Помощь в написании студенческих работ
Антистрессовый сервис

Структурно-функциональное исследование роли домена IV элонгационного фактора G и спирали 34 16S рРНК в процессе транслокации на рибосомах Escherichia coli

Диссертация: Структурно-функциональное исследование роли домена IV элонгационного фактора G и спирали 34 16S рРНК в процессе транслокации на рибосомах Escherichia coli
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Для анализа мутаций 3−4 фаговых бляшки переносили на 3 мл среды 2xYT, добавляли 200 мкл ночной культуры клеток штамма XL1 и растили в течение 6 часов. После этого клетки осаждали центрифугированием в течение 30 мин при 5000 об/мин и 4 °C. К 4-м объемам супернатанта добавляли 1 объем 5х раствора PEG/NaCI и инкубировали во льду 1 час. Фаги осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 5000… Читать ещё >

Структурно-функциональное исследование роли домена IV элонгационного фактора G и спирали 34 16S рРНК в процессе транслокации на рибосомах Escherichia coli (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Содержание

  • Список сокращений
  • I. Обзор литературы
  • I. A. в-белки и ГТФ-азы трансляции
  • 1. А.1. Общие свойства в-белков
  • 1. А.1.1. Структура вТР связывающего центра (в домена)
  • 1. А.1.2. Механизм активации гидролиза вТР
  • 1. А.1.3. Цикл работы ГТФ-азы
  • 1. А.2. Факторы трансляции
  • 1. А.2.1. ЕР-Ти
  • 1. А.2.2. ЕР-в
  • 1. А.2.3.1Р
  • 1. А.2.4. РРЗ
  • 1. А.2.5. Роль гидролиза вТР и освобождения Р (в функционировании факторов трансляции
  • 1. А.2.6. Активация ГТФ-азы факторов трансляции при взаимодействии с рибосомой

ив. Мутации в спирали 34 16S рРНК IIB.1. Выбор мест введения мутаций в 16S рРНК IIB.2.

Введение

мутаций в 16S рРНК (мутагенез) ИВ.З. А7 штамм для экспрессии мутантных рРНК (МС250) IIB.4. Измерение времени удвоения клеток IIB.5. Выделение рибосом и проблема диссоциации рибосом IIB.6. RT-анализ наличия мутаций в рРНК и определение чистоты популяции рибосом IIB.7. Зависимость степени диссоциации рибосом от концентрации Мд* IIB.8.1. Инициация при 7 мМ Мд* IIB.8.2. Зависимость выхода образования инициаторного комплекса от концентрации Мд* 55 55 57 58 59 60 61 62 64 65 IIB.8. Инициация и зависимость эффективности инициации от концентрации Мд*. 64 IIB.9. Эффективность связывания аа-тРНК с, А участком рибосомы и образования претранслокационного комплекса 66 IIB.10. Связывание с, А участком рибосомы аа-тРНК, с частично некомплементарным кодону мРНК антикодоном 67 IIB.11. Влияние мутаций на весь процесс функционирования EF-G в процессе транслокации (стационарная кинетика) 70 IIB.12. Метод престационарнои кинетики (остановленного потока) и оборудование для него 75 IIB.12.1. Устройство установки для проведения кинетических экспериментов методом остановленного потока IIB.12.2. Профлавин флуоресцентная метка втРИК" * IIB.13. Престационарная кинетика связывания аа-тРНК с, А участком рибосомы IIB.14. Престационарная кинетика элементарного акта транслокации IIB.15 Определение точности трансляции in vivo IIB.16. Пробинг 16S рРНК IIB.16.1. Химический пробинг всей последовательности 16S рРНК IIB.16.2. Пробинг 16S рРНК в инициаторном комплексе II В. 17 Заключение ПС. Протонированные основания в рРНК IIC.1. Роль протонированных нуклеотидов 23S рРНК в пептидилтрансферазной реакции и катализе гидролиза GTP на EF-G IIC.2. Боргидридный метод определения заряженных оснований в РНК ИС.З. Пара CH*2575-U2511 IIC.4. НуклеотидА1528 11С.4.

Заключение

75 76 77 80 84 89 90 92 97 99 99 100 101 103 104 II. Материалы и методы IIIA. Сайт-специфическое сшивание EF-G с рибосомой illA.1. Создание конструкции для экспресии гена EF-G 106 106 106 IIIA.2. Выделение и очистка EF-G IIIA.3. Модификация EF-G фотоаффинным реагентом IIIA.4. Формирование комплекса EF-G с рибосомой IIIA.4.1. Посттранслокационный комплекс с тиострептоном IIIA.4.2. Фосфорилирование EF-G в рибосомном комплексе IIIA.5.

IV. Выводы.

1. С помощью нового варианта метода фотоаффинного химического сшивания компонентов аппарата трансляции, разработанного в данной работе, прямо показано, что домен IV EF-G расположен рядом с 30S субчастицей в функционирующей рибосоме;

2. Мутации A1191G и C1109A/U961A замедляют рост клеток и приводят к нарушению ассоциации рибосомных субчастиц;

3. Мутации двух взаимодействующих нуклеотидов 16S рРНК A1201U и U961A нарушают ассоциацию субчастиц, а двойная компенсаторная мутация A1201U/U961A восстанавливает ее до уровня ассоциации рибосомных субчастиц дикого типа;

4. Мутации C1109G, А1191С, A1191U, A1201U, U961A и A1201U/U961A 16S рРНК приводят к повышенной частоте прочтения рибосомой стоп-кодонов и +1 сдвига рамки считывания, мутации C1109A/U961A и A1191G — к возрастанию частоты -1 сдвига рамки считывания;

5. Мутация A1191G приводит к изменению структуры спирали 27 16S рРНК, одного из районов контакта 30S и 50S субчастиц;

6. С помощью разработанного в данной работе метода идентификации протонированных оснований РНК в 23S рРНК 50S субчастицы E. coli, вблизи ее пептидилтрансферазного центра, обнаружена заряженная пара CH+2575-U2511.

НС.4.

Заключение

.

Показано, что в важных функциональных участках 50S субчастицы нет протонированных оснований В частности, не обнаружено протонированное основание, которое могло бы участвовать в катализе гидролиза GTP на элонгационных факторах по механизму аргининового пальца Это говорит о том, что как и для некоторых других.

ГТФ-аз, белок-активатор которых не содержит аргининового пальца, взаимодействие с рибосомой важно для изменения и стабилизации той конформации элонгационных факторов, в которой становится возможным гидролиз йТР. Также не найдено протонированное основание в пептидилтрансферазном центре, участвующие в катализе образования пептидной связи. Показано присутствие в рибосоме вблизи пептидилтрансферазного центра необычной заряженной пары СН+2575-и2511. Разработанный боргидридный метод позволяет с высокой чувствительностью детектировать протонированные основания в РНК.

III. Материалы и методы.

INA. Сайт-специфическое сшивание EF-G с рибосомой IIIA.1. Создание конструкции для экспресии гена EF-G.

5 мл среды LB (1% бакто триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 1% NaCI) с антибиотиком канамицином (30 мкг/мл) засеивали одиночной колонией клеток штамма BL21(DE3), содержащих плазмиду рЕТ26Ь (+) с геном соответствующего мутантного элонгационного фактора G, и растили при 37 °C 12 часов (ночь) при интенсивном перемешивании. Плазмиду выделяли после щелочного лизиса клеток на колонках QIAGEN. Элюцию ДНК с колонки осуществляли 50 мкл буфера (ЮмМ TrisHCI pH 8.5). Чистоту полученной ДНК проверяли электрофорезом в 0.8% агарозном геле. После выделения плазмиду обрабатывали эндонуклеазами рестрикции NdeJ и Xhol, продукты реакции рестрикции разделяли в геле из легкоплавкой агарозы, и ген EF-G выделяли из агарозы в чистом виде. Аналогично обработке эндонуклеазами рестрикции Ndel и Xhol подвергали плазмиду рЕТЗЗЬ (+) и выделяли больший фрагмент ДНК.

Больший фрагмент ДНК плазмиды рЕТЗЗЬ (+) и ген EF-G лигировали с помощью Т4 ДНК-лигазы. Реакцию проводили в течение 12 часов (ночь) при 16−18°С. Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки штамма BL21(DE3), селективный отбор которых проводили на среде LB с канамицином. Единичную колонию клеток пересеивали в 5 мл среды LB с канамицином и выделяли плазмиду рЕТЗЗЬХХХ — pET33bCysless, рЕТЗЗЬ506, рЕТЗЗЬ541, рЕТЗЗЬ585 и рЕТЗЗЬ591. Наличие правильной вставки гена EF-G и нахождение гена EF-G в корректной рамке считывания подтверждали с помощью секвенирования по Сенгеру.

IIIA.2. Выделение и очистка EF-G.

По 5 мл ночных культур штамма BL21(DE3), содержащего плазмиды серии рЕТЗЗЬХХХ, засеивали в 1 л среды LB и растили до Аеоо 0.4, производили индукцию IPTG до конечной концентрации 1 мМ и растили в течение 3 часов при 37 °C. Клетки осаждали центрифугированием. Собранные клетки промывали лизис-буфером (50 мМ Tris-HCI pH 8.0, 10 мМ MgCI2, 0.5 мМ DTT, 0.01 мМ PMSF). Клетки ресуспендировали в лизис-буфере, лизировали с помощью ультразвука и центрифугировали последовательно 1 час при 18 000 об/мин и 4 часа при 30 000 об/мин. Из полученного супернатанта выделяли мутантный элонгационный фактор.

Выделение и очистку элонгационного фактора проводили с помощью аффинной хроматографии на никель-нитрилоуксусной кислоте (Ni-NTA), имобилизированной на агарозе, за последовательность из шести гистидинов (6xHis-Tag), находящуюся как на N-, так и на С-конце белка.

