988, vol. 439, pp. 263 266.

4. Heikenheimo P., Lehtonen J., Baykov A., Lahti R., Cooperman B. S., and Goldman A. The structural basis for pyrophosphatase catalysis. Structure, 1996, vol. 4, pp.1491−1508.

5. Merckel M. C., Fabrichniy I. F., Salminen A., Kallckinen N., Baykov A. A., Lahti R., Goldman A. Crystal structure oi Streptococcus /nutans pyrophosphatase: a new fold for an old mechanism. Structure, vol. 9, pp. 289−297.

6. Ahn Sh., Milner A. J., Futterer K., Konopka M., Ilias M., Young T. W., White S. A. The «open» and «closed» structures of the type-C inorganic pyrophosphatases from Bacilus subtilus and Streptococcus gordonii. J. Mol. Biol., 2001, vol. 313, pp. 797−811.

7. Kartkare J., Neal G. S., Salminen Т., Glumhoff Т., Cooperman В. S., Lahti R., and Goldman A. The structure of Escherichia coli soluble inorganic pyrophosphatase at 2.7 A resolution. Prot. Eng., 1994, vol. 7, pp. 823−830.

8. Kanlcare J., Salminen Т., Lahti R., Cooperman B. S., Baykov A. A. and Goldman A. The structure of Escherichia coli inorganic pyrophosphatase at 2.2 A resolution. Acta Crystal., 1996, vol. 52, pp. 551−563.

9. Kankare J., Salminen Т., Lahti R., Cooperman B. S., Baykov A. A. and Goldman A. Crystallographic identification of metal-binding sites in Escherichia coli inorganic pyrophosphatase. Biochemistry, 1996, vol. 35, pp. 4671−4677.

10. Куранова И. П., Терзян С. С., Воронова А. А., Смирнова Е. А., Вайнштейн Б. К. Строение активного центра неорганической пирофосфатазыдрожжей на основании результатов рентгеноструктурного исследования. Биоорг. химия, 1983, том 9, стр. 1611−1619.

11. Lahti R., Salminen Т., Latonen S., Heikinheimo P., Pohjanoksa K., and Heinonen J. Genetic Engineering of Escherichia coli inorganic pyrophosphatase. Tyr55 and Tyrl41 are important for structural integrity. Eur. J. Biochem., 1991, vol. 198, pp. 293−297.

12. Avaeva S., Ignatov P., Kurilova S., Nazarova Т., Rodina E., Vorobyeva N., Oganessyan V., Harutyunyan E. Escherichia coli inorganic pyrophosphatase: site-directed mutagenesis of metal binding sites. FEBS Letters, 1996, vol. 399, pp. 99−102.

13. Cooperman B. S. The mechanism of action of yeast inorganic pyrophosphatase. Meth. Enzymol., 1982, vol. 87, pp. 526−548.

14. Baykov A. A., Shestakov A. S., Kasho V. N., Vener A. V., Ivanov A. H. Kinetics and thermodynamics of catalysis by the inorganic pyrophosphatase of Escherichia coli in both directions. Eur. J.Biochem. 1990, vol. 194, pp. 879−887.

15. Janson C. A., Degani C., and Boyer P. D. The formation of enzyme-bound and medium pyrophosphate and molecular basis of the oxygen exchange reaction of yeast inorganic pyrophosphatase. J. Biol. Chem. 1979. vol. 254, pp. 3743−3749.

16. Springs B., Welsh K. M. and Cooperman B. S. Thermodynamics, kinetics and mechanism in yeast inorganic pyrophosphatase catalysis of inorganic pyrophosphate: inorganic phosphate equilibration. Biochemistry, 1981, vol. 20, pp. 6384−6391.

17. Smirnova I. N., Shestakov A. S., Dubnova E. B. and Baykov A. A. Spectral and kinetic studies of phosphate and magnesium ion binding to yeast inorganic pyrophosphatase. Eur. J. Biochem., 1989, vol. 182, pp. 451−456.

18. Baykov A. A., Kiitia T., Volk S. E., Kasho V. N., Vener A. V., Goldman A., Lahti R., and Cooperman B. S. Catalysis by Escherichia coli inorganic pyrophosphatase: pH and Mg2+ dependence. Biochemistry, 1996, vol. 35, pp. 4655−4661.

