Актуальность темы
Проблема гаметофитного апомиксиса у покрытосеменных по-прежнему приковывает к себе пристальное внимание. Более того, в последнее время интерес к ней значительно возрос. Но даже использование самых современных методов исследования* пока не вносит ясности в решение большинства вопросов, связанных с этой проблемой. Гипотетичными остаются, например, представления о характере генетического контроля апомиксиса, хотя определенный прогресс в этом направлении очевиден (Koltunow, Grossnikiaus, 2003; Bicknell, Koltunow, 2004; Kantama et al., 2007).
Известно, что на протяжении онтогенеза у большинства изученных видовфастений происходит полиплоидизация соматических клеток в органах и тканях в процессе их дифференциации путём политении, эндомитоза и анеуплоидии. Но в клетках апикальных меристем видовое число? хромосом сохраняется неизменным, что и обеспечивает генетическую стабильность вида (Кунах, 2005; Гриф -2007). Исключение преимущественно составляют гибридные иполиплоидные растения, у которых кариотипическая изменчивость, как правило, затрагивает не только дифференцирующиеся соматические клетки, но* иклетки апикальных меристем (Кунах, 2005). При этом спонтанная гибридизация^ и полиплоидия — явления, значительно распространенные среди высших растений (Otto, Whitton, 2000). Более того, признано, что эволюция* цветковых осуществляется в значительной степени именно с участием этих механизмов (Цвелёв, 2000; Гриф, 2007; Grant, 1981; Masterson, 1994; Soltis, Soltis, 1999; Bennett, 2004;). При этом, с одной стороны, и амфи-, и автополиплоидия растений в природе осуществляется преимущественно с участием либо гаметофитного апомиксиса, либо апомейоза, как элемента апомиксиса, ведущего к формированию нередуцированных гамет (Кашин, 2006; Bretagnolle, Tompson, 1995; Roche et al., 2001), a с другой, — фактически все апомикты являются, полиплоидами, причём преимущественноаллополиплоидами. (Grant, 1981). Как следствие, у них широко распространён кариотипический полиморфизм.
Однако^ несмотря на то, что кариотипическая нестабильность апомиктов ¦ давно известна, масштабы её, особенно у автономных' апомиктов, остаются* недостаточно изученными. Для автономных апомиктов, ранее не: проводилось, специальных исследований по выявлению характера кариотипической нестабильностив апикальных меристемах: Остаётся неясным № то-. насколько стабильным по уровню плоидности у автономных, апомиктовшвляется микрогаметофит:.Очевидно, что исследованияшодобногол рода могут быть в дальнейшем базой: для молекулярно-генетического изучения природыгаметофитногоапомиксиса.
Цель исследования. Выявление особенностей!: микроспорогенеза и характера кариотипической изменчивости при гаметофитном апомиксисе у растений некоторых автономных факультативных апомиктов ^/егасеае. Для достижения цели решались следующие задачи: выявить половую структуру цветков, в популяциях Pilosella officinarum B. Schultz et Sch. Bip:-:
Iфоследить особенности формирования клеток таиетума в пыльниках Р: officinarumизучить особенности!, микроспорогенеза автономного апомикта P. officinarwn.
— выявить, характер изменчивости уровня плоидности растений популяцийшекоторых автономных, апомиктов Asteraceaeисследовать особенности проявления анеуплоидии в клетках апикальных меристем растений? автономных апомиктов Asteraceaeустановить частоту миксоплоидии в апикальных меристемах растений автономных апомиктов Asteraceae:
Научная новизна. Впервые на примере растений вида Р. о^гс'тагит показано, что микрогаметофит автономных апомиктов может быть стабильным по уровню плоидности, оставаясь равным 1х независимо от уровня плоидности растений. Установлено, что у исследованных автономных апомиктов Аз1егасеае даже в потомстве одного материнского растения с высокой частотой встречаются особи разных уровней плоидности. Впервые выявлена геномная нестабильность в клетках апикальных меристем данных видов, выражающаяся в анеуи миксоплоидии. При этом обнаружено, что частота анеуи миксоплоидов в апикальных меристемах изученных апомиктов столь высока, что есть все основания' говорить* о ней как о характерной, свойственной автономным апомиктам особенности генезиса клеток их апикальных меристем.