К 500 мкл 50% суспензии Ni-NTA добавляли 3 мл супернатанта и имидазол до конечной концентрации 5 мМ. Перемешивали 1 час при 200 об/мин и температуре 4 °C, промывали 5 раз 500 мкл буфера (20 мМ TrisHCI рН 8.0, 500 мМ NaCI, 50 мМ имидазол) и элюировали 3 раза 500 мкл буфера (20 мМ TrisHCI рН 8.0, 500 мМ NaCI, 200 мМ имидазол). Анализ фракций проводили с помощью 10% SDS-полиакриламидного геля [210]. Перевод EF-G в буфер С (50 мМ Tris-HCI, рН 7.5, 70 мМ NH4CI, 30 мМ KCI, 7 мМ MgCI2) осуществляли с помощью гель-фильтрации на Sephadex G50 Fine.

IIIA.3. Модификация EF-G фотоаффинным реагентом.

Первым этапом реакции модификации являлась обработка белка DTT для восстановления SH-групп остатков цистеина. Для этого к 100 мкл раствора белка (40 мкМ) в буфере С добавляли 1 мкл 0.1 М DTT, и реакцию восстановления проводили в течение 12 часов (ночь) при 4 °C. После реакции восстановления EF-G очищали от DTT на колонке со смолой Sephadex G50 Fine, на 100 мкл образца брали 1 мл суспензии смолы. После элюции с колонки объем образца доводили до 100 мкл буфером С, 10 мкл отбирали для контроля (образец 1).

Все остальные операции проводили в темной комнате при освещении красной лампой. К оставшимся 90 мкл образца добавляли 10 мкл раствора фотоаффиного реагента (п-азидофенацилбромида или 3-(3-(йодоацетиламино)фенил)-3-(трифторметил) диазирина) в 100% метаноле с концентрацией 8 мМ (15−20-ти кратный избыток) и инкубировали в течение 0.5−1.0 часа при 4 °C. Очистку от избытка непрореагировавшего реагента проводили на колонках Sephadex G50 Fine, как описано выше. Объем пробы после колонки доводили до 100 мкл буфером С, 10 мкл отбирали для анализа (образец 2). К оставшимся 90 мкл добавляли 10 мкл 87% глицерина.

Выход модификации определяли с помощью 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойдной кислоты). Для этого снимали спектры поглощения образцов 1 и 2 (200−500 нм). Добавляли 5 мкл 1 мМ водного раствора 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойдной кислоты) и инкубировали в течение 2 часов при 4 °C. После этого опять снимали спектры (200−500) нм. По разности значения оптической плотности при 412 нм (анион 5-тио-2-нитробензойдной кислоты имеет коэффициент молярной экстинкции ем 13 600) рассчитывали концентрацию свободных SH-групп остатков цистеина.

1ИА.4. Формирование комплекса ЕР-О с рибосомой.

ША.4.1. Посттранслокационный комплекс с тиострептоном.

Претранслокационный комплекс 70Б рибосом (0.5 мкМ) с ^Н^МеН^СрЬе-тРНК™6' в Р участке и тРНК&trade-®в, А участке формировали согласно опубликованной методике [211]. К 150 мкл 0.5 мкМ претранслокационного комплекса добавляли 50 мкл буфера ТАКМ7 (50 мМ Тле-НС!, рН 7.5, 70 мМ МН4С1, 30 мМ КС1, 7 мМ МдС12), содержащего 10-ти кратный избыток модифицированного фотоаффинным реагентом ЕР-в, активированного инкубацией с СТР в течение 10 мин при 37 °C [211]. В качестве контроля использовали претранслокационный комплекс без добавления ЕР-в и с добавлением ЕР-в СуэЧезэ, обработанного фотоаффинным реагентом. Смесь инкубировали в течение 1 часа при 37 °C. Полноту протекания реакции транслокации проверяли с помощью пуромициновой реакции, отбирая 10 мкл посттранслокационного комплекса [52]. 90 мкл посттранслокационного комплекса облучали ультрафиолетовым светом с длиной волны больше 320 нм в течение 10 мин. 90 мкл комплекса использовали в качестве необлученного контроля. ША.4.2. Фосфорилирование ЕР-С в рибосомном комплексе.

К 90 мкл комплекса добавляли 21 мкл Н20, 30 мкл 5х рабочего буфера (100 мМ Тпэ-НС! рН 7.8, 750 мМ №С1, 100 мМ МдС12), 1.5 мкл у-[32Р]АТР (2 пмоль/мкл) и 7.5 мкл каталитической субъединицы протеин киназы, А (1 ед/мкл в буфере 0.35 мМ ЭДТА, 0.96 мМ фосфат калия рН 7.0) и инкубировали в течение 1.5 часа при 30 °C.

ША.5. Разделение модифицированных компонентов рибосомы.

Разделение модифицированных компонентов рибосомы проводили с помощью системы трех последовательных ультрацентрифугирований в градиенте концентрации сахарозы. Первое центрифугирование в градиенте концентрации сахарозы 10−30% в буфере 10 мМ Тпэ-НС! рН 7.5, 100 мМ 1МН4С1, 10 мМ МдС12, 1 мМ ОТТ в течение 18 часов при 22 000 об/мин и 4 °C необходимо для очистки от избытка фактора в, второе -10−30% в буфере 10 мМ Тпэ-НС! рН 7.5, 100 мМ МН4С1, 0.5 мМ МдС12, 1 мМ ОТТ в течение 18 часов при 22 000 об/мин и 4 °C для разделения рибосомных субчастиц и третье — 10−30% в буфере 10 мМ Тиэ-НС! рН 7.5, 0.2 мМ ЕРТА, 0.1% вОБ, 10 мМ р-мкркаптоэтанол в течение 18 часов при 33 000 об/мин и 4 °C для разделения рибосомной РНК и белков.

В случае фосфорилирования ЕР-в разделение рибосомной РНК и белков проводили также с помощью ультрацентрифугирования в градиенте концентрации сахарозы 10−30% в денатурирующих условиях (буфер 20 мМ Тиэ-НС!, рН 8.0, 0.1 мМ.

EDTA, 100 мМ LiCI, 0.1% SDS). При этом, к 150 мкл комплекса после фосфорилирования добавляли 150 мкл буфера для нанесения образца (20 мМ Tris-HCI, рН 8.0, 2 мМ EDTA, 10 мМ DTT, 2% SDS), наслаивали на 11 мл градиента концентрации сахарозы и центрифугировали в течение 16 часов при при 22 000 об/мин и 4 °C (ротор SW41Ti). Фракции, соответствующих рибосомным белкам, анализировали с помощью SDS-ПААГ.

IIIA.6. Анализ продуктов фотохимической модификации с помощью антител.

В данных экспериментах также использовали четыре мутанта EF-G (506, 542, 585, 591), модифицированные 3-(3-(йодоацетиламино)фенил)-3-(трифторметил) диазирином. Комплексы EF-G (506, 542, 585, 591) с рибосомой в присутствии антибиотика тиострептона и контрольные комплексы формировали, как описано выше. После облучения разделение рибосомных комплексов на субчастицы проводили центрифугированием в градиенте концентрации сахарозы. При анализе сахарозных градиентов аликвоту, равную 10 мкл (1/60 от общего объема фракции), наносили на нитроцеллюлозную мембрану. Для анализа применяли поликлональные антитела против фактора элонгации. Для окрашивания нитроцеллюлозной мембраны применяли разведение 1:1000, разведение вторичных антител 1:50 000, для проявления использовали хемилюминисцентный метод и набор препаратов от фирмы Перкин Элмер. Для анализа модификаций рибосомных белков использовали 6% SDS-ПААГ.

1MB. Мутации в спирали 34 16S рРНК.

IIIB.1. Трансформация клеток Escherichia со// ШВ.1.1. Получение компетентных клеток.

Компетентные клетки получали по протоколу, описанному на http://molbiol.ru/protocol/03 04.html. Для этого 50 мл SOB (2% Bacto-пептон, 0.55% Bacto дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCI, 10 мМ KCI, 10 мМ MgCI2, 10 мМ MgS04, стерилизация фильтрованием через 0.22 мкм фильтр), содержащей необходимый для селекции антибиотик, засеивали 2−3 колониями клеток одного из используемых в работе штаммов Escherichia coii. Клетки растили до оптической плотности при 600 нм, равной 0.5−0.6 при 18 °C (несколько суток) или при 37 °C (5−6 часов, но компетентность полученных таким образом клеток получается на 2−3 порядка ниже). По достижении заданной оптической плотности 40 мл клеток помещали в центрифужные пробирки и выдерживали во льду 30 минут. Клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 3000 об/мин. Супернатант декантировали, клетки центрифугировали еще раз в течение 20 с при 3000 об/мин и как можно полнее удаляли остатки среды. Осадок клеток ресуспендировали в 10 мл холодного буфера ТВ (10 мМ PIPES или HEPES, 55 мМ МпС12, 15 мМ CaCI2, 10 мМ KCI, 250, рН 6.7) и выдерживали во льду 15 минут. Клетки осаждали центрифугированием 3000 об/мин 10 минут. Супернатант I декантировали, клетки центрифугировали еще раз 3000 об/мин 20 с и как можно полнее удаляли остатки буфера ТВ. Осадок клеток ресуспендировали в 10 мл холодного буфера ТВ и выдерживали во льду 15 минут. Клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 3000 об/мин. Супернатант декантировали, клетки центрифугировали еще раз в течение 20 с при 3000 об/мин и как можно полнее удаляли остатки буфера ТВ. Осадок клеток ресуспендировали в 2 мл холодного буфера ТВ. По каплям при перемешивании добавляли 70 мкл DMSO (DMSO во льду замерзает!) и выдерживали во льду 10 минут. Затем добавляли еще 70 мкл DMSO и выдерживали во льду еще 10 минут. Полученную суспензию клеток аликвотили по 50 200 мкл в стерильные пластиковые пробирки на 1.5 мл, которые предварительно охлаждали во льду, и замораживали в жидком азоте. Компетентные клетки хранили при-80°С.