19. Baykov A. A. and Shestakov A. A. Two pathways of pyrophosphate hydrolysis and synthesis by yeast inorganic pyrophosphatase. Eur. J. Biochem., 1992, vol. 206, pp. 463−470.

20. ICapyla J., Hyytia Т., Lahti R., Goldman A., Baykov A. A., and Cooperman B. S. Effect of D97E substitution on the kinetic and thermodynamic properties of Escherichia coli inorganic pyrophosphatase. Biochemistry, 1995, vol. 34, pp. 792−800.

21. Avaeva S. M., Rodina E. V., Kurilova S. A., Nazarova Т. I., VorobyevaN. N. Effect of D42N substitution in Escherichia coli inorganic pyrophosphatase on catalytic activity and Mg2+ binding. FEBS Letters, 1996, vol. 392, pp. 91−94.

22. Банков А. А., Шестаков А. С., Павлов A. P., Смирнова И. H., Ларионов В. Н., Аваева С. М. Взаимодействие фосфата и ионов марганца с неорганической пирофосфатазой дрожжей. Биохимия, 1989, том 54, стр. 796−803.

23. Cooperman В. S., Panackal A., Springs В. and Hamm D. J. Divalent Metal Ion, Inorganic Phosphate and Inorganic Phosphate Analogue Binding to Yeast Inorganic Pyrophosphatase. Biochemistry, 1981, vol. 20, pp. 6051−6060.

24. M. J. Schlesinger, M. J. Coon. Hydrolysis of nucleoside diand triphosphates by crystalline preparations of yeast inorganic pyrophosphatase. Biochim. Biophys. Acta, 1960, vol. 41, pp. 30−36.

25. Baykov A. A., Hyytia T" Turkina M. V., Efimova I. S., Kasho V. N. Goldman A., Cooperman B. S., Lahti R. Functional characterization of Escherichia coli inorganic pyrophosphatase in zwitterionic buffers. Eur J Biochem., 1999, vol. 260, pp. 308−317.18.

26. Hackney D. D. Teoretical analysis of distribution of 0. Pj species during exchange with water. J. Biol. Chem., 1980, vol. 255, pp. 5320−5328.

27. Heikinheimo P, Tuominen V, Ahonen AK, Teplyakov A, Cooperman BS, Baykov AA, Lahti R, Goldman A. Toward a quantum-mechanical description of metal-assisted phosphoryl transfer in pyrophosphatase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, vol. 98, pp. 3121−3126.

28. ShizawaN., Uchiumi T., Taguchi J., KisselevaN. A., Baykov A. A., Lahti R., Hachimori A. Directed mutagenesis studies of the C-terminal fingerprint region of Bacillus subtilis pyrophosphatase. Eur. J. Biochem., 2001 vol. 268, pp. 5771−5775.

29. Konopka M. A., White S. A., Young T. W. Bacillus subtilis inorganic pyrophosphatase: the C-terminal signature sequence is essential for enzyme activity and conformational integrity. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002, vol. 290, pp. 806 812.

30. Thunnissen M. M., Taddei N., Liguri G., Ramponi G., Nordlund P. Crystal structure of common type acylphosphatase from bovine testis. Structure, 1997, vol. 5, pp. 69−79.

31. Pastore A., Saudek V., Ramponi G., Williams R. J. Three-dimensional structure of acylphosphatase. Refinement and structure analysis. J Mol. Biol., 1992, vol. 224, pp. 427−440.

32. Thunnissen M. M., Agango E. G., Taddei N., Liguri G., Cecchi C., Pieri A., Ramponi G., Nordlund P. Crystallisation and preliminary X-ray analysis of the 'common-type' acylphosphatase. FEBS Lett., 1995, vol. 364, pp. 243−244.

33. Gabelli S. B., Bianchet M. A., Bessman M. J., Amzel L. M. The structure of ADP-ribose pyrophosphatase reveals the structural basis for the versatility of the Nudix family. Nat. Struct. Biol., 2001, vol. 8, pp. 467−472.

34. Gasmi L., Cartwright J. L., McLennan A. G. Cloning, expression and characterization of YSA1H, a human adenosine 5'-diphosphosugar pyrophosphatase possessing a MutT motif. Biochem. J., 1999, vol. 344, pp. 331−337.

