Особенности регуляции биосинтеза полигидроксибутирата у Methylobacterium extorquens

Полигидроксибутират (Iii Б) — широко распространенный среди бактерий биополимер, выполняющий функции запасания углерода и энергии, резервирования полифосфата и кальция (Anderson and Dawes, 1990; Steinbuchel, 1991, 1995).

Будучи близок по свойствам химически синтезированным полимерными материалам, ПГБ отличается от них биосовместимостью и биоразлагаемостью. Это открывает широкие перспективы применения ПГБ в медицине, сельском хозяйстве и быту (Holmes, 1985, Anderson and Dawes, 1990, Page, 1995). В последнее десятилетие идет активный поиск различных продуцентов ПГБ, в том числе среди аэробных метилотрофных бактерий. Для создания эффективного биотехнологического процесса получения ПГБ из метанола необходимо детальное знание структурно-функциональной организации и регуляции его биосинтеза, которая у аэробных метилобактерий исследована в меньшей степени, чем у гетеротрофных продуцентов.

К началу нашей работы метаболические аспекты биосинтеза ПГБ у метилобактерий изучались только у Methylobacteriwn rhodesianwn, реализующего сериновый путь ассимиляции метанола. Было показано, что синтез ПГБ осуществляется трехи/или пятистадийным путем при участии ß—кетотиолазы, НАД (Ф)Н-ацетоацетил-КоА редуктазы, D (-) и L (+) -гидроксибутирил-КоА дегидратаз и ПГБ-синтазы (Ackermann and Babel, 1989; Mothes and Babel, 1995; Mothes et al., 1997). Поскольку центральным продуктом сери нового пути является ацетил-КоА, за который конкурируют инициирующие ферменты цитратного цикла (цитратсинтаза) и синтеза ПГБ (ß—кетотиолаза), подразумевалось, что у метилобактерий должен существовать механизм, координирующий работу этих метаболических участков. Тем не менее о свойствах и регуляции ферментов цитратного цикла и синтеза ПГБ у М. rhodesianwn имелись весьма фрагментарные сведения. Предполагалось также, что НАДФт-изоцитратдегидрогеназа и Н АД-форм и атд е г и д ро г еназа обеспечивают биосинтез ПГБ восстановительными эквивалентами (Mothes and Babel, 1995, Yamane, 1990), однако соответствующие экспериментальные доказательства отсутствовали.

Ранее в нашей лаборатории был выделен перспективный метилотрофный продуцент с сериновым путем Methylobacterium extorquens, способный накапливать до 80% ПГБ, (Trotsenko et al., 1993). Представлялось логичным и актуальным провести исследование метаболической организации и регуляции у данного продуцента для выявления степени сходства и (ли) возможных отличий от М. rhodesianwn.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было получить более полное представление о принципах организации и регуляции биосинтеза ПГБ у серинового мети-лотрофа М. extorquens. Для достижения указанной цели были поставлены следующие конкретные задачи:

— определить основные метаболические изменения у М. extorquens во время биосинтеза.

ПГБ;

— очистить и изучить свойства ключевых ферментов синтеза Iii Б (ацетоацетил-КоА редуктазы) и цитратного цикла (цитратсинтазы и изоцитратдегидрогеназы);

— исследовать зависимость накопления ill Б от внутриклеточных уровней аденини пиридиннуклеотидов;

— выявить возможные источники восстановительных эквивалентов для синтеза ПГБ.

Научная новизна. Впервые у продуцента ПГБ с сериновым путем ассимиляции метанола показано, что биосинтез ПГБ сопровождается определенными метаболическими перестройками, благоприятствующими включению ацетил-КоА в цепь биосинтетических реакций и выражающимися в увеличении активностей ферментов биосинтеза полимера и некоторых ферментов ЦТК, уменьшением уровней ферментов прямого окисления метанола и понижением внутриклеточной концентрации АТФ.

Установлено, что в биосинтезе ПГБ у М. extorquen* не участвуют D (-) и L (+)-3-гидроксибутирил-КоА дегидратазы, что указывает на трехстадийный путь синтеза ПГБ.

Впервые экспериментально показано, что НАДФ+ - изоцитратдегидрогеназа может формировать пул НАДФН для биосинтеза полимера, тогда как роль формиатдегидрогеназы в этом процессе маловероятна.