Ill В.1.2. Трансформация.

Для трансформации брали 40−50 мкл компетентных клеток. В случае трансформации плазмидной ДНК брали водный раствор с концентрацией 5−10 нг/мл. Для этого разводили в 100−200 раз раствор пДНК, полученный после выделения ^ плазмиды (смотри раздел IIIA.1). 1−2 мкл раствора плазмидной ДНК добавляли к компетентным клеткам и выдерживали во льду 30 минут. Затем проводили тепловой шок в течение 45 с при 42 °C и пробирки, не перемешивая клетки, помещали на 2 мин в лед. После этого добавляли 200 мкл среды SOC (2% Bacto-пептон, 0.55% Bacto дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCI, 10 мМ KCI, 10 мМ MgCI2, 10 мМ MgS04, 20 мМ глюкоза, стерилизация фильтрованием через 0.22 мкм фильтр) и растили при перемешивании в течение 1 часа при 37 °C. 75−100 мкл клеток рассеивали на чашки со средой LB, содержащей необходимые антибиотики.

IIIB.2.

Введение

мутации в рРНК (мутагенез по методу Кункеля).

Для введения мутаций в рРНК участок рибосомного оперона, содержащего З'-концевую область гена 16S рРНК, перенесли в ДНК фага М13тр18 по сайтам рестрикции Hindlll и Shpl. Одноцепочечную урацилсодержащую ДНК для проведения мутагенеза получали с использованием штамма CJ236 (dut1, ungi, th?1, relA1/pCJ105 СCm'')). Для этого 3 мл среды 2xYT (1.6% Bacto-пептон, 1% Bacto дрожжевой экстракт, 0.5% NaCI), содержащей хлорамфеникол, засеивали 200 мкл ночной культуры клеток CJ236, добавляли 5−10 мкл супернатанта, содержащего фаги, и растили в течение 6 часов при 37 °C. После этого клетки осаждали центрифугированием в течение 30 мин при 5000 об/мин и 4 °C. К 4-м объемам супернатанта добавляли 1 объем 5х раствора PEG/NaCI (0.15 г/мл полиэтиленгликоль 8000, 0.146 г/мл NaCI) и инкубировали во льду в течение 1 часа. Фаги осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 5000 об/мин и 4 °C, осадок фагов растворяли в 100 мкл высокосолевого буфера (100 мМ TrisHCI рН 8.0, 300 мМ NaCI, 1 мМ EDTA), осторожно перемещивали на вортексе, инкубировали во льду в течение 1 часа и центрифугировали как описано выше. Супернатант по прежнему содержал фаги. Экстракцию одноцепоцечной ДНК проводили путем последовательной обработки супернатанта два раза фенолом и один раз смесью хлороформ/изоамиловый спирт (24:1). ДНК осаждали добавлением 0.1 объема 3 M NaOAc рН 5 и 3 объемов этилового спирта. Пробы выдерживали в течение 1.5 часов при -20°С или в течение 10 минут в жидком азоте, и ДНК осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 14 000 об/мин. Осадок ДНК растворяли в 20 мкл буфера ТЕ (10 мМ TrisHCI рН 8.0, 0.1 мМ EDTA) и концентрацию определяли спектрофотометрически (1 А2ео составляет примерно 36 мкг одноцепочечной ДНК). Чистоту полученной ДНК проверяли с помощью 0.8% агарозного геля.

Фосфорилирование праймера проводили в 20 мкл реакционной смеси (50 мМ TrisHCI рН 7.5, 10 мМ MgCI2, 5 мМ DTT, 0.4 мМ АТР), содержащей 2−5 ед Т4 полинуклеотид киназы и 200−250 нг олигонуклеотида, в течение 2 часов при 37 °C. Киназу дезактивировали нагреванием в течение 15 мин при 75 °C. 4.

Гибридизацию олигонуклеотида проводили в 10 мкл реакционной смеси. Для этого к 7−8 мкл фосфорилированного праймера добавляли 1 мкл 10х буфера для отжига (200 мМ TrisHCI рН 7.5, 20 мМ MgCI2, 500 мМ NaCI) и 1−2 мкл (0.5−1 мкг) урацилсодержащей одноцепочечной ДНК. Гибридизацию проводили при охлаждении термостата с 80 °C до 37 °C со скростью 1 °/мин.

Для синтеза комплиментарной цепи к 10 мкл смеси с предыдущего шага добавляли 1.3 мкл смеси для удлинения праймера (200 мМ TrisHCI рН 7.5, 100 мМ MgCI2, 20 мМ DTT, 5 мМ dATP, 5 мМ dCTP, 5 мМ dGTP, 5 мМ dTTP, 4 мМ АТР), 1 мкл Т4 ДНК полимеразы (10 ед) и 1 мкл Т4 ДНК лигазы (10 ед). Смесь инкубировали в течение 1 часа при 37 °C и замораживали.

Полученную смесь разбавляли в 10−25 раз и 1−2 мкл использовали для трансформации 50 мкл компетентных клеток штамма XL1. После трансформации клетки добавляли к 10 мл Soft агара (1% Bacto-пептон, 0.5% Bacto дрожжевой экстракт, 1% NaCI, 0.8% Bacto агар), находящимся в водяной бане при 42 °C и заливали в чашку Петри. Чашку инкубировали в течение 12−15 часов (ночь) при 37 °C.

Для анализа мутаций 3−4 фаговых бляшки переносили на 3 мл среды 2xYT, добавляли 200 мкл ночной культуры клеток штамма XL1 и растили в течение 6 часов. После этого клетки осаждали центрифугированием в течение 30 мин при 5000 об/мин и 4 °C. К 4-м объемам супернатанта добавляли 1 объем 5х раствора PEG/NaCI и инкубировали во льду 1 час. Фаги осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 5000 об/мин и 4 °C, осадок фагов растворяли в 100 мкл буфера ТЕ. Экстракцию одноцепоцечной ДНК проводили путем последовательной обработки супернатанта два раза фенолом и один раз смесью хлороформ/изоамиловый спирт (24:1). Для осаждения ДНК добавляли 0.1 объема 3 М NaOAc рН 5 и 3 объемов этилового спирта, пробы выдерживали в течение 1.5 часа на -20°С или в течение 10 минут в жидком азоте и центрифугировали в течение 10 минут при 14 000 об/мин. Осадок ДНК растворяли в 20 мкл буфера ТЕ и концентрацию определяли спекгрофотометрически (1 А2бо составляет примерно 36 мкг одноцепочечной ДНК). Чистоту полученной ДНК проверяли с помощью 0.8% агарозного геля. Нуклеотидную последовательность полученной ДНК определяли по методу Сенгера.

IIIB.3. Создание А7 штаммов МС250 и AVS69009, несущих мутированный рибосомный оперон на плазмиде pSTLxxxx.

Для создания А7 штаммов, несущих рибосомный оперон, содержащий введенную нами мутацию, использовали штаммы AVS69009 и МС250 и плазмиду pSTL102, несущую ген устойчивости к ампицилину.

Часть рибосомного оперона, содержащего З'-концевую область гена 16Э рРНК в ДНК фага М13тр18Н8, переносили из репликативной формы ДНК фага по сайтам эндонуклеаз рестрикции Ара1 и ХЬа1 в плазмиду рЗТ1.102. Полученной плазмидой рЭЛ-хххх, где хххх обозначение мутанта, трансформировали компетентные клетки штамма А/869 009 или МС250. После трансформации клетки высеивали на среду 1. В-агар (1% ВасЬ-пептон, 0.5% Вас1о дрожжевой экстракт, 1% МаС1, 1.5% Вайо-агар), содержащую ампицилин (50 мкг/мл), и инкубировали в течение 12−15 часов при 37 °C.

Для замещения исходной плазмиды, несущей немутированный рибосомный оперон и ген устойчивости к канамицину, плазмидой рЭЛхххх несколько колоний после трансформации пересеивали на среду ЬВ-агар со вторым антибиотикомэритромицином (100 мкг/мл) в случае штамма АХ/БбЭООЭ и стрептомицином (20 мкг/мл) в случае штамма МС250 — и инкубировали в течение 12−15 часов при 37 °C. Для проверки полноты замещения исходной плазмиды одну и ту же колонию рассевали параллельно на среды ЬВ-агар, содержищие канамицин (50 мкг/мл) и ампицилин (50 мкг/мл). Для дальнейшей работы отбирали только те колонии, которые росли на среде с ампицилином, но не росли на среде с канамицином.

ШВА Измерение времени удвоения клеток.

Получение кривых роста клеток проводили в трех независимых экспериментах. Для этого в каждом эксперименте колонию клеток штамма МС250-рЗТ1.хххх высевали на жидкую среду 1. В (1% Вайо-пептон, 0.5% Вайо дрожжевой экстракт, 1% МаС1) с ампицилином (50 мкг/мл) и растили в течение 12−15 часов при 37 °C. Далее 200−400 мкл ночной культуры засеивали 50 мл среды 1. В с ампицилином (50 мкг/мл) и растили в орбитальном термостатируемом шейкере при 200 об/мин. Измерение оптической плотности при длине волны 600 нм производили на начальной стадии кривой роста с интеревалом 1 час, в средней части кривой роста с интервалом 15−20 минут.

ШВ.5. Стандартная методика выделения рибосом.

Для выделения рибосом и рибосомных субчастиц на первом этапе нарабатывали необходимую клеточную массу, 40−50 грамм клеток. Для этого использовали ферментеры емкостью 2 литра. 200 мл ночной культуры соответствующего штамма МС250, содержащего плазмиду рЭЛХХХ, засеивали 2 литра среды 2×1.В (2% Вайо-пептон, 1% Вас1о дрожжевой экстракт, 1% №С1, рН 7.1) и ферментацию проводили, при поддерживании рН 7.1, аэрации и активном перемешивании культуры клеток, до оптической плотности Абоо равной 4−5 ед. Одна ферментация позволяла получить с 2 литров культуры 10−12 г клеток. Клетки осаждали центрифугированием в течение 20 мин при 6000 об/мин (ротор МЮ), замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С.