Научно-практическая значимость, работы. Полученные данные могут быть использованы для сравнительного анализа при изучении других апомиктичных видов. Изложенные в диссертационной работе сведения будут полезны при разработке спецкурсов" по цитогенетике, репродуктивной биологии, эмбриологии растений. Результаты исследования' характера кариотипической-изменчивости в клетках апикальных меристем апомиктов могут быть в дальнейшем базой для молекулярно-генетического изучения природы гаметофитного апомиксиса и особенностей регуляции клеточного цикла в апикальных меристемах апомиктов.
Связь работы с научными программами, темами. Работа выполнялась в рамках проектов РФФИ№ 00−04−49 376, 05−04−49 001, 08−04−319.
Апробация работы. Результаты исследований были доложены на науч. генетической конф., посвящ. 100-летию со дня рождения А. Р. Жебрака (Москва, 2002) — Междунар. конф. «Интродукция растений. Охрана и обогащение биологического разнообразия» (Воронеж, 2002) — II науч. конф. МОГИС, посвящ. 115-летию со дня рождения Н. И. Вавилова, (Москва, 2003) — Междунар. совещ. по филогении растений (Москва, 2003) — III съезде ВОГиС.
Москва, 2004) — Междунар. конф. «Вопросы общей ботаники: традиции и перспективы» (Казань, 2006) — IV Междунар. науч. конф. «Факторы экспериментальной эволюции организмов» (Алушта, Украина, 2008) — V Междунар. науч. конф. «Геном растений» (Одесса, Украина, 2008) — Междунар. конф. «Генетика и биотехнология XXI века: Фундаментальные и прикладные аспекты» (Минск, Белоруссия^ 2008) — III Междунар. школе молодых ученых «Эмбриологиягенетика и биотехнология» (Саратов, 2009) — XII Московском, совещ. по филогении растений, посвящ>. 250-летию со дня рождения Георга-Франца Гофмана (Москва, 2010) — Всеросс. науч. конф., посвящ. 100-летию со дня" рождения С. С. Хохлова (Саратов, 2010) — Междунар. конф. «Биология? развития: морфогенез репродуктивных структур и роль-стволовых клеток^ в онтогенезе и эволюции» (Санкт-Петербург, 2010).
Публикации. По теме диссертации" опубликовано 19 работ, пять из, которых — в журналах, рекомендованных Перечнем ВАК РФ:
Декларация личного участия автора. Автор лично в 2002 — 2007 гг. провёл экспедиционные исследования по сбору материала. Цитологическийи цитогенетический анализы материала полностью' осуществлены автором. Анализ шолученных результатов проведён автором самостоятельно по плану, согласованному с научным руководителем. Доля личного участия автора в подготовке и написании совместных публикаций составляет 30 — 50%.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырёх глав, заключения, выводов и списка литературы. Общий объем работы 161 страница, содержит 25 таблиц, 8 рисунков.
Список литературы
включает 386 источников, в том числе 247 на иностранных языках.
выводы.
1. В популяциях автономного апомикта РИойеИа о/Дстагит обнаружены растения 2-х типов: 1) с гермафродитными цветками, несущими пестик и 5 пыльников- 2) с женскими цветками, содержащими вместо пыльников стаминодии. Доля растений с женскими цветками в-разные годы варьировала в интервале 41.17 — 100%.
2. В популяциях Р. о? Астагит в отношении уровня плоидности микрогаметофит является относительно стабильным элементом системы семен-ного размножения. Он имеет уровень плоидности, близкий или равный 1х.
3. Наблюдающиеся в микроспорогенезе нарушения и формирование стерильной пыльцы у автономного апомикта Р. о/Астагит не связаны с функционированием тапетума. Развитие клеток тапетума происходит обычным для Аз1егасеае путём.