Впервые очищены и подробно охарактеризованы ПАДФН-ацетоацетил-КоА редуктаза, цитратсинтаза и НАДФ±изоцитратдегидрогеназа M. extorquens.

Сравнение экспериментальных и литературных данных свидетельствует о существенных различиях в организации и регуляции биосинтеза ПГБ у M. extorquens и таксо-номически близкого метилотрофа M. rhodesianum. Предложена схема координированного контроля ЦТК и биосинтеза ПГБ у M. extorquens.

Практическая ценность. Полученные результаты позволяют глубже понять особенности биосинтеза ПГБ у M. extorquens, что дает возможность усовершенствовать биотехнологию получения полимера с использованием данного продуцента. Сравнение свойств ферментов и принципов регуляции метаболизма M. extorquens и M. rhodesianum свидетельствует о разнообразии регуляторных механизмов у таксономически близких метило-трофов и создает научную основу для разработки биотехнологического процесса биосинтеза ПГБ.

Апробация работы. Материалы данной работы были представлены на международных и отечественных конференциях и симпозиумах: 8tn International Symposium «Microbiological Growth on Ci Compounds», 1995, San Diego- «Биосинтез и биодеградация микробных биополимеров», 1995, Пущино- «Автотрофные микроорганизмы», 1996, Москвагородская конференция молодых ученых, 1996, ПущиноInternational Symposium on Bacterial Polyhydroxyalkanoates, 1996, Davos, Российский биохимический съезд, 1997, Москва. Материалы диссертации оформлены в виде 3 научных статей и 6 тезисов.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1,1 Продуценты ПГБ.

ПГБ был впервые обнаружен в 1927 году Лемойном и позднее описан как важный бактериальный продукт, принимающий участие в спорулядии Bacillus spp (Lemoigne, 1927, цитируется по Anderson and Dawes, 1990). К настоящему времени известно около 100 видов бактерий, синтезирующих ПГБ как запасное вещество. (Steinbuchel, 1991). Синтез и накопление полимера у бактерий происходит в ответ на несбалансированные условия роста, вызванные недостатком важных питательных веществ: азота, фосфора, калия и некоторых других, и одновременно при избытке углеродного субстрата (Anderson and Dawes, 1990, Steinbuchel, 1991). У азотфиксирующей бактерии Azoiohacler hejermkui синтез полимера индуцируется недостатком кислорода (Senior et al., 1972). Некоторые бактерии в определенных условиях способны накапливать полимер во время экспоненциального роста и не нуждаются для этого в индуцирующих условиях. К ним принадлежат Alcali genes latus (Hrabak, 1992), M. rhodesianum при росте на фруктозе (Mothes et al., 1998).

Большинство работ по биосинтезу ПГБ опубликованных за последние 10=15 лет выполнены на Alcaiigenes eutrophus, мутант которого использует глюкозу и накапливает до 80% ПГБ (Holmes, 1985). Созданные научные основы позволили компании ICI создать промышленную технологию производства к получения ПГБ.

Получение рекомбинантных микроорганизмов открывает дополнительные перспективы в поиске новых продуцентов. Новое генетическое окружение, отсутствие обычных механизмов контроля может дать неожиданные преимущества, Гены синтеза ПГБ клонированы в растениях, прои эукариотических клетках (Poirier et al, 1992, Schubert et al, 1988; Slater et al, 1988; Williams et al., 1996; Leaf et al., 1996; Hahn et al, 1997). Большое количество работ посвящено экспрессии генов метаболического пути синтеза ПГБ A. eutrophus в Escherichia coli. Получены рекомбинанты, способные накапливать полимер на минеральных средах, на комплексных средах без Сахаров, регулирующие экспрессию генов в зависимости от температуры (Wang and Lee, 1997, Kalousek and Lubitz, 1995, Kidwell et al., 1995). У большинства подобных организмов продуктивность образования ПГБ невелика, хотя у рекомбинантного штамма Е. coli, не способного к образованию жгутиков, продуктивность ПГБ достигает 3,4 г л" 1 ч" 1 (Wang and Lee, 1997).