50 г замороженных клеток разбивали пестиком в холодной ступке диаметром 20 см, добавляли 100−125 г охлажденного оксида алюминия (А1203) и перетирали в холодной комнате в течение 30 минут. После этого добавляли несколько кристаллов ДНКазы I и продолжали перетирание в течение еще 10 минут. Полученную клеточную массу ресуспендировали в буфереЬо1 (20 мМ ТпэНС! рН 7.6, 100 мМ МН4С1, 10.5 мМ Мд (ОАс)2, 0.5 мМ ЕОТА, 3 мМ р-меркаптоэтанол) и центрифугировали последовательно в течение 10 мин при 1500 див течение 30 мин при 12 500 д и 4 °C (ротор иА14). Полученный супернатант фильтровали через бумажный фильтр и центифугировали в течение 30 мин при 16 000 об/мин и 4 °C (ротор «П 50.2) для получения БЗО экстракта. Первичную очистку рибосом проводили с помощью центрифугирования через сахарозную подушку (20 мМ ТпэНС! рН 7.6, 100 мМ 1ЧН4С1, 10.5 мМ Мд (ОАс)2, 0.5 мМ ЕРТА, 1.1 М сахароза, 3 мМ р-меркаптоэтанол). 14 мл БЗО экстракта наслаивали на 9 мл сахарозной подушки и центрифугировали в течение 16 часов при 33 000 об/мин и 4 °C (ротор «П 50.2). После центрифугирования полученный осадок рибосом промывали буфером ШЬо2 (20 мМ ТпэНС! рН 7.6, 500 мМ 1ЧН4С1, 10.5 мМ Мд (ОАс)2, 0.5 мМ ЕРТА, 3 мМ р-меркаптоэтанол), растворяли в буфере Я1Ьо2 и конечный объем доводили до 92 мл. 23 мл раствора рибосом наслаивали на 1 мл сахарозной подушки и центрифугировали в течение 6 часов при 50 000 об/мин и 4 °C (ротор «Л 50.2). Осадок рибосом промывали буфером Я'|Ьо2, растворяли в буфере Я1Ьо2 и конечный объем доводили до 90 мл. 30 мл раствора рибосом наслаивали на 1.5 мл сахарозной подушки и центрифугировали в течение 13 часов при 28 000 об/мин и 4 °C (ротор 5Л/28). Полученный осадок рибосом растворяли в 15−20 мл буфера для нанесения на градиент концентрации сахарозы Я1ЬоЗ (20 мМ ТпэНС! рН 7.6, 60 мМ 1ЧН4С1, 5.25 мМ Мд (ОАс)2, 0.25 мМ ЕРТА, 3 мМ р-меркаптоэтанол), измеряли концентрацию рибосом, добавляли сахарозу до концентрации 5%, и либо сразу использовали на следующем шаге выделения (зональное центрифугирование), либо замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С.

На одно зональное центрифугирование брали не более 10 000 ед А600 рибосом. В зональный ротор с помощью перестатического наноса последовательно добавляли 400 мл буфера Р^ЬоЗ, рибосомы в буфере для нанесения на градиент концентрации сахарозы с 5% сахарозой, 1400 мл градиента концентрации сахарозы 10−40% в буфереЬоЗ и еще 150 мл буфера Я1ЬоЗ, содержащего 50% сахарозу. Центрифугирование проводили в течение 19 часов при 28 000 об/мин и 4 °C. Собирали фракции градиента по 50 мл (32 фракции), измеряли оптическую плотность каждой фракции при 260 нм и отбирали 6 фракций, соответствующих пику 70S рибосом. Рибосомы осаждали центрифугированием в течение 24 часов при 50 000 об/мин и 4 °C (ротор Ti 50.2). Осадок рибосом растворяли в рабочем буфере ТАКМ7 (50 мМ TrisHCI pH 7.6, 70 мМ NH4CI, 30 мМ KCl, 7 мМ MgCI2), аликвотили по 50−100 мкл, замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С.

ШВ.6. Выделение рибосом при повышенной концентрации Мд2+.

В тех случаях, когда выделение рибосом в стандартных условиях (смотри раздел ШВ.5) было невозможно из-за диссоциации на субчастицы, рибосомы выделяли в условиях повышенной концентрации магния. Выделение проводили согласно описанной выше методике, заменяя соответствующие буферы на буферы с повышенной концентрацией магния: РИЬо1−21 (20 мМ ТпэНС! рН 7.6, 100 мМ МН4С1, 21 мМ Мд (ОАс)2, 0.5 мМ ЕйТА, 3 мМ р-меркаптоэтанол), сахарозная подушка (20 мМ ТпвНС! рН 7.6, 100 мМ МН4С1, 21 мМ Мд (ОАс)2, 0.5 мМ ЕОТА, 1.1 М сахароза, 3 мМ Р-меркаптоэтанол),Ьо2 (20 мМ ТпзНС! рН 7.6, 500 мМ МН4С1, 10.5 мМ Мд (ОАс)2, 0.5 мМ ЕОТА, 3 мМ р-меркаптоэтанол),ЬоЗ-21 (20 мМ ТпзНС1 рН 7.6, 60 мМ МН4С), 21 мМ Мд (ОАс)2, 0.25 мМ ЕОТА, 3 мМ р-меркаптоэтанол).

IIIB.7. Проверка наличия мутации в рибосомной РНК (RT анализ).

Проверку наличия мутации в рибосомной РНК проводили с помощью реакции обратной транскрипции с праймера, синтезированного таким образом, чтобы при гибридизации его З'-конец был комплементарен последовательности 16S рРНК, непосредственно предшествующей месту мутации (см. таблицу IIIB.1). Таблица IIIB.1. Праймеры к 16S рРНК, использованные для анализа наличия мутации в рРНК. ml .

•.-.-.~|ШГЭ2У>

Seq1 A1191(C, G, U) 1192−1203 5' -GATGACTTGACG-3'.

Seq2 A1067(C, G, U) 1068−1179 5' -CACAACACGAGC-3'.

Seq3 C1109(A, G, U) 1110−1121 5' -AGGATAAGGGTT-3'.

Seq4 A1201U 1202−1213 5' -TAAGGGCCATGA-3'.

Seq5 U961A 962−973 5' -CGCGTTGCATCG-3'.

ШВ.7.1. Выделение рибосомной РНК.

Выделение рибосомной РНК проводили из 100 пмол рибосом с помощью фенольной депротеинизации. 100 пмол рибосом разводили в 200 мкл ТЕ буфера (ЮмМ Тиэ-НС! рН 8.0, 0.1 мМ ЭДТА), проводили последовательно два раза фенольную депротеинизацию равным объемом насыщенного водой фенола (200 мкл) и один раз экстракцию смесью хлороформ: изоамиловый спирт (24:1). Затем рибосомную РНК высаживали добавлением 3-х объемов (600 мкл) 99.9% этилового стирта (ЕЮН) и 0.1 объема (20 мкл) 3 М №Ас рН 5.5. Осадок рРНК растворяли в 20−30 мкл буфера ТЕ и концентрацию определяли спекгрофотометрически по абсорбции РНК при 260 нм. ШВ.7.2. Реакция обратной транскрипции.

Радиоактивную метку вводили на 5'-конец олигонуклеотида с помощью полинуклеотид киназы и у-[32Р]АТР. В реакцию фосфорилирования праймера на 20 мкл реакционной смеси брали 20 пмоль праймера, 2 мкл 10-ти кратного киназного буфера (500мМ ТпэНС! рН 7.6, ЮОмМ МдС12, 50 мМ ОТТ, 1 мМ спермидин, 1 мМ ЭДТА), 1.0−2.0 мкл у-[32Р]АТР (10 мкКю/мкл) и 1.0 мкл Т4 полинуклеотид киназы (10 ед/мкл). Инкубировали в течение 2.5 часа при 37 °C. После инкубации прогревали в течение 15 мин при 75 °C для дезактивации полинуклеотид киназы. Конечная концентрация праймера составляла 1 пмол/мкл.

На одну реакцию удлинения праймера брали 0.5 пмол рРНК. Отжиг праймера проводили в объеме 5 мкл — 0.5 пмол рРНК, 0.5 пмол фосфорилированного праймера, 0.5 мкл 10-ти кратного буфера ЮхРТ (500мМ ТпэНС! рН 8.3, 600 мМ №С1, ЮОмМ РТТ, бОмМ МдС12), стерильная Н20 до 5 мкл. Отжиг проводили при охлаждении термостата с 80 °C до 37 °C со скоростью 1°/мин. Затем к реакционной смеси добавляли 5 мкл соответствующей смеси сЮМТР (таблица ШВ.2), содержащей один из нуклеотидов в дидезокси форме, и 0.1 мкл обратной трансктиптазы (20 ед/мкл). Инкубировали в течение 15 мин при 45 °C.

