Исследование состояния системы Ca2+-обмена в клетках крови облученных сельскохозяйственных животных

Актуальность проблемы. Испытания ядерного оружия на Семипалатинском полигоне, аварийные ситуации на предприятиях атомно-промышленного комплекса, авария на Чернобыльской АЭС привели к радиоактивному загрязнению ряда регионов Российской федерации [1]. Сельскохозяйственные животные, в этой ситуации, подвергаются как внешнему, так и внутреннему облучению, главным образом, в небольших дозах [3]. Оценка их физиологического состояния, традиционно, проводится на основании комплекса клинико-гематологических и цитогенетических показателей, которые в ряде случаев не способны эффективно выявить патологические нарушения в организме. В то же время, действие ионизирующей радиации на биологические системы определяется сложным комплексом структурных и функциональных изменений на молекулярно-клеточном уровне. Лучевое повреждение внутриклеточных систем проявляется в деградации ДНК, нарушении белкового обмена, ферментативной активности, проницаемости биологических мембран и т. д. [38, 45, 94]. При этом, развитие «скрытых» повреждений, в первую очередь, связано с модификацией процессов регуляции внутриклеточного метаболизма. Поэтому представляет интерес исследование биологического действия ионизирующих излучений на молекулярно-клегочные показатели сельскохозяйственных животных и поиск эффективных методов их оценки.

Физиологическая активность большинства клеток в организме млекопитающих контролируется универсальными механизмами регуляции клеточного метаболизма («системами внутриклеточной сигнализации»), к которым относятся системы циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), внутриклеточного Са2±гомеостаза, обмена фосфотидилинозитолов, Ка^НГ^-обмена и др. [18, 95, 103, 135, 139, 151]. Среди них особый интерес для прикладной и фундаментальной радиобиологии представляет система поддержания внутриклеточной концентрации ионов Са2+. Показано, что кальций в ионизированной форме является универсальным внутриклеточным регулятором, и, в то же время, при различных повреждениях организма он может выступать в качестве цитотокси-ческого агента [107, 154].

В настоящее время разработаны различные методические подходы, позволяющие корректно оценить состояние системы поддержания Са2±гомеостаза в клетках организма лабораторных животных и человека [62, 153]. Получены данные о модификации системы Са2±обмена в результате воздействия широкого спектра повреждающих факторов физической и химической природы, а также при развитии ряда заболеваний [101, 102, 120, 125]. В то же время, информация об исследовании показателей системы Са2±обмена в клетках облученных сельскохозяйственных животных практически отсутствует.

В связи с этим представляет большой научный и практический интерес.

21 разработка методов определения основных параметров системы Саобмена в клетках крови сельскохозяйственных животных и оценка этих показателей при действии ионизирующего излучения.

Цель и задачи исследования

Основной целью настоящей работы являлось исследование состояния системы Са2±обмена в клетках крови интактных и облученных сельскохозяйственных животных.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи: гу |.

— Разработать метод определения показателей системы Саобмена в эритроцитах и нейтрофилах периферической крови овец и коров.

— Изучить состояние параметров системы Са2±обмена в клетках крови овец при внешнем тотальном у-облучении.

— Оценить показатели системы Са2±обмена в эритроцитах и нейтрофилах овец при действии пролонгированного облучения в малых дозах.

— Исследовать проницаемость плазматической мембраны эритроцитов для Са2+ в клетках крови коров в хозяйствах с радиоактивным загрязнением территории после аварии на ЧАЭС.

Научная новизна. Разработан метод оценки состояния системы Са2±обмена в эритроцитах и нейтрофилах коров и овец. Определены начальная скорость накопления и скорость входа 45Са, а также концентрация катиона в клетках. Показано, что проницаемость мембран клеток интактных жвачных животных для Са2+ ниже, чем у других млекопитающих (лабораторных животные, человек).

Установлено, что внешнее у-облучение овец в дозах от 30,9 до 154,8 мКл/кг приводит к фазовым изменениям показателей системы Саобмена в радиочувствительных и радиорезистентных клетках крови. Увеличение проницаемости плазматической мембраны и концентрации ионизированного Са в цитоплазме эритроцитов и нейтрофилов обнаруживаются уже с первых суток после облучения организма.