35. Bessman M. J., Friclc D. N., O’Handley S. F. The MutT proteins or «Nudix» hydrolases, a family of versatile, widely distributed, «housecleaning» enzymes. J. Biol. Chem., 1996, vol. 271, pp. 25 059−25 062.

36. Gabelli S. B., Bianchet M. A., Ohnishi Y., Ichikawa Y., Bessman M. J., Amzel L. M. Mechanism of the Escherichia coli ADP-ribose pyrophosphatase, a Nudix hydrolase. Biochemistry, 2002, vol. 41, pp. 9279−9285.

37. Boekema E. J., Berden J. A., van Heel M. G. Structure of mitochondrial Fl-ATPase studied by electron microscopy and image processing. Biochim. Biophys. Acta, 1986, vol. 851, pp. 353−360.

38. Abrahams J. P., Lutter R., Todd R. J., van Raaij M. J., Leslie A. G., Walker J. E. Inherent asymmetry of the structure of Fl-ATPase from bovine heart mitochondria at 6.5 A resolution. EMBO J., 1993, vol. 12, pp. 1775−1780.

39. Abrahams J. P., Leslie A. G., Lutter R., Walker J. E. Structure at 2.8 A resolution of Fl-ATPase from bovine heart mitochondria. Nature, 1994, vol. 370, pp. 621−628.

40. Abrahams J. P., Buchanan S. K., Van Raaij M. J., Fearnley I. M., Leslie A. G., Walker J. E. The structure of bovine Fl-ATPase complexed with the peptide antibiotic efrapeptin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, vol. 93, pp. 9420−9424.

41. Losel R. M., Wise J. G., Vogel P. D. Asymmetry of catalytic but not of noncatalytic sites on Escherichia coli Fl-ATPase in solution as observed using electron spin resonance spectroscopy. Biochemistry, 1997, vol. 36, pp.1188−1193.

42. Lobau S., Weber J., Senior A. E. Nucleotide occupancy of Fl-ATPase catalytic sites under crystallization conditions. FEBS Lett., 1997, vol. 404, pp.15−18.

43. Weber J., Senior A. E. Catalytic mechanism of Fl-ATPase. Biochim. Biophys. Acta 1997, vol. 1319, pp. 19−58.

44. Bianchet M. A., Hullihen J., Pedersen P. L., Amzel L. M. The 2.8-A structure of rat liver Fl-ATPase: configuration of a critical intermediate in ATP synthesis/hydrolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, vol. 95, pp. 11 065−11 070.

45. Braig K., Menz R. I., Montgomery M. G., Leslie A. G., Walker J. E. Structure of bovine mitochondrial F (l)-ATPase inhibited by Mg (2+) ADP and aluminium fluoride. Structure Fold Des., 2000, vol. 8, pp. 567−573.

46. Scarborough G. A. The plasma membrane proton-translocating ATPase. Cell Mol. Life. Sci., 2000, vol. 57, pp. 871−883.

47. Gibbons C., Montgomery M. G., Leslie A. G., Walker J. E. The structure of the central stalk in bovine F (l)-ATPase at 2.4 A resolution. Nat. Struct. Biol., 2000, vol. 7, pp. 1055−1061.

48. Stock D., Gibbons C., Arechaga I., Leslie A. G., Walker I. E. The rotary mechanism of ATP synthase. Curr. Opin. Struct. Biol., 2000 vol. 10, pp. 672−679.

49. Menz R. I., Walker J. E., Leslie A. G. Structure of bovine mitochondrial F (l)-ATPase with nucleotide bound to all three catalytic sites: implications for the mechanism of rotary catalysis. Cell, 2001, vol. 106, pp. 331−341.

50. Futai M., Omote H., Sambongi Y., Wada Y. Synthase (H+ ATPase): coupling between catalisys, mechanical work, and proton translocation. Biochim. Biophys. Acta (Biomembranes), 2000, vol. 1458, pp. 276−288.

51. Huxley H. E. The mechanism of muscular contraction. Science, 1969, vol. 164, pp. 1356−1365.

52. Shimizu H. Dynamic cooperativity of molecular processes in active streaming, muscle contraction, and subcellular dynamics: the molecular mechanism of self-organization at the subcellular level. Adv. Biophys., 1979, vol. 13, pp. 195−278.