Большая группа аэробных бактерий, растущих на метане и метаноле, способны к индуцированному синтезу ПГБ (Говорухина и Троценко, 1989; Bourque et al., 1992; Zhao, et al., 1993). Эти бактерии ассимилируют С,-соединения одним из трех биосинтетических путей: сериновым, рибулозобисфосфатным (РБФ) и рибулозомонофосфатным (РМФ). Мегилотрофы с РМФ-путем почти не синтезируют ПГБ, а в основном — эк юполисахари-ды. Известные на сегодняшний день металотрофные продуценты ПГБ с сериновым путем принадлежат к группе розовоокрашенных факультативных метилотрофов (род Methylo-bacierium), Paracoccus denitrificans и Paracoccus panthotrophus, которые ассимилируют метанол РБФ-путем, также синтезируют и накапливают ПГБ. Таким образом, существует до конца не известный биохимически обоснованный механизм корреляции между путями Сассимиляции и типом накапливаемого запасного вещества (Babel, 1992). Однако недавно появилось сообщение о том, что мутант M. -rhodesianum, не способный синтезировать повышенные количества ПГБ, продуцирует экзополисахариды в условиях лимита по азоту. Это свойство мутанта полностью отсутствует у родительского штамма (Breuer et al., 1995), что, по мнению авторов, связано с перенаправлением энергии, прежде запасавшейся в ПГБ, на синтез углеводов.

Несмотря на преобладающее внимание к гетеротрофным продуцентам ПГБ, метанотрофы и метилобактерии имеют высокий биотехнологический потенциал. Большая группа продуцентов принадлежит к метанотрофам П типа. Теоретически содержание ПГБ у метанотрофов II типа с сериновым путем может превышать 67% (Asenijo and Suk, 1986). У Methylosinus trichosporium было достигнуто содержание полимера 20−25%, хотя у другого серинового метанотрофа Methylocystisparvus максимальное содержание ПГБ составило 68% (Scott et al., 1981). В условиях периодического культивирования сериновые метилобактерии способны накапливать высокомолекулярный (до 1300−1800 кДа ПГБ (Suzuki et al., 1986) с высоким выходом — ОД9−0,2 т г" 11, содержание полимера при этом достигало в среднем 25−35% (Bourque et al, 1992, 1995). В оптимизированных условиях содержание ПГБ может составить 40−45% (Bourque et al., 1995) и даже 50−55% (Kim et al., 1996). При непрерывном культивировании наивысшая продуктивность 0,64 г л'-ч1 получена для Hyphomicrobiian zavarznit subsp. chengdueme, а содержание ПГБ варьировало от 40 до 59% (Zhao et al, 1993). Некоторые штаммы Mextorquens в колбах накапливали до 80% ПГБ (Trotsenko et al., 1993). При ilvpii О JX йЧС око м культивировании с контролируемым соотношением С/М M. extorquais sp. K накапливал ПГБ до 60% с выходом 0,2 г г" 1. Получение рекомбинантных метилотрофов позволило в 2,5 раза увеличить содержание полимера у Mycoplana rubra (Follner et al., 1995).

1 Примечание: единицы измерения выхода ПГБ даны в г ПГБ на г потребленного метанола.

Бактерии с РБФ-путем накапливают несколько меньшие количества полимера, чем сериновые метилобактерии. При использовании метода импульсного введения ацетата в непрерывную культуру P. panthotrophus содержание ПГБ составило 36% (van Aalst-van Leeuwen et al., 1997). Содержание сополимера (полигидроксибутирата-валерата) при добавлении к метанолу «-амилового спирта у Par. denitrificans достигало 58%, а выход повышался до 0,968 г г» 1 (Ueda et ai., 1992).

Образование ацетил-КоА, предшественника мономеров для синтеза ПГБ, из метанола через сериновый путь не требует притока энергии. Однако для восстановления ацетоацетил-КоА в гидроксибутирил-КоА необходимы восстановительные эквиваленты, которые у сериновых метилобактерий образуются благодаря окислению дополнительного количества метанола. Одним из способов оптимизации синтеза ПГБ является использование смесей субстратов, при этом один из них служит источником углерода, а другой расходуется на получение энергии. Теоретически около 80% углерода пар г л ю ко э а/ацетат или ацетат/метанол может превратиться в ПГБ при использовании мутантных штаммов сериновых метилобактерий (Babel, 1992). .2 Метаболические пути синтеза ПГБ.