Отмечено изменение проницаемости плазматических мембран клеток для Са2+ при пролонгированном облучении овец в дозах 2,58 и 12,9 мКл/кг.

Выявлены различия в ответной реакции клеток периферической крови овец при действии острого и пролонгированного у-облучения.

Установлено, что у сельскохозяйственных животных при длительном содержании на загрязненных радионуклидами территориях формируются «скрытые» внутриклеточные нарушения, которые проявляются в увеличении проницаемости плазматической мембраны эритроцитов для Са2+.

Теоретическая и практическая значимость. В работе решена важная для сельскохозяйственной радиобиологии научная проблема, связанная с изучением основных параметров системы Са2±обмена в клетках крови продуктивных животных, которые характеризуют степень ее нарушения при остром и хроническом облучении в широком диапазоне доз.

Определены основные параметры модификации системы Са2±обмена при остром (30,9−154,8 мКл/кг) и пролонгированном (2,58, 12,9 мКл/кг) облучении. Установлена зависимость, в ранние сроки наблюдений, изменений показателей Са2±обмена от дозы острого внешнего у-облучения животных.

Г I.

Показатели системы Саобмена могут быть использованы для исследования физиологического состояния продуктивных животных при ведении животноводства на радиоактивно загрязненных территориях.

Разработанные методы могут быть рекомендованы для оценки воздействия различных физических и химических факторов на организм сельскохозяйственных животных, как в научных исследованиях, так и учебных программах биологических ВУЗов.

Основные положения, выносимые на защиту:

Л I.

• Система Саобмена в клетках крови овец и коров, по сравнению с лабораторными животными и человеком, характеризуется низкими величинами проницаемости мембран для Са2+.

• Внешнее у-облучение овец в дозах 30,9−154,8 мКл/кг приводит к фазовому изменению функционирования системы поддержания внугриклегу I п, | точного Сагомеостаза в клетках крови. Нарушение внутриклеточного Сагомеостаза при облучении животных обусловлено увеличением проницаемости плазматической мембраны для ионов Са2+.

• Пролонгированное у-облучение овец в дозах 2,581 и 12,9 мКл/кг характеризуется изменением Са2±обмена как в радиочувствительных клетках (нейтрофилы), так и в радиорезистентных (эритроциты).

• Длительное содержание сельскохозяйственных животных на радиоактивно загрязненных территориях приводит к изменению проницаемости плазматических мембран для Са2+ в клетках крови в и формированию «скрытых» внутриклеточных нарушений.

Апробация диссертации. Основные положения диссертационной работы доложены на межлабораторном научном семинаре ВНИИСХРАЭ 27 июня 2000 г. и представлены в материалах Н-го и Ш-го Всесоюзного Радиобиологического съезда (1993 г., 1997 г.), П-Обнинского симпозиума по радиоэкологии (1996 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ в журналах «Сельскохозяйственная биология», «Радиационная биология. Радиоэкология», «Доклады ВАСХНИЛ», «Доклады РАН», «Физическая медицина» и 11 тезисов в материалах научных конференций и симпозиумов в 1993;2000 гг.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения и списка литературы. Работа изложена на 103 машинописных страницах, иллюстрирована 11 таблицами и 12 рисунками.

Список литературы

содержит 159 источников.

выводы.

1. Разработан метод определения основных показателей системы Са2±обмена (начальная скорость накопления, скорость входа и концентрация ионизированного Са2+) в клетках крови сельскохозяйственных животных, позволяю.

Л | щий корректно оценить изменение состояния внутриклеточного Саобмена в норме и при облучении организма.

2. Установлены различия в проницаемости цитоплазматических мембран клеток крови жвачных сельскохозяйственных и лабораторных животных для Са2+. Проницаемость мембран эритроцитов овец и коров для Са2+ была ниже по сравнению с величиной этого показателя в эритроцитах лабораторных животных и человека.

3. Облучение овец в дозах 30,96−154,8 мКл/кг инициировало фазовое изменение показателей системы Са2±обмена в эритроцитах и нейтрофилах, которое выражалось в нарушении внутриклеточного Са2±гомеостаза в латентный период (1−5-е сутки) и в период разгара (10−15-е сут) острой лучевой болезни. При этом облучение овец в летальной дозе сопровождалось достоверным увеличением проницаемости мембран клеток для Са2+ и последующим накоплением ионов Са2+ в цитоплазме практически во все сроки наблюдений.