53. Maeda Y. The arrangement of myosin heads in relaxed crab muscle. Nature, 1983, vol. 302, pp. 69−72.

54. Phillips G. N. Jr, Fillers J. P., Cohen C. Tropomyosin crystal structure and muscle regulation. J. Mol. Biol., 1986, vol.192, pp. 111−131.

55. Tokunaga M., Sutoh K., Toyoshima C., Wakabayashi T. Location of the ATPase site of myosin determined by three-dimensional electron microscopy. Nature, 1987, vol. 329, pp. 635−638.

56. Schutt CE, Lindberg U. Actin as the generator of tension during muscle contraction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, vol. 89, pp. 319−323.

57. Irving M., Lombardi V., Piazzesi G., Ferenczi M. A. Myosin head movements are synchronous with the elementary force-generating process in muscle. Nature, 1992, vol. 357, pp.156−158.

58. Sugi H. Molecular mechanism of ATP-dependent actin-myosin interaction in muscle contraction. Jpn. J. Physiol., 1993, vol. 43, pp. 435−454.

59. Park S., Ajtai K., Burghardt T. P. Mechanism for coupling free energy in ATPase to the myosin active site. Biochemistry, 1997, vol. 36, pp. 3368−3372.

60. Hudson L., Harford J. J., Denny R. C., Squire J. M. Myosin head configuration in relaxed fish muscle: resting state myosin heads must swing axially by up to 150 A or turn upside down to reach rigor. J. Mol. Biol., 1997, vol. 273, pp. 440−455.

61. Sack S., Kull F. J., Mandelkow E. Motor proteins of the kinesin family. Structures, variations, and nucleotide binding sites. Eur. J. Biochem., 1999, vol. 262, pp. 1−11.

62. Piazzesi G., Reconditi M., Linari M., Lucii L., Sun Y. B., Narayanan T., Boesecke P., Lombardi V., Irving M. Mechanism of force generation by myosin heads in skeletal muscle. Nature, 2002, vol. 415, pp. 659−662.

63. Fisher A. J., Smith C. A., Thoden J. B., Smith R., Sutoh K., Holden H. M., Rayment I. X-ray structures of miosin motor domain of Dictystelium discoideum complexed with MgADPBeFx and MgADPA1FX. Biochemistry, 1995, vol. 34, 89 608 972.

64. Okimoto N., Yamanaka K., Ueno J., Hata M., Hoshino T., Tsuda M. Theoretical studies of the ATP hydrolysis mechanism of myosin. Biophys J., 2001, vol. 81, pp. 2786−2794.

65. Sasaki N., Sutoh K. Structure-mutation analysis of the ATPase site of Dictyosteliumdiscoideum myosin II. Adv. Biophys., 1998, vol. 35, pp. 1−24 .

66. Shih T. Y., Hattori S., Clanton D. J., Ulsh L. S., Chen Z. Q., Lautenberger J. A., Papas T. S. Structure and function of p21 ras proteins. Gene Amplif. Anal., 1986, vol. 4, pp. 53−72.

67. Chen J. M., Lee G., Brandt-Rauf P. W" Murphy R. B., Rackovsky S., Pincus M. R. Comparison of the predicted structure for the activated form of the P21 protein with the X-ray crystal structure. J. Protein Chem., 1990, vol. 9, pp. 543−547.

68. Wittinghofer A, Pai E. F. The structure of Ras protein: a model for a universal molecular switch. Trends Biochem. Sci., 1991, vol. 16, pp. 382−387.

69. Foley C. K., Pedersen L. G., Charifson P. S., Darden T. A., Wittinghofer A., Pai E. F., Anderson M. W. Simulation of the solution structure of the H-ras p21-GTP complex. Biochemistry, 1992, vol. 31, pp. 4951−4959.

70. Wittinghofer Aio, Nassar N. How Ras-related proteins talk to their effectors. Trends Biochem. Sci., 1996, vol. 21, pp. 488−491.

71. Scheffzek K., Lautwein A., Kabsch W., Ahmadian M. R., Wittinghofer A. Crystal structure of the GTPase-activating domain of human pl20GAP and implications for the interaction with Ras. Nature, 1996, vol. 384, pp. 591−596.