4. Вразличные годы наблюдений материнских растений, исследованных апомиктов Аз1егасеае и их потомства, полученного в условиях различных режимов цветения, имела место существенная изменчивость < как спектра' уровней плоидности растений, так и долей растений каждого уровня плоидности.
5. В потомстве индивидуальныхрастений, особенно у апоспоровых апомиктов рода РИозеНа, даже при цветении в условиях беспыльцевого режима уровень плоидности зачастую был на 1х-3х выше или ниже уровня плоидности материнских растений: А в потомстве, полученном при свободном цветении или при цветении в условиях изоляции некастрированных цветков, превышение уровня плоидности потомков над уровнем плоидности материнских растений в том числе и у Р. о/Астагит зачастую было больше, чем на 1х.
6. При изучении цитогенетических особенностей генезиса клеток апикальных меристем обнаружена высокая частота анеуи миксоплоидов у растений исследованных автономных апомиктов Asteraceae (до 60% от числа исследованных растений или их потомков). Это указывает на не спонтанное, а регулярное, закономерное их возникновение.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
.
В обеих исследованных популяциях Р. о? рстагит в разные годы встречались растения: 1) с гермафродитными цветками- 2) с женскими цветками, содержащими вместо пыльников 5 стаминодиев. У растений с гермафродитными цветками наблюдали значительные нарушения процессов микроспо’рогенеза. Характер нарушений мейоза почти полностью, совпадал у изученных растений, но частота нарушений значительно варьировала как между растениямитак и в разных цветках одного растения. У всех изученных растений часть клеток на разных стадиях микроспорогенеза дегенерировала, что вело к, формированию стерильных пыльцевых зёрен (до 50−60%).
Процессы, ведущие к образованию стерильных пыльцевых зёрен у Р. о/Астагат связаны, восновном, с нарушениями микротрубочкового аппарата вматеринских клетках микроспор, скорее1 всегокак вторичного эффекта нарушения конъюгации в профазе I. Большой процент стерильной пыльцы при нормально формирующемся тапетупе указывает на то, что причинамик стерильности являются" именно отклонения* в нормальном течении мейоза игаметофитогенеза, вызванные несбалансированностью генома, а не нарушениями питающей функции, клеток тапетума.
В исследуемом материале' очень редко* встречались явления, которые могли бы"привести к существенному варьированию уровня1 плоидности среди изредка формирующихся фертильных пыльцевых зёрен. Многочисленные отставания хромосом в ана-телофазе первого и второго деленийвероятнее всего, приводили к образованию анеуплоидии по нескольким* хромосомам, результатом чего является формирование нежизнеспособных пыльцевых зёрен. Участие илинеучастие гаплоидных пыльцевых зёренв оплодотворении редуцированных или нередуцированных зародышевых мешков у Р. аЦгстагит должно приводить к возникновению1 зародышей с уровнем плоидности, равном материнскому, а также на 1х выше или ниже такового.
В исследованных популяциях P. officinarum, в отношении кариотипической изменчивости микрогаметофит является относительно стабильным элементом. Он несёт гаплоидный набор хромосом и формируется только у растений" с диплоидной спорогенной тканью через мейоз. Большое число аномалий микроспорогенеза и микрогаметофитогенеза указывает на то, что даже такие растения имеют несбалансированный геном и высокий процент анеуплоидов. Нормальное течение мейоза у них затруднено. При оплодотворении такой пыльцой уровень плоидности у потомков по отношению к родительским растениям мог увеличиваться лишь на 1х.
При подсчетечисла хромосом в апикальных меристемах одних и тех же растений популяций P. officinarum было выявлено «значительное варьирование уровня, плоидности (2х—1х)не только на внутрипопуляционном уровне, но и в потомстве индивидуальных растений, полученном при. разных режимах цветения (свободном опылении, при цветении в условиях беспыльцевого режима и при цветении в условиях изоляции* некастрированных цветков). До 50 — 70% потомства имело уровень» плоидности" ниже или выше уровня плоидности< материнских растений! Существенной была доля, растений, потомство которых было представлено растениями нескольких уровней плоидности. Во" многом сходная картина кариотипической изменчивости у растений, вегетирующих в популяциях, и. в их семенном потомстве обнаружена и-у растений популяций остальных исследованных апомиктов.