Показать весь текст

Список литературы

  1. Bourne, H.R., Sanders, D.A., and McCormick, F. (1990) The GTPase superfamily: a conserved switch for diverse cell functions. Nature 348: 125−132.
  2. Nissen, P., Kjeldgaard, M., and Nyborg, J. (2000) Macromolecular mimicry. EMBO J. 19: 489−495.
  3. Tate, W.P., Beaudet, A.L., and Caskey, C.T. (1973) Influence of guanine nucleotides and elongation factors on interaction of release factors with the ribosome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70: 2350−2355.
  4. La Teana, A., Gualerzi, C.O., and Dahlberg, A.E. (2001) Initiation factor IF 2 binds to the alpha-sarcin loop and helix 89 of Escherichia coli 23S ribosomal RNA. RNA 7:1173−1179.
  5. Richman, N., and Bodley, J.W. (1972) Ribosomes cannot interact simultaneously with elongation factors EF Tu and EF G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 686−689.
  6. Moazed, D., Robertson, J.M., and Noller, H.F. (1988) Interaction of elongation factors EF-G and EF-Tu with a conserved loop in 23S RNA. Nature 334: 362−364.
  7. Lodmell, J.S., and Dahlberg, A.E. (1997) A conformational switch in Escherichia coli 16S ribosomal RNA during decoding of messenger RNA. Science 277: 1262−1267.
  8. Gabashvili, I.S., Agrawal, R.K., Grassucci, R., Squires, C.L., Dahlberg, A.E., and Frank, J. (1999) Major rearrangements in the 70S ribosomal 3D structure caused by a conformational switch in 16S ribosomal RNA. EMBO J. 18: 6501−6507.
  9. Zavialov, A.V., and Ehrenberg, M. (2003) Peptidyl-tRNA regulates the GTPase activity of t translation factors. Cell 114: 113−122.
  10. Bourne, H.R., Sanders, D.A., and McCormick, F. (1991) The GTPase superfamily: conserved structure and molecular mechanism. Nature 349: 117−127.
  11. Vetter, I.R., and Wittinghofer, A. (2001) The guanine nucleotide-binding switch in three dimensions. Science 294: 1299−1304.
  12. Berman, D.M., Kozasa, Т., and Gilman, A.G. (1996) The GTPase-activating protein RGS4 stabilizes the transition state for nucleotide hydrolysis. J. Biol. Chem. 271: 2 720 927 212.
  13. Seewald, M.J., Korner, C., Wittinghofer, A., and Vetter, I.R. (2002) RanGAP mediates GTP hydrolysis without an arginine finger. Nature 415: 662−666.
  14. Moller, W., and Amons, R. (1985) Phosphate-binding sequences in nucleotide-binding proteins. FEBS Lett. 186: 1−7.
  15. Moore, K.J., Webb, M.R., and Eccleston, J.F. (1993) Mechanism of GTP hydrolysis by p21N-ras catalyzed by GAP: studies with a fluorescent GTP analogue. Biochemistry 32:7451−7459.
  16. Langen, R., Schweins, T., and Warshel, A. (1992) On the mechanism of guanosine triphosphate hydrolysis in ras p21 proteins. Biochemistry 31: 8691−8696.
  17. Schweins, T., Langen, R., and Warshel, A. (1994) Why have mutagenesis studies not located the general base in ras p21. Nat. Struct. Biol. 1: 476−484.
  18. Schweins, T., Geyer, M., Kalbitzer, H.R., Wittinghofer, A., and Warshel, A. (1996) Linear free energy relationships in the intrinsic and GTPase activating protein-stimulated guanosine 5'-triphosphate hydrolysis of p21ras. Biochemistry 35: 14 225−14 231.
  19. Coleman, D.E., Berghuis, A.M., Lee, E., Linder, M.E., Gilman, A.G., and Sprang, S.R. (1994) Structures of active conformations of G| alpha 1 and the mechanism of GTP hydrolysis. Science 265: 1405−1412.
  20. Sondek, J., Lambright, D.G., Noel, J.P., Hamm, H.E., and Sigler, P.B. (1994) GTPase mechanism of Gproteins from the 1.7-A crystal structure of transducin alpha-GDP-AIF4 Nature 372: 276−279.
  21. Rittinger, K., Walker, P.A., Eccleston, J.F., Smerdon, S.J., and Gamblin, S.J. (1997) Structure at 1.65 A of RhoA and its GTPase-activating protein in complex with a transitionstate analogue. Nature 389: 758−762.
  22. Scheffzek, K., Ahmadian, M.R., Kabsch, W., Wiesmuller, L., Lautwein, A., Schmitz, F., and Wittinghofer, A. (1997) The Ras-RasGAP complex: structural basis for GTPase activation and its loss in oncogenic Ras mutants. Science 277: 333−338.
  23. Tesmer, J.J., Berman, D.M., Gilman, A.G., and Sprang, S.R. (1997) Structure of RGS4 bound to AIF4"-activated Gj alphal: stabilization of the transition state for GTP hydrolysis. Cell 89: 251−261.
  24. Maegley, K.A., Admiraal, S.J., and Herschlag, D. (1996) Ras-catalyzed hydrolysis of GTP: a new perspective from model studies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8160−8166.
  25. Scheidig, A.J., Burmester, C., and Goody, R.S. (1999) The pre-hydrolysis state of p21 (ras) in complex with GTP: new insights into the role of water molecules in the GTP hydrolysis reaction of ras-like proteins. Structure Fold. Des. 7: 1311−1324.
  26. Kjeldgaard, M., and Nyborg, J. (1992) Refined structure of elongation factor EF-Tu from Escherichia coii. J. Moi. Biol. 223: 721−742.
  27. Abel, K., Yoder, M.D., Hilgenfeld, R., and Jurnak, F. (1996) An alpha to beta conformational switch in EF-Tu. Structure 4:1153−1159.
  28. Polekhina, G., Thirup, S., Kjeldgaard, M., Nissen, P., Lippmann, C., and Nyborg, J. (1996) Helix unwinding in the effector region of elongation factor EF-Tu-GDP. Structure 4: 1141−1151.
  29. Berchtold, H., Reshetnikova, L., Reiser, C.O., Schirmer, N.K., Sprinzl, M., and Hilgenfeld, R. (1993) Crystal structure of active elongation factor Tu reveals major domain rearrangements. Nature 365:126−132.
  30. Kjeldgaard, M., Nissen, P., Thirup, S., and Nyborg, J. (1993) The crystal structure of elongation factor EF-Tu from Thermus aquaticus in the GTP conformation. Structure 1: 3550.
  31. Nissen, P., Kjeldgaard, M., Thirup, S., Polekhina, G., Reshetnikova, L., Clark, B.F., and Nyborg, J. (1995) Crystal structure of the ternary complex of Phe-tRNAPhe, EF-Tu, and a GTP analog. Science 270: 1464−1472.
  32. Nissen, P., Thirup, S., Kjeldgaard, M., and Nyborg, J. (1999) The crystal structure of Cys-tRNACys-EF-Tu-GDPNP reveals general and specific features in the ternary complex and in tRNA. Structure Fold. Des. 7:143−156.
  33. Roll-Mecak, A., Cao, C., Dever, T.E., and Burley, S.K. (2000) X-Ray structures of the universal translation initiation factor IF2/elF5B: conformational changes on GDP and GTP binding. Cell 103: 781−792.
  34. Meunier, S., Spurio, R., Czisch, M., Wechselberger, R., Guenneugues, M., Gualerzi, C.O., and Boelens, R. (2000) Structure of the fMet-tRNA (fMet)-binding domain of B. stearothermophilus initiation factor IF2. EMBO J. 19: 1918−1926.
  35. , P.B. (1995) Molecular mimicry in protein synthesis? Science 270: 1453−1454.
  36. , A. (1996) Imprinting through molecular mimicry. Protein synthesis. Curr. Biol. 6: 247−249.
  37. Nyborg, J., Nissen, P., Kjeldgaard, M., Thirup, S., Polekhina, G., Clark, B.F., and Reshetnikova, L. (1997) Macromolecular mimicry in protein biosynthesis. Fold. Des. 2: S7−11.
  38. Ito, K., Ebihara, K., Uno, M., and Nakamura, Y. (1996) Conserved motifs In prokaryotic and eukaryotic polypeptide release factors: tRNA-protein mimicry hypothesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5443−5448.
  39. Nakamura, Y., Ito, K., and Isaksson, L.A. (1996) Emerging understanding of translation termination. Cell 87:147−150.
  40. Brock, S., Szkaradkiewicz, K., and Sprinzl, M. (1998) Initiation factors of protein biosynthesis in bacteria and their structural relationship to elongation and termination factors. Mol. Microbiol. 29: 409−417.
  41. Selmer, M., Al-Karadaghi, S., Hirokawa, G., Kaji, A., and Liljas, A. (1999) Crystal structure of Thermotoga maritima ribosome recycling factor: a tRNA mimic. Science 286: 2349−2352.
  42. , R. (1995) How do the GTPases really work? Nat. Struct. Biol. 2: 3−6.
  43. , Y. (1978) The role of guanosine 5'-triphosphate in polypeptide chain elongation. Biochim. Biophys. Acta 505: 95−127.
  44. Rodnina, M.V., Savelsbergh, A., Katunin, V.I., and Wintermeyer, W. (1997) Hydrolysis of GTP by elongation factor G drives tRNA movement on the ribosome. Nature 385: 37−41.
  45. Tomsic, J., Vitali, L.A., Daviter, T., Savelsbergh, A., Spurio, R., Striebeck, P., Wintermeyer, W., Rodnina, M.V., and Gualerzi, C.O. (2000) Late events of translation initiation in bacteria: a kinetic analysis. EMBO J. 19: 2127−2136.
  46. Zavialov, A.V., Buckingham, R.H., and Ehrenberg, M. (2001) A posttermination ribosomal complex is the guanine nucleotide exchange factor for peptide release factor RF3. Cell 107: 115−124.
  47. Rodnina, M.V., Stark, H., Savelsbergh, A., Wieden, H.J., Mohr, D., Matassova, N.B., Peske, F., Daviter, T., Gualerzi, C.O., and Wintermeyer, W. (2000) GTPases mechanisms and functions of translation factors on the ribosome. Biol. Chem. 381: 377−387.
  48. Pape, T., Wintermeyer, W., and Rodnina, M.V. (1998) Complete kinetic mechanism of elongation factor Tu-dependent binding of aminoacyl-tRNA to the A site of the E. coli ribosome. EMBO J. 17: 7490−7497.