72. Schweins T., Scheffzek K., Assheuer R., Wittinghofer A. The role of the metal ion in the p21ras catalysed GTP-hydrolysis: Mn versus Mg. J.Mol. Biol., 1997, vol. 266, pp. 847−856.

73. Scheffzek K., Ahmadian M. R., Kabsch W., Wiesmuller L., Lautwein A., Schmitz F., Wittinghofer A. The Ras-RasGAP complex: structural basis for GTPase activation and its loss in oncogenic Ras mutants. Science, 1997, vol. 277, pp. 333−338.

74. Scheidig A. J., Burmester C., Goody R.S. The pre-hydrolysis state of p21(ras) in complex with GTP: new insights into the role of water molecules in the GTP hydrolysis reaction of ras-like proteins. Structure Fold. Des., 1999, vol. 7, pp. 1311−1324.

75. Scheffzek К., Grunewald P., Wohlgemuth S., Kabsch W., Tu H., Wigler M., Wittinghofer A., Herrmann C. The Ras-Byr2RBD complex: structural basis for Ras effector recognition in yeast. Structure (Camb), 2001, vol. 9, pp. 1043−1050.

76. Downward J., Riehl R., Wu L., Weinberg R. A. Identification of a nucleotide exchange-promoting Activity for p21ras. PNAS, 1990, vol. 87, pp. 5998−6002.

77. Berger L. Crystallization of the sodium salt of adenosine triphosphate. Biochim. et Biophys. Acta, 1956, vol. 20, pp. 23−26.

78. Шварценбах Г., Флашка Г. Комплексонометрическое титрование. Москва, «Химия», 1970.

79. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М., «Мир», 1991.

80. Vanni A., Gastaldi D. The interaction of bivalent metal ions Co2+, Ni2+) with TES. Annali de Chimica (Rome) vol. 76, pp. 375−385.

81. Wong S. С. K., Hall, D. C., Josse J. Constituitive inorganic pyrophosphatase of Escherichia coli. III. Molecular weight and physical properties of the enzymes and its subunits. J. Biol. Chem., 1970, vol. 245, pp. 4335−4345.

82. Baykov A. A., Avaeva S. M. A Simple and sensitive apparatus for continuous monitoring of orthophosphate in the presence of acid-labile compounds. Analytical Biochemistry, 1981, vol. 116, pp.1−4.

83. Smirnova I. S., Baykov A. A., Avaeva S. M. Studies on inorganic pyrophosphatase using imidodiphosphate as a substrate. FEBS, 1986, vol. 206, pp. 121 124.

84. Черняк, В. Я. Физико-химические методы молекулярной биологии. Издательство Московского Университета, М., 1978.

85. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия, тт. 1−3, Москва, «Мир», 1985.

86. Baykov A. A., Bakuleva N. Р and Rea А. P. Steady-state kinetics of substrate hydrolysis by vacuolar H±pyrophosphatase. A simple three-state model. Eur. J. Biochem., 1993, vol. 217, pp. 755−762.

87. Банков А. А. Диссертация на соискание степени доктора химических наук. М., 1991.

88. Smith R. М., Martell А. Е., Motekaitis R. J. NIST Critical Stability Constants of Metal Complexes Database (Version 2.0), National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg, USA, 1995.

89. Лурье Ю. Ю. Справочник по аналитической химии. Москва, «Химия», 1979.

90. Кульвинова JI. А., Блохин В. В., Макашев Ю. А., Миронов В. Е. Термрдинамика процесса образования фторидных комплексов ионов переходных металлов в водно-солевых растворах. Координационная химия, 1981, т. 7, с. 201 205.

91. Baykov A. A., Fabrichniy I. P., Pohjanjoki P., Zyryanov А. В., Lahti R. Fluoride effects along the reaction pathway of pyrophosphatase: evidence for a second enzyme-pyrophosphate intermediate. Biochemistry, 2000, vol. 39, p. 11 939;11947.

92. Курилова. С. А. Особенности функционирования неорганической пирофосфатазы из Е. coli. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук, Москва, 1985.

93. Teplyakov A, Obmolova G, Wilson KS, Ishii К, Kaji H, Samejima T, Kuranova I. Crystal structure of inorganic pyrophosphatase from Thermus thermophilus. Protein Sci., 1994, vol. 3, pp. 1098−1107.

