Современным направлением для создания экологически безопасных комплексных биопрепаратов с ростостимулирующей и фунгицидной активностью, является разработка в биотехнологии методов культивирования изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах (in vitro). Во многом продуктивность культивируемых клеток значительно превышает продуктивность растений для выделения биологически активных веществ ценных для медицины, сельского хозяйства, пищевой промышленности. Кроме того, получение веществ вторичного биотехнологического синтеза из каллуса создает возможность использования растений, не произрастающих в данных природных условиях и технология биопрепаратов осуществима в течение всего года. Существующие при этом проблемы связаны с целенаправленным выбором растительных объектов, оптимизацией всех стадии технологического процесса получения из них биологически активных препаратов, стабильно сохраняющих активность. В связи этим актуальным представляется разработка биотехнологии препаратов из растительного сырья, с максимальным содержанием комплекса биологически активных веществ, обеспечивающих высокую эффективность при биологическом методе защиты растений.
Цель работы: Целью работы являлось решение научных проблем по разработке безотходной технологии получения биологически активных.
— т. ." «¦ препаратов растительного происхождения на основе методов культивирования тканей in vitro, а также проведение исследований по применению биопрепаратов с фунгицидной активностью в полевых условиях при возделывании озимой пшеницы.
В задачи исследований входило: провести исследование фунгицидной активности экстрактов следующих лекарственных растений: маклеи сердцевидной (Macleaya cor data (willd) R.Br.), магнолии крупноцветковой {Magnolia grandiflora L.), барбариса обыкновенного (Berberis vulgaris L.), горчицы сарептской (Sinapis juncea L.) и каллусной культуры маклеи сердцевидной (Macleaya cordata (willd) R.Br.), полученной in vitroразработать технологию получения комплексных препаратов растительного происхождения с фунгицидными свойствами, оптимизировать стадии технологииразработать технологию получения каллусной культуры и растения маклеи сердцевидной in vitroисследовать биологическую активность и химический состав препаратов, изучить их стабильность при хранениипровести полевые исследования по применению препаратов в условиях Ставрополькой краевой государственной сортоиспытательной станции Грачевского района Ставропольского краярассчитать экономическую эффективность получения каллусной культуры и растения маклеи сердцевидной. рассчитать экономическую эффективность использования полученных биопрепаратов в технологии возделывания озимой пшеницы сорта Скифянка;
Научная новизна. Впервые разработана технология получения каллусной культуры маклеи сердцевидной in vitro. Оптимизированный состав каллусогенной среды Мурасиге и Скуга содержит аскорбиновую кислоту в концентрации 1 мг/л, 6-бензиламинопурин в концентрации 0,5 мг/л, 2,4-Д — 2 мг/л, кинетин 0,2 мг/л и гидролизат казеина 10 мг/л. Рассчитаны константы скорости каллусообразования, величины которых в зависимости от питательных сред составляют 0,02−0,03.
Разработана безотходная технология получения препаратов с фунгицидными свойствами из каллусной культуры маклеи сердцевидной, а также из надземной части барбариса обыкновенного, горчицы сарептской и магнолии крупноцветковой, продолжительность которой составила 283 339 час с выходом 99 л из 10 кг растительного сырья при оптической плотности препаратов при Д400/440, 0,65−0,96 единиц.
Впервые разработана технология культивирования макле^ сердцевидной in vitro, включающая 11 этапов: стерилизацию исходного матеиала, посадку его на питательную среду, пассаж каллусной культуры, получение морфогенного каллуса и побегов, высадку растений в рулоны и далее укоренившихся растений в почву. Урожайность надземной массы первого года вегетации составила 2,8 т/га воздушно-сухой массы.
Проведена стандартизация полученных из лекарственных растений биологически активных препаратов по физико-химическим свойствамоптическая плотность, значение рН, установлена стерильность препаратов, а также сохранение стабильного высокого уровня антифунгальных свойств в течение 1 года.
Установлена антифунгальная и ростостимулирующая активность препарата на основе каллусной культуры маклеи сердцевидной. Разработанные препараты из барбариса обыкновенного, горчицы сарептской и магнолии крупноцветковой проявляют антифунгальную активность.
Практическая значимость. На основании полученных результатов предложена технология получения каллусной культуры и растения маклеи сердцевидной in vitro, позволяющая выращивать растения в разных климатических зонах круглогодично.
Препараты растительного происхождения после лабораторных исследований прошли проверку на опытных делянках Ставрополькой краевой государственной сортоиспытательной станции Грачевского района Ставропольского края в 2000;2002 годах. Разработанные биологически активные препараты применялись при обработке посевов озимой пшеницы в период вегетации. Полученные данные показали, что обработка биологическими препаратами проводит к увеличению урожайности на 9−14%, также происходит улучшение качественных показателей зерна и снижение пораженности озимой пшеницы мучнистой росой на 35−53%, септориозом на 12−27% и бурой ржавчиной на 22−44%.