  49. Rodnina, M.V., Pape, T., Fricke, R., Kuhn, L., and Wintermeyer, W. (1996) Initial binding of the elongation factor Tu.GTP.aminoacyl-tRNA complex preceding codon recognition on the ribosome. J. Biol. Chem. 271: 646−652.
  50. Rodnina, M.V., Fricke, R., Kuhn, L., and Wintermeyer, W. (1995) Codon-dependent conformational change of elongation factor Tu preceding GTP hydrolysis on the ribosome. EMBOJ. 14: 2613−2619.
  51. Rodnina, M.V., Pape, T., Fricke, R., and Wintermeyer, W. (1995) Elongation factor Tu, a GTPase triggered by codon recognition on the ribosome: mechanism and GTP consumption. Biochem Cell Biol 73: 1221−1227.
  52. Savelsbergh, A., Katunin, V., Mohr, D., Peske, F., Rodnina, M., and Wintermeyer, W. (2003) An elongation factor G-induced ribosome rearrangement precedes tRNA-mRNA translocation. Mol. Cell 11: 1517−1523.
  53. Dell, V.A., Miller, D.L., and Johnson, A.E. (1990) Effects of nucleotide- and aurodox-induced changes in elongation factor Tu conformation upon its interactions with aminoacyl transfer RNA. A fluorescence study. Biochemistry 29: 1757−1763.
  54. Rodnina, M.V., Pape, T., Fricke, R., and Wintermeyer, W. (1995) Elongation factor Tu, a GTPase triggered by codon recognition on the ribosome: mechanism and GTP consumption. Biochem. Cell Biol. 73:1221−1227.
  55. Parmeggiani, A., and Sander, G. (1981) Properties and regulation of the GTPase activities of elongation factors Tu and G, and of initiation factor 2. Mol. Cell Biochem. 35: 129−158.
  56. Piepenburg, O., Pape, T., Pleiss, J.A., Wintermeyer, W., Uhlenbeck, O.C., and Rodnina, M.V. (2000) Intact aminoacyl-tRNA is required to trigger GTP hydrolysis by elongation factor Tu on the ribosome. Biochemistry 39: 1734−1738.
  57. Ogle, J.M., Brodersen, D.E., Clemons, W.M., Jr., Tarry, M.J., Carter, A.P., and Ramakrishnan, V. (2001) Recognition of cognate transfer RNA by the 30S ribosomal subunit. Science 292: 897−902.
  58. Pape, T., Wintermeyer, W., and Rodnina, M.V. (2000) Conformational switch in the decoding region of 16S rRNA during aminoacyl-tRNA selection on the ribosome. Nat. Struct. Biol. 7: 104−107.
  59. Ogle, J.M., Murphy, F.V., Tarry, M.J., and Ramakrishnan, V. (2002) Selection of tRNA by the ribosome requires a transition from an open to a closed form. Cell 111: 721−732.
  60. Cate, J.H., Yusupov, M.M., Yusupova, G.Z., Earnest, T.N., and Noller, H.F. (1999) X-ray crystal structures of 70S ribosome functional complexes. Science 285: 2095−2104.
  61. Tapprich, W.E., and Dahlberg, A.E. (1990) A single base mutation at position 2661 in E. coli 23S ribosomal RNA affects the binding of ternary complex to the ribosome. EMBO J. 9: 2649−2655.
  62. Powers, T., and Noller, H.F. (1993) Evidence for functional interaction between elongation factor Tu and 16S ribosomal RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1364−1368.
  63. O’Connor, M., Brunelli, C.A., Firpo, M.A., Gregory, S.T., Lieberman, K.R., Lodmell, J.S., Moine, H., Van Ryk, D.I., and Dahlberg, A.E. (1995) Genetic probes of ribosomal RNA function. Biochem. Cell Biol. 73: 859−868.
  64. Lodmell, J.S., and Dahlberg, A.E. (1997) A conformational switch in Escherichia coli 16S ribosomal RNA during decoding of messenger RNA. Science 277:1262−1267.
  65. Yarus, M., and Smith, D. (1995) tRNA on the ribosome: a waggle theory. In tRNA: Structure, Biosynthesis and Function. RajBhandary, D.S.a.U. (ed). Washington, D.C.: USA: American Society for Microbiology, pp. 443−468.
  66. Rodnina, M.V., Fricke, R., and Wintermeyer, W. (1994) Transient conformational states of aminoacyl-tRNA during ribosome binding catalyzed by elongation factor Tu. Biochemistry 33:12 267−12 275.
  67. Stark, H., Rodnina, M.V., Rinke-Appel, J., Brimacombe, R., Wintermeyer, W., and van Heel, M. (1997) Visualization of elongation factor Tu on the Escherichia coli ribosome. Nature 389: 403−406.
  68. Stark, H., Rodnina, M.V., Wieden, H.J., Zemlin, F., Wintermeyer, W., and van Heel, M. (2002) Ribosome interactions of aminoacyl-tRNA and elongation factor Tu in the codon-recognition complex. Nat. Struct. Biol. 9: 849−854.
  69. Valle, M., Sengupta, J., Swami, N.K., Grassucci, R.A., Burkhardt, N., Nierhaus, K.H., Agrawal, R.K., and Frank, J. (2002) Cryo-EM reveals an active role for aminoacyl-tRNA in the accommodation process. EMBO J. 21: 3557−3567.
  70. Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Capel, M., Moore, P.B., and Steitz, T.A. (1999) Placement of protein and RNA structures into a 5 A-resolution map of the 50S ribosomal subunit. Nature 400: 841−847.
  71. Katunin, V.I., Savelsbergh, A., Rodnina, M.V., and Wintermeyer, W. (2002) Coupling of GTP hydrolysis by elongation factor G to translocation and factor recycling on the ribosome. Biochemistry 41: 12 806−12 812.
  72. , A.S. (1968) On the mechanism of ribosome function. The hypothesis of locking-unlocking of subparticles. Dokl. Akad. Nauk SSSR179:1467−1470.
  73. , V. (2002) Ribosome structure and the mechanism of translation. Cell 108: 557−572.
  74. Scolnick, E., Tompkins, R., Caskey, T., and Nirenberg, M. (1968) Release factors differing in specificity for terminator codons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 61: 768−774.
  75. Kisselev, L.L., and Buckingham, R.H. (2000) Translational termination comes of age. Trends Biochem. Sci. 25: 561−566.
  76. Milman, G., Goldstein, J., Scolnick, E., and Caskey, T. (1969) Peptide chain termination. 3. Stimulation of in vitro termination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63: 183−190.
  77. Grentzmann, G., Brechemier-Baey, D., Heurgue, V., Mora, L., and Buckingham, R.H. (1994) Localization and characterization of the gene encoding release factor RF3 in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad Sci. USA 91: 5848−5852.
  78. Mikuni, O., Ito, K., Moffat, J., Matsumura, K., McCaughan, K., Nobukuni, T., Tate, W., and Nakamura, Y. (1994) Identification of the prfC gene, which encodes peptide-chain-release factor 3 of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5798−5802.
  79. Freistroffer, D.V., Pavlov, M.Y., MacDougall, J., Buckingham, R.H., and Ehrenberg, M. (1997) Release factor RF3 in E. coli accelerates the dissociation of release factors RF1 and RF2 from the ribosome in a GTP-dependent manner. EMBO J. 16: 4126−4133.
  80. Goldstein, J.L., and Caskey, C.T. (1970) Peptide chain termination: effect of protein S on ribosomal binding of release factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 67: 537−543.
  81. Pel, H.J., Moffat, J.G., Ito, K., Nakamura, Y. f and Tate, W.P. (1998) Escherichia coli release factor 3: resolving the paradox of a typical G protein structure and atypical function with guanine nucleotides. RNA 4: 47−54.
  82. , S.R. (1997) G protein mechanisms: insights from structural analysis. Annu. Rev. Biochem. 66: 639−678.
  83. Frolova, L., Le Goff, X., Zhouravleva, G., Davydova, E., Philippe, M., and Kisselev, L. (1996) Eukaryotic polypeptide chain release factor eRF3 is an eRF1- and ribosome-dependent guanosine triphosphatase. RNA 2: 334−341.
  84. Zavialov, A.V., Mora, L., Buckingham, R.H., and Ehrenberg, M. (2002) Release of peptide promoted by the GGQ motif of class 1 release factors regulates the GTPase activity of RF3. Mol. Cell 10: 789−798.
  85. Ott, G., Faulhammer, H.G., and Sprinzl, M. (1989) Interaction of elongation factor Tu from Escherichia coli with aminoacyl-tRNA carrying a fluorescent reporter group on the 3' terminus. Eur. J. Biochem. 184: 345−352.
  86. Abrahamson, J.K., Laue, T.M., Miller, D.L., and Johnson, A.E. (1985) Direct determination of the association constant between elongation factor Tu X GTP and aminoacyl-tRNA using fluorescence. Biochemistry 24: 692−700.
  87. Baca, O.G., Rohrbach, M.S., and Bodley, J.W. (1976) Equilibrium measurements of the interactions of guanine nucleotides with Escherichia coli elongation factor G and the ribosome. Biochemistry 15: 4570−4574.
  88. Gromadski, K.B., Wieden, H.J., and Rodnina, M.V. (2002) Kinetic mechanism of elongation factor Ts-catalyzed nucleotide exchange in elongation factor Tu. Biochemistry 41: 162−169.
  89. , F. (1998) Ras signalling. Caught in the act of the switch-on. Nature 394: 317,319−320.
  90. Nixon, A.E., Brune, M., Lowe, P.N., and Webb, M.R. (1995) Kinetics of inorganic phosphate release during the interaction of p21ras with the GTPase-activating proteins, p120-GAP and neurofibromin. Biochemistry 34: 15 592−15 598.
  91. Ting, T.D., and Ho, Y.K. (1991) Molecular mechanism of GTP hydrolysis by bovine transducin: pre-steady-state kinetic analyses. Biochemistry 30: 8996−9007.
  92. Agrawal, R.K., Penczek, P., Grassucci, R.A., and Frank, J. (1998) Visualization of elongation factor G on the Escherichia coli 70S ribosome: the mechanism of translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 6134−6138.