4. Пролонгированное облучение овец в дозах 2,58 и 12,9 мКл/кг приводило к.

Л I изменению Саобмена в эритроцитах и нейтрофилах. В эритроцитах, характеризующихся большей радиорезистентностью, чем нейтрофилы не наблюдалось изменений проницаемости плазматической мембраны в ранние сроки после облучения. Тогда как в радиочувствительных клетках (нейтрофилы) происходило снижение скорости входа 45Са. Одновременно и в нейтрофилах, и в эритроцитах овец отмечали значительное увеличение показателей Са2±обмена через 5−10 суток после облучения.

5. Длительное нахождение сельскохозяйственных животных на территориях, загрязненных радионуклидами вследствие аварии на Чернобыльской АЭС, приводило к модификации системы Са2±обмена в эритроцитах периферической крови. Инкубация эритроцитов в гипертонической среде выявила.

21 скрытые" повреждения проницаемости мембран эритроцитов для Са. 6. Выявленные в экспериментальных исследованиях с острым и хроническим облучением изменения внутриклеточного Са2±обмена коррелируют с физиологическим состоянием сельскохозяйственных животных и отражают степень развития радиационных процессов в организме. Это может быть использовано для эффективной оценки степени воздействия как ионизирующих излучений, так и нерадиационных факторов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Модификация внутриклеточного метаболизма, при действии различных эффекторов, осуществляется при участии мембраносвязанной системы Са2±обмена [65, 137]. Регуляторные функции этой системы определяются изменением концентрации ионизированного Са2+ в клетке [154]. В то же время при различных патологических состояниях организма отмечается нарушение внутриклеточного Са2±обмена, которое приводит к цитотоксическому накоплению катионов в цитоплазме. Необратимое повышение внутриклеточной концентрации ионизированного Са оказывает повреждающее действие на клеточные структуры и, в конце концов, инициирует процесс гибели клетки [107].

В свою очередь, лучевое повреждение организма характеризуется процессами интенсивной клеточной гибели в радиочувствительных органах и различными нарушениями метаболических реакций не только в радиочувствительных, но и относительно радиорезистентных клетках [36, 38, 45−47, 49, 77, 78]. При этом плазматическая мембрана, наряду с ДНК, рассматривается в качестве основной мишени действия ионизирующего излучения [46, 48, 68, 73, 128]. Следует отметить, что основные компоненты системы внутриклеточного Са2±обмена локализованы в мембранных структурах клетки [65, 101, 145]. Поэтому повреждения возникающие в мембранах при облучении [19, 68, 73, 77] могут приводить к модификации системы Са2±обмена в клетках, изменять ее регуляторные функции и, вследствие этого, нарушать внутриклеточный метаболизм. В связи с этим представляло интерес изучение показателей системы Са2±обмена в эритроцитах и нейтрофилах сельскохозяйственных животных при остром и хроническом облучении в широком интервале доз.

Результаты собственных исследований, полученные на основе разработанных нами методик, показали, что у сельскохозяйственных животных нару-21 шается Сагомеостаз в клетках периферической крови как в модельных экспериментах с внешним тотальным и пролонгированным у-облучением в больших и малых дозах, так и при действии хронического облучения на радиоактивно загрязненных территориях.

Радиационно-индуцированная модификация внутриклеточного Саобмена выявлялась как в радиочувствительных нейтрофилах, так и относительно радиорезистентных эритроцитах и была наиболее выражена в течение 15−20 сут после облучения в летальных и сублетальных дозах. Наблюдаемая закономерность носила фазовый характер с максимальными величинами изменения исследованных показателей системы Са2±обмена на 1−3 и 10−15 сут. Более того, концентрация ионизированного Са2+ в цитоплазме и скорость входа 45Са в эритроцитах овец, облученных в дозах свыше 30,96 мКл/кг, возрастали в первые сутки после воздействия и эти изменения линейно зависели от дозы облучения. В эти же сроки отмечали аналогичные изменения проницаемости мембраны для Са2+ в более радиочувствительных, по сравнению с эритроцитами, нейтрофилах периферической крови жвачных животных.