Установлена энергетическая эффективность применения комплексных препаратов в технологии возделывания озимой пшеницы. Коэффициент составил 2,37 по сравнению с контролем 2,15.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на конференциях Ставропольской государственной сельскохозяйственной академии в 1999, 2000, 2001, 2002 годах, на региональных конференциях (Краснодар, 1998, 2000; Сочи- 2001), на Всероссийской конференции по биотехнологии «Роль биотехнологии в экологизации природной среды, питания и здоровья человека» (Ставрополь, 2001), на Всероссийской конференции (Санкт-Петербург, 2002), на международной конференции «Современные наукоемкие технологии» (Сочи, 2002), на Всероссийской конференции «Достижения современной биотехнологии» (Ставрополь, 2002), на международной конференции по экологии и эволюции почв (Ставрополь, 2002).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит 44 таблицы, 18 рисунков, 2 приложения. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 4 глав, выводов, рекомендаций производству, списка литературы, включающего 159 источников, в том числе 39 зарубежных.
Выводы.
1. Проведены исследования по получению каллусной культуры маклеи сердцевидной на модифицированной питательной среде Мурасиге и Скуга, дополнительно содержащей аскорбиновую кислоту в концентрации 1 мг/л, 2,4-Д в концентрации 2,0 мг/л, 6-бензиламинопурин — 0,5 мг/л, кинетин — 0,2 мг/л, а также гидролизат казеина — 10 мг/л. Образование каллуса наблюдалось на 12−15 сутки после посадки стерильных эксплантов на питательную среду с массой 650−700 мг.
2. Получены данные по изучению динамики роста каллусной культуры маклеи сердцевидной при посадке на питательную среду листовых и черешковых эксплантов, и при этом константы скорости каллусооб-разования имеют значения 2−3×10″. В латентной фазе, продолжительностью 12−13 дней, увеличение массы клеток не наблюдалось. Логарифмическая фаза характеризовалась малым увеличением массы каллус на 100−150 мг, а интенсивный рост клеток наблюдался в линейной фазе, продолжительностью 8−10 дней с увеличением массы каллуса на 400−420 мг. Мито-тический индекс для процесса каллусообразования маклеи сердцевидной составил 0,14°/0о.
3. Цитологические исследования каллусной культуры маклеи сердцевидной показали, что клетки имеют неправильную сферическую полигональную форму с размером клетки 15−30 мкм. В клетках наблюдалась развитая система вакуолей, отмечено близкое расположение ядер к клеточным мембранам. Оводненность клеток составила 95,5%.
4. Разработана технология получения биопрепаратов из каллуса маклеи сердцевидной, а также из надземной части растений магнолии крупноцветковой, горчицы сарептской и барбариса обыкновенного, включающая стадии измельчения растительного сырья, получения экстракта, очистку методом сорбции и термоденатурации, стерилизующую фильтрацию, розлив и фасовку. Выход биопрепарата из каллусной ткани составляет 99,7% со стабильным сохранением биологической активности в течение 1 года.
5. Установлена фунгицидная активность биопрепарата из каллуса маклеи сердцевидной, проявляющаяся в значительном снижении зараженности грибной патогенной микрофлорой семян озимой пшеницы, а также ростостимулирующий эффект. Энергия прорастания повышается по сравнению с контролем на 9%, лабораторная всхожесть — на 13%.
6. Разработана биотехнология культивирования растения маклеи сердцевидной in vitro, включающая этапы стерилизации эксплантов Ткани, посадку на питательную среду, пассаж каллуса на регенерационную среду, микрочеренкование и высадку растений в рулоны и затем в почву. Исследования показали, что наилучший рост морфогенной ткани происходит на безгормональной среде Potato II. В процессе культивирования отмечен органогенез — образование отдельных органов, с последующей регенерацией из них целого растения, включая и ризогенез. Урожайность надземной массы растений первого года вегетации составила 2,8 т/га воздушно-сухой.
1 ассы.
7. Применение препаратов в технологии возделывания озимой пшеницы сорта Скифянка, способствует снижению пораженности озимой пшеницы грибными болезнями и обеспечивает повышение урожайности на 12,5−15,3%, прибавка составляет 5,9−7,0 ц/га. Установлено, что применение препаратов обеспечивает улучшение качества экологически безопасной зерновой продукции.
8. Выявлена экономическая и энергетическая эффективность разработанных биопрепаратов при обработке озимой пшеницы сорта Скифянка в фазе трубкования. Уровень рентабельности при возделывании озимой пшеницы с применением биопрепаратов увеличился в 1,7 раз. Установлено повышение коэффициент энергетической эффективности на 0,26.
Рекомендации производству.
1. При размножении маклеи сердцевидной in vitro в качестве эксплантов необходимо использовать молодые листья и черешки растений. На этапе введения в культуру рекомендуется использовать модифицированные среды Мурасиге и Скуга, содержащие 2,4-Д, кинетин, аскорбиновую кислоту, 6-бензиламцнопурин. Укоренение растений рекомендуется производить в рулонах, заполненных торфом. Высадку растений производить в 1 -2 декаде мая.
2. При возделывании озимой пшеницы сорта Скифянка рекомендуется проводить опрыскивание посевов в период вегетации 10% препаратом на основе каллусной культуры маклеи сердцевидной и комплексным препаратом, полученным при смешивании растительного сырья маклеи сердцевидной, магнолии крупноцветковой, горчицы сарепткой, барбариса обыкновенного и каллусной культуры маклеи сердцевидной.