  93. Stark, H., Rodnina, M.V., Wieden, H.J., van Heel, M., and Wintermeyer, W. (2000) Large-scale movement of elongation factor G and extensive conformational change of the ribosome during translocation. Cell 100: 301−309.
  94. Wahl, M.C., Bourenkov, G.P., Bartunik, H.D., and Huber, R. (2000) Flexibility, conformational diversity and two dimerization modes in complexes of ribosomal protein L12. EMBOJ. 19: 174−186.
  95. Mohr, D., Wintermeyer, W., and Rodnina, M.V. (2002) GTPase activation of elongation factors Tu and G on the ribosome. Biochemistry 41: 12 520−12 528.
  96. Savelsbergh, A., Mohr, D., Wilden, B., Wintermeyer, W., and Rodnina, M.V. (2000) Stimulation of the GTPase Activity of Translation Elongation Factor G by Ribosomal Protein L7/12. J. Biol. Chem. 275: 890−894.
  97. Stoffler, G., Cundliffe, E., Stoffler-Meilicke, M., and Dabbs, E.R. (1980) Mutants of Escherichia coli lacking ribosomal protein L11. J. Biol. Chem. 255: 10 517−10 522.
  98. Rodnina, M.V., Savelsbergh, A., Matassova, N.B., Katunin, V.I., Semenkov, Y.P., and Wintermeyer, W. (1999) Thiostrepton inhibits the turnover but not the GTPase of elongation factor G on the ribosome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 9586−9590.
  99. Savelsbergh, A., Matassova, N.B., Rodnina, M.V., and Wintermeyer, W. (2000) Role of domains 4 and 5 in elongation factor G functions on the ribosome. J. Mol. Biol. 300: 951 961.
  100. Knudsen, C.R., and Clark, B.F. (1995) Site-directed mutagenesis of Arg58 and Asp86 of elongation factor Tu from Escherichia coli: effects on the GTPase reaction and aminoacyl-tRNA binding. Protein Eng. 8: 1267−1273.
  101. Mohr, D., Wintermeyer, W., and Rodnina, M.V. (2000) Arginines 29 and 59 of elongation factor G are important for GTP hydrolysis or translocation on the ribosome. EMBOJ. 19: 3458−3464.
  102. Belitsina, N.V., Glukhova, M.A., and Spirln, A.S. (1975) Translocation in ribosomes by attachment-detachment of elongation factor G without GTP cleavage: evidence from a column-bound ribosome system. FEBS Lett. 54: 35−38.
  103. , A.S. (1985) Ribosomal translocation: facts and models. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 32: 75−114.
  104. Abel, K., and Jurnak, F. (1996) A complex profile of protein elongation: translating chemical energy into molecular movement. Structure 4: 229−238.
  105. Gavrilova, L.P., Kostiashkina, O.E., Koteliansky, V.E., Rutkevitch, N.M., and Spirin, A.S. (1976) Factor-free («non-enzymic») and factor-dependent systems of translation of polyuridylic acid by Escherichia coli ribosomes. J. Mol. Biol. 101: 537−552.
  106. Southworth, D.R., Brunelle, J.L., and Green, R. (2002) EFG-independent translocation of the mRNA: tRNA complex is promoted by modification of the ribosome with thiol-specific reagents. J. Mol. Biol. 324: 611−623.
  107. Moazed, D., and Noller, H.F. (1989) Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature 342:142−148.
  108. , E. (1990) Recognition sites for antibiotics within rRNA. Washington, DC: American Society for Microbiology, 479−490.
  109. Modolell, J., and Vazquez (1977) The Inhibition of ribosomal translocation by viomycin. Eur. J. Biochem. 81:491−497.
  110. , E. (1972) The mode of action of fusidic acid. Biochem. Biophys. Res. Commun. 46:1794−1801.
  111. Borowski, C., Rodnina, M.V., and Wintermeyer, W. (1996) Truncated elongation factor G lacking the G domain promotes translocation of the 3' end but not of the anticodon domain of peptidyl-tRNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 4202−4206.
  112. Clark, B.F., and Nyborg, J. (1997) The ternary complex of EF-Tu and its role in protein biosynthesis. Curr. Opiri. Struct. Biol. 7:110−116.
  113. Liljas, A., A, A.E., al-Karadaghi, S., Garber, M., Zheltonosova, J., and Brazhnikov, E. (1995) Crystallographic studies of elongation factor G. Biochem. Cell Biol. 73: 1209−1216.
  114. Nyborg, J., Nissen, P., Kjeldgaard, M., Thirup, S" Polekhina, G., and Clark, B.F. (1996) Structure of the ternary complex of EF-Tu: macromolecular mimicry in translation. Trends Biochem. Sci. 21: 81−82.
  115. Martemyanov, K.A., and Gudkov, A.T. (1999) Domain IV of elongation factor G from Thermus thermophilus is strictly required for translocation. FEBS Lett. 452: 155−159.
  116. Martemyanov, K.A., Yarunin, A.S., Liljas, A., and Gudkov, A.T. (1998) An intact conformation at the tip of elongation factor G domain IV is functionally important. FEBS Lett. 434: 205−208.
  117. Kimata, Y., and Kohno, K. (1994) Elongation factor 2 mutants deficient in diphthamide formation show temperature-sensitive cell growth. J. Biol. Chem. 269:13 497−13 501.
  118. Foley, B.T., Moehring, J.M., and Moehring, T.J. (1995) Mutations in the elongation factor 2 gene which confer resistance to diphtheria toxin and Pseudomonas exotoxin A. Genetic and biochemical analyses. J. Biol. Chem. 270: 23 218−23 225.
  119. Martemyanov, K.A., and Gudkov, A.T. (2000) Domain III of elongation factor G from Thermus thermophilus is essential for induction of GTP hydrolysis on the ribosome. J. Biol. Chem. 275: 35 820−35 824.
  120. Rodnina, M.V., Savelsbergh, A., and Wintermeyer, W. (1999) Dynamics of translation on the ribosome: molecular mechanics of translocation. FEMS Microbiol. Rev. 23: 317 333.
  121. Sharer, J.D., Koosha, H., Church, W.B., and March, P.E. (1999) The function of conserved amino acid residues adjacent to the effector domain in elongation factor G. Proteins 37: 293−302.
  122. Laurberg, M., Kristensen, O., Martemyanov, K., Gudkov, A.T., Nagaev, I., Hughes, D., and Liljas, A. (2000) Structure of a mutant EF-G reveals domain III and possibly the fusidic acid binding site. J. Mol. Biol. 303: 593−603.
  123. Johanson, U., and Hughes, D. (1994) Fusidic acid-resistant mutants define three regions in elongation factor G of Salmonella typhimurium. Gene 143: 55−59.
  124. Johanson, U., Aevarsson, A., Liljas, A., and Hughes, D. (1996) The dynamic structure of EF-G studied by fusidic acid resistance and internal revertants. J. Mol. Biol. 258: 420−432.
  125. Czworkowski, J., and Moore, P.B. (1997) The conformational properties of elongation factor G and the mechanism of translocation. Biochemistry 36: 10 327−10 334.
  126. Johanson, U., and Hughes, D. (1994) Fusidic acid-resistant mutants define three regions in elongation factor G of Salmonella typhimurium. Gene 143: 55−59.
  127. , A.S. (1969) A model of the functioning ribosome: locking and unlocking of the ribosome subparticles. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 34: 197−207.
  128. Liljas, A., and Garber, M. (1995) Ribosomal proteins and elongation factors. Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 721−727.
  129. Girshovich, A.S., Bochkareva, E.S., and Gudkov, A.T. (1982) Specific interaction of the elongation factor EF-G with the ribosomal 23 S RNA from Escherichia coli. FEBS Lett. 150: 99−102.
  130. , S.E. (1983) Chemical crosslinking of elongation factor G to the 23S RNA in 70S ribosomes from Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 11: 4923−4932.
  131. Matassova, A.B., Rodnina, M.V., and Wintermeyer, W. (2001) Elongation factor G-induced structural change in helix 34 of 16S rRNA related to translocation on the ribosome. RNA 7: 1879−1885.
  132. Hausner, T.P., Atmadja, J., and Nierhaus, K.H. (1987) Evidence that the G2661 region of 23S rRNA is located at the ribosomal binding sites of both elongation factors. Biochimie 69:911−923.
  133. Munishkin, A., and Wool, I.G. (1997) The ribosome-in-pieces: binding of elongation factor EF-G to oligoribonucleotides that mimic the sarcin/ricin and thiostrepton domains of 23S ribosomal RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12 280−12 284.
  134. Wilson, K.S., and Noller, H.F. (1998) Mapping the position of translational elongation factor EF-G in the ribosome by directed hydroxyl radical probing. Cell 92: 131−139.
  135. Moazed, D., and Noller, H.F. (1986) Transfer RNA shields specific nucleotides in 16S ribosomal RNA from attack by chemical probes. Cell 47: 985−994.
  136. Prince, J.B., Taylor, B.H., Thurlow, D.L., Ofengand, J., and Zimmermann, R.A. (1982) Covalent crosslinking of tRNA/3' to 16S RNA at the ribosomal P site: identification of crosslinked residues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5450−5454.
  137. Serdyuk, I., Baranov, V., Tsalkova, T., Gulyamova, D., Pavlov, M., Spirin, A., and May, R. (1992) Structural dynamics of translating ribosomes. Biochimie 74: 299−306.
  138. Stark, H., Mueller, F., Orlova, E.V., Schatz, M., Dube, P., Erdemir, T., Zemlin, F., Brimacombe, R., and van Heel, M. (1995) The 70S Escherichia coli ribosome at 23 A resolution: fitting the ribosomal RNA. Structure 3: 815−821.