Нарушение Са2±гомеостаза в клетках крови овец облученных в интервале доз от 30,96 до 154,8 мКл/кг сопровождалось гибелью животных в процессе развития лучевой болезни различной степени тяжести. В то же время развитие феномена клеточной гибели зависит от степени необратимости модификации внутриклеточного Са2±гомеостаза которая, как известно, определяется эффективностью Са2±транспортирующих систем, обеспечивающих удаление ионов у |.

Са из цитоплазмы [20, 124]. Показано, что при облучении клеток в дозах до 7 Гр отсутствует заметное повреждение Са2±транспортирующих АТФ-аз [29, 30, 33]. Исходя из этого можно предположить, что наблюдаемое нами увеличение проницаемости мембран в эритроцитах и нейтрофилах облученных животных приводит к значительному повышению концентрации ионизированного Са2+ в цитоплазме, которое вероятно, инициирует развитие процесса гибели клеток.

Известно что, основными пулами внутриклеточного накопления Са2+ являются цитоплазма, эндоплазматический ретикулум и митохондрии [59, 100, 106]. При избыточном поступлении ионов Са2+ через каналы поврежденной мембраны, заметное увеличение Са2+ наблюдается главным образом в цитоплазме и митохондриях [67, 121, 127]. При этом повышение концентрации ионизированного Са2+ в цитоплазме активирует Са2±транспортирующие АТФазы и носит обратимый характер, а накопление Са2+ в митохондриях вызывает прямое повреждение этих органелл [97, 106, 110]. В эритроцитах млекопитающих.

2-f отсутствуют внутриклеточные органеллы и внутриклеточный Сагомеостаз обеспечивается низкой проницаемостью мембраны для Са2+ и функционированием Ca2±Mg2±АТФазы [142, 146]. Напротив, в радиочувствительных ней-трофилах присутствуют основные внутриклеточные органеллы: митоходрии, эндоплазматический ретикулум и др. [127, 147]. Поэтому можно предположить,.

А I что Саперегрузка митохондрий определяет гибель таких радиочувствительных клеток, как нейтрофилы.

В то же время, повышенная проницаемость мембраны клеток для Са2+ при остром облучении в дозах свыше 30,96 мКл/кг определяется ее прямым повреждением, зависит от дозы и сохраняется в течение нескольких суток после облучения организма (раздел 3.2.). Вместе с тем одним из критериев выживаемости клеток в начальный период после облучения организма является их способность к удалению избыточных количеств Са2+, поступающего через поврежденную плазматическую мембрану [82]. Процесс удаления Са из клеток является АТФ зависимым [25, 26]. В то же время известно, что в первые 7 суток облучения животных в летальных дозах отмечается резкое снижение внутриклеточного уровня АТФ, особенно в радиочувствительных органах и клетках [66]. Следовательно, именно в таких клетках, к которым относятся и нейтрофилы, могут реализоваться условия накопления «цитотоксических» количеств Са2+, запускающих механизмы Са2±зависимой клеточной гибели [124], а в радиорезистентных эритроцитах привести к существенным нарушениям внутриклеточного метаболизма.

Эти факты не противоречат общепринятым представлениям о ведущей роли повреждений ДНК в процессе гибели радиочувствительных клеток в облученном организме. Установлено, что репарация радиационных разрывов ДНК является метаболически зависимым процессом. Так, репарация одноните-вых разрывов ДНК угнетается при снижении температуры, добавке ЭДТА, разобщении окислительного фосфорилирования 2,4-динитрофенолом и в анокси-ческих условиях, но не обнаруживает зависимости от синтеза РНК, ДНК и белка [31]. В свою очередь, биосинтез ДНК и РНК относится к числу наиболее радиочувствительных процессов в клетке [117]. Аналогично, метаболически зависимым является и процесс восстановления внутриклеточного Са2±гомеостаза в облученных клетках, хотя временные характеристики процессов повреждения и репарации существенно разнятся для ДНК и мембран, как мишеней действия ионизирующих излучений на клетки. В самом деле, увеличение проницаемости мембраны (в частности и для Са2+) становится выраженным к концу первых суток после облучения организма, когда репарация разрывов ДНК для выживших клеток фактически завершена [111, 155, 159]. В первые часы после облучения организма (период активной репарации ДНК) отсутствует заметное истощение макроэргических соединений в клетках и вполне вероятно, что даже при нарушении проницаемости мембраны сохраняется энергетическая обеспеченность для поддержания внутриклеточного Са2±гомеостаза. В более поздний период, за счет нарушения Са2±гомеостаза в облученных клетках создаются условия для реализации механизма цитотоксического дейст.