Синтез ПГБ происходит в результате конденсации двух молекул ацетил-КоА в ацетоацетил-КоА, последующего восстановления в гидроксибутирил-КоА и его полимеризации. По характеру и последовательности ферментативных реакций синтез ПГБ напоминает синтез жирных кислот с некоторыми исключениями:

— интермедиа&tradeсинтеза ПГБ находятся в виде КоА-производных, а не ацил-иереносящего белка (Ritchi and Dawes, 1969);

— синтез ПГБ протекает стереоспецифично: в полимер включается только D (-)3-гидроксибутират (Merrick and Doudoroff, 1961), в ряде случаев в синтез ПГБ специфичен к НАДФН (Fukui et al, 1987):

— ферменты синтеза ПГБ, по-видимому, не объединены в комплекс, как синтаза жирных кислот (Anderson and Dawes, 1990);

31 рС?1КЦИЯ ПОЛЙМСрИЗ^ЦИИ ПрОИСХСДИТ На ГраШЩС поверхностного СЛОЯ ГраНуЛ ПГБ. отделяющего водонерастворимый полимер от цитоплазмы (Page, 1995).

У большинства исследованных микроорганизмов синтез ПГБ происходит трехста-дийно из ацетил-КоА, благодаря действию трех ферментов: ацетил-КоА:ацетил-КоА С-ацетилтрансферазы (ß—кетотиолазыНФ 2.3Л.9), ацетоацетил-КоА редуктазы гидрокеибутирил-КоА дегидрогеназыНФ 1.1.1.36) и поли (З-гидроксибутират) синтазы (номер не определен):

КоА НАДФН t i.

2ацетил-КоА —Ацетоацетил-КоА «3-гидроксибутирил-КоА-> ПГБ+КоА.

НАДФ+.

Ацетоацетил-КоА редуктаза существует в двух изоформах, специфичных к НАДФН или НАДН. Соответственно, продукт реакции (3-гидроксибутирил-КоА) имеет либо D (-), либо L (+) стереоконформацию. Полагают, что в синтезе ПГБ участвует НАДФН-зависимая 0(-)-3-гидроксибутирил-КоА оксидоредуктаза (Haywood et al., 1988b). В случае, если в синтезе ПГБ участвует L (+) редуктаза, две еноил-КоА дегидратазы катализируют превращение L (+)-3-гидроксибутирил-КоА через кротонил-КоА до D (-)-стереоизомера, который полимеризуется в ПГБ. Этот пятиэтапный синтез ПГБ был впервые изучен у Rhodospirilhim rubrum (Moskowits and Merrick, 1969). Высокая активность еноил-КоА дегидратаз обнаружена у сериновой метилобактерии М. rhodesianum (Motiles and Babel, 1995).

1.3 Метаболизм ПГБ.

Метаболизм ПГБ — циклический процесс (Senior and Dawes, 1973), распад полимера происходит благодаря действию деполимеразы, 3-гидроксибутират дегидрогеназы (НФ 1.1.1.30) и ацетоацетат: сукцинат КоА трансферазы (НФ 2.8.3.5). Цикл замыкается на ацетоацетил-КоА, который в реакции тиолиза, катализируемой В-кетотиолазой, превращается в ацетил-КоА. У флоккулирующей бактерии Zoogloea ramigera ацетоацетат, образовавшийся при деградации полимера, этерифицируется с КоА ацетоацетил-КоА синтетазой (Tomita et al., 1983).

При периодическом культивировании A. eutrophus в отсутствии азота деградация полимера происходит одновременно с его синтезом. Это показано в следующих экспериментах. При добавлении валерата культуре, накопившей 50−55% ПГБ, постепенно увеличивалась доля валерата в сополимере. И наоборот, при добавлении бутирата культуре, содержащей сополимер, доля валерата уменьшалась. По-видимому, в данных условиях достигалось равновесие распада и биосинтеза, так как общее содержание полимера в обоих случаях почти не изменялось (Doi et al, 1990). Напротив, когда A. eutrophus выращивали в лимитированных по азоту проточных условиях, распад ПГБ не происходил (Haywood et al, 1989).