  139. Stark, H., Orlova, E.V., Rinke-Appel, J., Junke, N., Mueller, F., Rodnina, M., Wintermeyer, W., Brimacombe, R., and van Heel, M. (1997) Arrangement of tRNAs in pre-and posttranslocational ribosomes revealed by electron cryomicroscopy. Cell 88: 19−28.
  140. Frank, J., and Agrawal, R.K. (2000) A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature 406: 318−322.
  141. Moine, H., and Dahlberg, A.E. (1994) Mutations in helix 34 of Escherichia coli 16 S ribosomal RNA have multiple effects on ribosome function and synthesis. J. Mol. Biol. 243: 402−412.
  142. Prescott, C.D., and Kornau, H.C. (1992) Mutations in E. coli 16s rRNA that enhance and decrease the activity of a suppressor tRNA. Nucleic Acids Res. 20: 1567−1571.
  143. Carter, A.P., Clemons, W.M., Brodersen, D.E., Morgan-Warren, R.J., Wimberly, B.T., and Ramakrishnan, V. (2000) Functional insights from the structure of the 30S ribosomal subunit and its interactions with antibiotics. Nature 407: 340−348.
  144. Bollen, A., Davies, J., Ozaki, M., and Mizushima, S. (1968) Ribosomal protein conferring sensitivity to the antibiotic spectinomycin in Escherichia coli. Science 165: 8586.
  145. Sigmund, C.D., Ettayebi, M., and Morgan, E.A. (1984) Antibiotic resistance mutations in 16S and 23S ribosomal RNA genes of Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 12: 4653−4663.
  146. Powers, T., and Noller, H.F. (1995) Hydroxyl radical footprinting of ribosomal proteins on 16S rRNA. RNA 1:194−209.
  147. Wimberly, B.T., Brodersen, D.E., Clemons, W.M.J., Morgan-Warren, R.J., Carter, A.P., Vonrhein, C., Hartsch, T., and Ramakrishnan, V. (2000) Structure of the 30S ribosomal subunit. Nature 407: 327−339.
  148. Heilek, G.M., Marusak, R., Meares, C.F., and Noller, H.F. (1995) Directed hydroxyl radical probing of 16S rRNA using Fe (ll) tethered to ribosomal protein S4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1113−1116.
  149. Powers, T., and Noller, H.F. (1991) A functional pseudoknot in 16S ribosomal RNA. EMBOJ. 10: 2203−2214.
  150. Marsh, R.C., and Parmeggiani, A. (1973) Requirement of proteins S5 and S9 from 30S subunits for the ribosome-dependent GTPase activity of elongation factor G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70: 151−155.
  151. Vila-Sanjurjo, A., Ridgeway, W.K., Seymaner, V., Zhang, W., Santoso, S., Yu, K., and Cate, J.H. (2003) X-ray crystal structures of the WT and a hyper-accurate ribosome from Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 100: 8682−8687.
  152. Pape, T., Wintermeyer, W., and Rodnina, M. (1999) Induced fit in initial selection and proofreading of aminoacyl-tRNA on the ribosome. EMBO J. 18: 3800−3807.
  153. Osswald, M., and Brimacombe, R. (1999) The environment of 5S rRNA in the ribosome: cross-links to 23S rRNA from sites within helices II and III of the 5S molecule. Nucleic Acids Res. 27: 2283−2290.
  154. Sergiev, P., Dokudovskaya, S., Romanova, E., Topin, A., Bogdanov, A., Brimacombe, R., and Dontsova, O. (1998) The environment of 5S rRNA in the ribosome: cross-links to the GTPase-associated area of 23S rRNA. Nucleic Acids Res. 26: 2519−2525.
  155. Goddard, D.R., and Michaelis, L. (1935). J. Bio. Chem. 236: 416.
  156. , C.B. (1958) In Symposium on protein structure N.Y., pp. 223.
  157. Sela, M., White, F.H., and Anfinsen, C.B. (1959). Biochim. et Biophys. Acta 31: 417.
  158. O’Connor, M" Lee, W.M., Mankad, A., Squires, C.L., and Dahlberg, A.E. (2001) Mutagenesis of the peptidyltransferase center of 23S rRNA: the invariant U2449 is dispensable. Nucleic Acids Res. 29: 710−715.
  159. Rodnina, M.V., and Wintermeyer, W. (1995) GTP consumption of elongation factor Tu during translation of heteropolymeric mRNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1945−1949.
  160. Roughton, F.J.W. (1934). Proc. R. Soc. B115: 475.
  161. , B. (1940). J. Franklin Inst. 229: 455, 613, 537.
  162. Wintermeyer, W., and Zachau, H.G. (1970) A specific chemical chain scission of tRNA at 7-methylguanosine. FEBS Lett. 11: 160−164.
  163. Wintermeyer, W., and Zachau, H.G. (1971) Replacement of Y base, dihydrouracil, and 7-methylguanine in tRNA by artificial odd bases. FEBS Lett. 18: 214−218.
  164. O’Connor, M., and Dahlberg, A.E. (1993) Mutations at U2555, a tRNA-protected base in 23S rRNA, affect translational fidelity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 9214−9218.
  165. , J.H. (1991) A Short Course in Bacterial Genetics. Plainview, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
  166. Hirsh, D., and Gold, L. (1971) Translation of the UGA triplet in vitro by tryptophan transfer RNA’s. J. Mol. Biol. 58: 459−468.
  167. Davies, J., Jones, D.S., and Khorana, H.G. (1966) A further study of misreading of codons induced by streptomycin and neomycin using ribopolynucleotides containing two nucleotides in alternating sequence as templates. J. Mol. Biol. 18: 48−57.
  168. Weiss, W.A., Edelman, I., Culbertson, M.R., and Friedberg, E.C. (1987) Physiological levels of normal tRNA (CAGGIn) can effect partial suppression of amber mutations in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8031−8034.
  169. Harger, J.W., Meskauskas, A., and Dinman, J.D. (2002) An «integrated model» of programmed ribosomal frameshifting. Trends Biochem. Sci. 27: 448−454.
  170. O’Connor, M., Thomas, C.L., Zimmermann, R.A., and Dahlberg, A.E. (1997) Decoding fidelity at the ribosomal A and P sites: influence of mutations in three different regions of the decoding domain in 16S rRNA. Nucleic Acids Res. 25:1185−1193.
  171. Merryman, C., Moazed, D., McWhirter, J., and Noller, H.F. (1999) Nucleotides in 16S rRNA protected by the association of 30S and 50S ribosomal subunits. J. Mol. Biol. 285: 97−105.
  172. Nissen, P., Hansen, J., Ban, N., Moore, P.B., and Steitz, T.A. (2000) The structural basis of ribosome activity in peptide bond synthesis. Science 289: 920−930.
  173. Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P.B., and Steitz, T.A. (2000) The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution. Science 289: 905−920.
  174. Correll, C.C., Munishkin, A., Chan, Y.-L., Ren, Z., Wool, I.G., and Steitz, T.A. (1998) Crystal structure of the ribosomal RNA domain essential for binding elongation factors.
  175. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13 436−13 441.
  176. Harms, J., Schiuenzen, F., Zarivach, R., Bashan, A., Gat, S., Agmon, I., Bartels, H., Franceschi, F., and Yonath, A. (2001) High resolution structure of the large ribosomal subunit from a mesophilic eubacterium. Cell 107: 679−688.
  177. Macbeth, M.R., and Wool, I.G. (1999) The phenotype of mutations of G2655 in the sarcin/ricin domain of 23 S ribosomal RNA. J. Mol. Biol. 285: 965−975.
  178. Leonov, A.A., Sergiev, P.V., Bogdanov, A.A., Brimacombe, R., and Dontsova, O.A. (2003) Affinity purification of ribosomes with a lethal G2655C mutation in 23 S rRNA that affects the translocation. J. Biol. Chem. 278: 25 664−25 670.
  179. Macon, J.B., and Wolfenden, R. (1968) 1-Methyladenosine. Dimroth rearrangement and reversible reduction. Biochemistry 7: 3453−3458.
  180. Lynch, S.R., and Puglisi, J.D. (2001) Structure of a eukaryotic decoding region A-site RNA. J. Mol. Biol. 306: 1023−1035.
  181. Blanchard, S.C., and Puglisi, J.D. (2001) Solution structure of the A loop of 23S ribosomal RNA. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98: 3720−3725.
  182. Hoibrook, S.R., Cheong, C., Tinoco, I., Jr., and Kim, S.H. (1991) Crystal structure of an RNA double helix incorporating a track of non-Watson-Crick base pairs. Nature 353: 579 581.
  183. Auffinger, P., and Westhof, E. (1999) Singly and bifurcated hydrogen-bonded base-pairs in tRNA anticodon hairpins and ribozymes. J. Mol. Biol. 292: 467−483.
  184. Hartman, K.A.J., and Rich, A. (1965) The tautomeric form of helical polyribocytidylic acid. J. Am. Chem. Soc. 87: 2033−2039.
  185. Chen, L., Cai, L., Zhang, X., and Rich, A. (1994) Crystal structure of a four-stranded intercalated DNA: d (C4). Biochemistry 33:13 540−13 546.
  186. Holland, J.A., and Hoffman, D.W. (1996) Structural features and stability of an RNA triple helix in solution. Nucleic Acids Res. 24: 2841−2848.
  187. Brodsky, A.S., Erlacher, H.A., and Williamson, J.R. (1998) NMR evidence for a base triple in the HIV-2 TAR C"G.C+ mutant-argininamide complex. Nucleic Acids Res. 26: 1991−1995.
  188. Pan, B., Mitra, S.N., and Sundaralingam, M. (1999) Crystal structure of an RNA 16-mer duplex R (GCAGAGUUAAAUCUGC)2 with nonadjacent G (syn).A+(anti) mispairs. Biochemistry 38: 2826−2831.
  189. , U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680−685.
  190. Rodnina, M.V., Savelsbergh, A., Matassova, N.B., Katunin, V.l., Semenkov, Y.P., and Wintermeyer, W. (1999) Thiostrepton inhibits the turnover but not the GTPase of elongation factor G on the ribosome. Proc. Natl. Acad. Sc. i USA 96: 9586−9590.
Заполнить форму текущей работой

Сессия? Спокойно!