П I вия ионов Са и ситуация дополнительно усугубляется процессом уменьшения внутриклеточного пула АТФ в облученном организме [68].

Наблюдаемая нами вторая фаза нарушения Са2±гомеостаза при внешнем тотальном у-облучении в дозах 30,96−154,8 мКл/кг может являться причиной отдаленных цитотоксических эффектов. Так, активация Са2±зависимых ферментов деградации после первичного повышения концентрации ионизирован-2+ ного Са в цитоплазме облученных клеток может инициировать вторичное повреждение мембраны и внутриклеточных органелп. Характерно, что в этот период изменения проницаемости мембраны клеток для Са2+ не зависят от дозы облучения организма, тогда как в первые сутки после облучения такая зависимость носит линейный характер.

Изменение Са2±гомеостаза при пролонгированном облучении животных в малых дозах (2,58 и 12,9 мКл/кг) характеризовалось отсутствием увеличения пассивной проницаемости плазматической мембраны эритроцитов для Са2+ и ее снижением в нейтрофилах в ранние сроки после воздействия. Напротив, увеличение как начальной скорости накопления, так и скорости входа 45Са в обоих типах клеток происходило через 5−10 суток после облучения и не сопровождалось развитием процесса клеточной гибели (разд. 3.1, 3.3). Наблюдаемая модификация показателей Са2±обмена сопровождается в эти сроки изменениями характерными для адаптационного синдрома [6]. Также показана сравнимая чувствительность иммунной системы животных к стрессу и облучению[75].

Можно предположить, что в отличие от действия больших доз радиации при пролонгированном воздействии низкой интенсивности возрастает роль мол «дификации регуляторных функций системы Саобмена на внутриклеточный метаболизм. При этом увеличивается опосредованное влияние на систему Саобмена вторичных эффекторов, образующихся в организме при облучении [91]. Это предположение подтверждают данные об ингибирующем действии плазмы крови облученных крыс на Са2±АТФазу выделенных тимоцитов [28].

В то же время, длительное увеличение концентрации внутриклеточного ионизированного Са2+, характерное при облучении в больших дозах и приводящее к гибели клеток, отсутствует в случае малых доз воздействия. Наблюдаемые нами пролонгированные изменения проницаемости плазматической мем.

Гу I браны для Са в эритроцитах и нейтрофилах запускают иной механизм продолжительной активации внутриклеточного метаболизма. В этом случае, увеличение концентрации ионизированного Са2+ в локальном примембранном пространстве, а не в цитозоле, возникающее в результате возрастания входа катионов через Са2±селективные каналы, активирует ассоциированную с мембраной протеинкиназу С, которая, фосфорилирует ряд метаболически активных белков-ферментов [65, 137]. При этом фаза увеличения концентрации цитоу | зольного Са кратковременна и приводит к перемещению протеинкиназы С из цитозоля в плазматическую мембрану. Поэтому, при действии малых доз хронического облучения изменение проницаемости мембраны для Са2+ в активно метаболизирующих клетках, таких как нейтрофилы, может инициировать фазу продолжительного фосфорилирования цитозольного протеинкиназного комплекса и существенно изменить течение внутриклеточных реакций [137].

Действительно, модификация Са2±обмена, обнаруженная нами в эритроцитах и нейтрофилах облученных овец, сопровождается значительными изменениями внутриклеточного метаболизма [71]. Так, активность ферментов у облученных животных максимально возрастает на 7−10 сутки. Отмечается увеличение содержания в нейтрофилах липидов и суммарного уровня катионных белков. В эритроцитах происходит снижение мембранного потенциала уже через 3−6 часов и сохраняется в течение длительного срока наблюдений. Изменяются потоки ионов калия из эритроцитов, с последующим восстановлением в более поздние сроки.

Следовательно, облучение в малых дозах приводит к модификации сис.