94. Hyytia Т., Halonen P., Salminen A., Goldman A., Lahty R., Cooperman B. S. Ligand binding sites in Escherichia coli inorganic pyrophosphatase: effect of active site mutations. Biochemistry, 2001, vol. 40, 4645−4653.

95. Hohne, W. E. and Heitmann, P. Tripolyphosphate as a substrate of the inorganic pyrophosphatase from baker’s yeastthe role of divalent metal ions. Acta Biol. Med. Germ., 1974, vol. 33, pp. 1−14.

96. Josse, J. Constitutive inorganic pyrophosphatase of Escherichia coli. 1. Purification and catalytic properties. J. Biol. Chem., 1966, vol. 231, pp. 1938;1947.

97. Baykov, A. A. and Avaeva, S. M. Regulation of yeast inorganic-pyrophospphatase activity by divalent cations. Eur. J. Biochem., 1974, vol. 47, pp. 57−66.

98. Мельник M. С., Назарова, Т. И., Аваева, С. М. Особенности гидролиза метилпирофосфата неорганической пирофосфатазой из дрожжей. Биохимия, 1982, т. 47, стр. 323−328.

99. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов. М., «Мир», 1980.

100. Smirnova, I. N., Kasho, V. N., Volk, S. E., Ivanov, A. H., Baykov, A. A. Rates of elementary steps catalyzed by rat liver cytosolic and mitochondrial inorganic pyrophosphatases in both directions. Arch. Biochem. Biophys., 1995, vol. 318, pp. 340 348.

101. Halonen P., Baykov A. A., Goldman A., Lahti R., Cooperman B. S. Single turnover kinetics of Saccharomyces cerevisiae inorganic pyrophosphatase: evidence for intermediates in catalysis. Biochemistry, 2002 (в печати).

102. Baykov A. A., Artjulcov A. A., Avaeva S. M. Fluoride inhibition of inorganic pyrophosphatase. III. Dependence of the nature of substrate and metal ion cofactor. Biochim. Biophys. Acta, 1977, vol. 481, pp. 195−201.

103. Варфоломеев С. Д., Зайцев С. В. Кинетические методы в бихимических исследованиях. М., «Издательство Московского Университета», 1982.

104. Smirnova I. N., Kudryavtseva N. A., Komissarenko S. V., Tarusova N. В., Baykov A. A. Diphosphonates are potent inhibitors of mammalian inorganic pyrophosphatase. Arch. Biochem. Biophys., 1988, vol. 267, pp. 280−284.

105. Курганов Б. И. Аллостерические ферменты. Москва, 1978, издательство «Наука» .

106. Неорганическая биохимия, ред. Эйхорн Г. Москва, «Мир», 1978.

107. Kendrick N. С., Ratzlaff R. W., and Blaustain М. P. Arsenazo III as an indicator for ionized calcium in physiological salt solutions: its use for determination of the CaATP dissociation constant. Anal. Biochem., 1977, vol. 83, pp. 433−450.

108. Rowatt E., Williams R. J. P. The interaction of the cations with the dye arsenazo III. Biochem. J., 1989, vol. 259, pp. 295−298.

109. Басаргин H. H., Иванов В. M., Кузнецов В. В., Михайлова А. В. Арсеназо III 60 лет. Жури, аналит. химии, 2000, т. 55, с. 230−237.

110. Саввин С. Б. Органические реагенты группы Арсеназо III. Москва, Атомиздат, 1971.

111. Savvin S. В. Analytical applications of arsenazo III. Determination of thorium, uranium, protactinium, neptunium, hafnium and scandium. Talanta, 1964, vol. 11, pp. 1−6.

112. Savvin S. В., analytical applications of arsenazo III. The mechanism of complex formation between arsenaso III and certain elements. Talanta, 1964, vol. 11., pp. 7−19.

113. Kendrick N. C. Purification of Arsenazo III, a Casensitive dye. Anal. Biochem., 1976, vol. 76, pp. 487−501.

114. Немодрук А. А. Определение содержания Арсеназо III в его препаратах. Журнал аналитической химии, 1967, т. 22, стр. 629−631.

115. Бек М., Надьпал И. Исследование комплексообразования новейшими методами. 1989, Москва, «Мир», с. 137−142.