У растений, вегетирующих в популяциях ряда видов Asteraceae, и в, их потомстве, обнаружено, что для растений, как апоспоровых (различные виды Pilosella), так и диплоспоровых (виды Taraxacum, Hieracium и Chondrilla) автономных апомиктов, в значительной мере свойственна ещё и анеу-, и миксоплоидия. Степень распространения анеуи миксоплоидов столь высока до 30 — 60% от числа исследованных растений или их потомков), что нет оснований говорить о спонтанном, нерегулярном их возникновении.
В* исследуемых популяциях отмечены многочисленные случаи, когда уровень плоидности потомков по отношению к вегетирующим в популяциях растениям возрастал более чем на 1х. Это могло происходить только-за. счёт изменения уровня плоидности в соматических клетках меристем или их производных — апоспоровых инициалях, так как даже при" формировании нередуцированных зародышевых мешков и их оплодотворении гаплоидной пыльцой уровень плоидности потомков1 должен возрастать по отношению к уровню плоидности материнского растения лишь на- 1х. На то, что изменчивость-уровня-плоидности именно в" соматических клетках меристем растений в значительной степени свойственна исследованным, апомиктам, указывают и полученные данные по высокой частоте встречаемости у них в апикальных меристемах миксоплоидии.
Увеличение плоидности клеток, анеуи миксоплоидия у высших растений в онтогенезе — обычное явление, но оно, как правило, не затрагивает стволовые клетки апикальных меристем, а реализуется лишь в процессе дифференциации! клеток: Как следует, из, вышеизложенного, в* случае автономных апомиктов А^егасеае обычным** явлением становится изменение уровня плоидностианеуи миксоплоидия, в клетках апикальных меристем? приналичии, в* пределах одного апекса клеток до 3−4 разных уровней плоидности, зачастую" ещё и с числом хромосом, некратным основному числу. Всё это в комплексе говорит о закономерном сопровождении гаметофитного апомиксиса явлениями анеуи миксоплоидии и о геномной нестабильностиапомиктов, проявляющейся* на уровне соматических клеток меристем.
Ранее нестабильность генома и изменение уровней плоидности растений у факультативных апомиктов. в ряду поколений связывали исключительно с поведением хромосом в мейозе при микрои мегаспорогенезе (Ра§ егНпс1, 1944, ЯиизЬаиБег, 1967) и с альтернативностью.
124 выбора различныхпутейреализации на двух ключевых этапах процесса семенного воспроизводства (эуспория — апомейоз, зиготия — апозиготия) (Д'Амато, 1990; Кашин, 2006; >^1ег, 1984) — Явление миксоплоидии, обнаруживаемое в клетках апикальных меристем впартеногенетических потомствах растений объяснялось феноменом геномных «онтоили эпимутаций», приводящим к спонтанному возникновению полиплоидных клеток среди диплоидныхклеток меристем растений! Этот: феномен должен завершаться быстрой": диплоидизацией популяции клеток апикальной меристемы с возвратом растений на прежний уровень плоидности (Малецкий, Малецкая, 1996; Малецкий, Колодяжная, 1999).
Результаты нашихисследований указывают на то, что геномная изменчивость в клетках апикальных меристем у апомиктов не являетсярезультатом случайных эпимутацийа есть следствие характерной для таких форм нестабильности генома? в этихклетках на всех стадиях онтогенеза растений: Эта нестабильность генома в меристематических клетках растенийапомиктичных видов на всех стадиях их онтогенезавероятноявляется, следствием/гибридношищолиплоиднойщрироды гаметофитньгх апомиктов: В1 пользу этого говорит, с одной? стороны- - то, что все они являются полиплоидамиш зачастую полиплоидамигибри до генной природы, а, с другой стороныто, что преимущественно лишь у гибридных или полиплоидных растений геномная: изменчивость затрагивает не только дифференцирующиеся соматические клетки, но и апикальные, меристемы.