А I темы Саобмена как в относительно радиорезистентных эритроцитах, так и в более радиочувствительных нейтрофилах. Возрастает значение опосредованных факторов модификации системы Са2±обмена, а так же роль изменений ее функционирования на уровне регуляции внутриклеточного метаболизма. При этом наблюдаемое увеличение пассивной проницаемости мембраны для Са через 5−15 суток после облучения сопровождается целым рядом функциональных изменений и может быть пусковым механизмом внутриклеточных нарушений в клетках крови животных.

Исследование проницаемости плазматической мембраны эритроцитов для Са2+ у коров, длительно содержащихся на радиоактивно загрязненных территориях, продемонстрировало восстановление основных параметров системы поддержания Са2±гомеостаза уже через 5 лет после аварии на ЧАЭС. Но, с другой стороны, изменения проницаемости плазматической мембраны эритроцитов для Са2+ у животных, представляющих второе поколение коров после аварии на ЧАЭС, приобрели скрытый характер. При этом, чем выше была плотность загрязнения территории, тем более значимы были повреждения клеточных мембран.

Причиной обнаруженных мембранных дефектов в эритроцитах могут быть определенные изменения в структуре генома клеток-предшественников костномозгового кроветворения, которые формируются в отдаленный период после облучения в малых дозах [86, 88]. Подтверждением этого является тот факт, что скрытые патологические изменения проницаемости плазматической мембраны для ионов Са24 у животных из загрязненных хозяйств Брянской области прослеживаются и у потомства (5−7 поколение) КРС подвергнутого радиационному воздействию во время испытаний ядерного оружия на Семипалатинском полигоне [52]. Кроме того, при обследовании людей, представляющих первое-второе поколение жителей проживающих на загрязненных, в результате испытаний ядерного оружия, территориях Алтайского края — получены аналогичные результаты [88]. Сравнительный анализ прироста скорости входа 45Са в эритроциты коров из загрязненных районов Брянской области и Алтайского края свидетельствует о том, что с течением времени у животных происходит формирование стойких и более значимых патологических изменений в мембранах. При этом наблюдается усиление эффекта с возрастанием суммарной дозы облучения родителей в первом поколении.

Во многих исследованиях показана ключевая роль нарушения концентра/у I ции внутриклеточного Са в патогенезе различных болезней, включая сердечно-сосудистые патологии [109, 120, 133, 140], нарушение гормонального статуса, миопатии [82, 125], а также дегенеративные изменения в иммунной системе [ 8, 11]. Поэтому обнаруженное нами нарушение проницаемости клеточных мембран для Са при воздействии ионизирующего излучения можно рассматривать в качестве дополнительного фактора риска развития различных патологий, как на клеточном, органном, так и на уровне целостного организма.

Таким образом, подводя итог проведенным экспериментальным исследованиям и опираясь на литературные данные можно заключить, что летальные дозы облучения организма овец инициировали необратимые нарушения в системе поддержания Са2±гомеостаза как в радиорезистентных эритроцитах, так и в относительно радиочувствительных нейтрофилах Эти нарушения проявлялись в увеличении проницаемости плазматической мембраны для Са и достил I жении цитотоксической концентрации ионизированного Са в цитоплазме.

Степень радиочувствительности клеток, очевидно связана с возможностями системы Са2±обмена удалять цитотоксические количества Са2+ из цитоплазмы. 1.

Саперегрузка митохондрий и истощение пула АТФ — определяли более раннюю гибель активно метаболизирующих клеток, что подтверждается клини-ко-гематологическими данными.

Снижение дозы облучения приводило к развитию неспецифических изменений системы Са2±обмена. При этом возрастала роль нарушения регулятор-ных функций ионизированного Са2+ для внутриклеточного метаболизма. Малые дозы облучения инициировали пролонгированную модификацию проницаемости плазматической мембраны для Са2+, увеличивая концентрацию Са2+ в при-мембранном пространстве и через протеинкиназу С создавали условия для развития устойчивых изменений во внутриклеточных процессах.

Эти изменения у обследованных сельскохозяйственных животных при длительном содержании на загрязненных радионуклидами территориях, по нашему мнению, приводили к формированию «скрытых» патологических изменений в проницаемости плазматической мембраны эритроцитов для Са2+ и сохранялись в ряду поколений.