Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии и автоматического метода Эдмана при исследовании первичной стуктуры фактора элонгации EF-G

Установление первичной структуры белков является неотъемлемой частью изучения физико-химических основ их функционирования. Особый интерес для исследования представляют функционально важные белковые комплексы (мембранные рецепторы, компоненты биоэнергетических систем, компоненты белок-синтезирующих систем и т. д.). Другим актуальным направлением исследований является выделение белковых компонент иммунных систем организма, установление их первичной структуры и разработка методов иммуно-диагностики ранних форм раковых заболеваний. Кроме того, частичное выяснение структуры белков крайне необходимо при выведении их первичной структуры по последовательности нукяеотидов в гене.

Применение традиционных, крупномасштабных многостадийных методов разделения белков и смесей пептидов и установление их аминокислотных последовательностей затруднено из-за труднодоступ-ности белкового материала. Поэтому требуется создание необходимых методов и приемов работы, которые позволили бы проводить структурные исследования на ультрамшфоуровне.

Наиболее перспективным подходом для установления первичной структуры белков является создание комплекса методов, который включает одно-, двухстадийное выделение пептидов — продуктов расщепления исходной молекулы белка химическими или энзиматическими методамиавтоматическую деградацию полученных пептидов на микроуровне в газофазном, жидкофазном и в твердофазном вариантах в и, наконец, высокочуствительное детектирование отщепленных производных аминокислот.

Для изучения физико-химических основ функционирования факторов элонгации (EP-G из E. cold, EP-2 из клеток эукариот в лаборатории химии белка Института белка АН СССР проводятся исследования их первичной структуры. Данная диссертационная работа является частью исследований по определению полной первичной структуры фактора элонгации ef-g.

Целью настоящей работы явилась разработка методических приемов, позволяющих проводить разделение пептидных смесей в одну-две стадии и открывающих возможность установления первичной структуры на микроуровне, в частности, разработка общих схем разделения пептидов бромцианового расщепления и триптических пептидов среднего размера (10−30 аминокислотных остатков) высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ), а также методов избирательного связывания пептидов с полимерным носителем и установление н-концевых последовательностей аминокислот связанных пептидов автоматическим методом.

Другой задачей явилось усовершенствование секвенаторов для повышения эффективности проведения автоматической деградации по Эдману.

В результате цроделанной работы разработана схема разделения бромциановых и триптических пептидов методом ВЭЖХ, выделены бромциановые пептиды фрагмента и ряд пептидов из триптическо-го гидролизата фактора элонгации ef-g, одного из крупнейших белковых компонентов системы трансляции e.coli. Автоматическим методом Эдмана установлены и-концевые аминокислотные последовательности в пептидах, выделенных методом ВЭЖХ. Методом избирательного связывания выделен ряд пептидов фактора элонгации ef-g и установлена их аминокислотная последовательность.

Путем реконструкции жидкостного и твердофазного секвенаторов повышена надежность и чувствительность определения аминокислотных последовательностей. Разработанные методы и приемы позволили получить значительную информацию при реконструкции полной аминокислотной последовательности молекулы фактора элонгации ef-g.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

В последнее время опубликовано несколько прекрасных обзоров (1−10), посвященных различным цроблемам разделения биологически активных соединений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

В настоящем обзоре литературы рассмотрены наиболее общие свойства носителей и подвижных фаз для высокоэффективной хроматографии, и практическое применение этого метода дом разделения микроколичеств пептидов и белков.

I. Классификация хроматограджческих методов.

Основные положения теории хроматографии.

Любое хроматографическое разделение возможно, когда подвижная фаза вместе с которой перемещается разделяемое вещество, может быть газообразной или жидкой. В случае, если подвижная фаза газ, метод носит название газоадсорбционной хроматографии, если же подвижная фаза жидкость, то это жидкостная хроматография. Жидкостную хроматографию можно классифицировать по способу разделения на несколько видов: адсорбционную, ионообменную (II), ситовую (или гель-проникающую) (12) и обратнофазную (13).

Для цростых соединений, разделяющихся при прохождении через колонку, цроисходит взаимодействие как со стационарной, так и с подвижной фазами (14). Степень удерживания вещества в неподвижной и подвижной фазах может быть охарактеризована коэффициентом распределения К'. Отношение двух коэффициентов при постоянных внешних условиях является мерой селективности (<*) разделительной колонки.

Разрешение двух компонент характеризуется величиной ®, определяемое расстоянием между максимумами двух пиков, выраженным как разность времен удержания и среднеарифметической шириной обоих пиков у основания. Коэффициент разрешения математически связан с другими параметрами хроматографического разделения, в результате получается одно из важнейших уравнений хроматографии: где ж — число эффективных теоретических тарелок, определяемое как t I2 n = 16 [£т.

Знание числа эффективных теоретических тарелок для одного типа носителя позволяет провести сравнение разделяющей способности двух или нескольких колонок.

Наиболее подробно общая теория жидкостной хроматографии, и в частности, высокоэффективной хроматографии, изложена в ряде обзоров (15,16).

I.I. Оптимальные условия ^оматогда^ического разделения.

Оптимальными условиями разделения считаются такие условия, при которых удается добиться максимального разрешения при наименьшей затрате времени. Для данного типа носителя свойства разделительной колонки, а, следовательно, и оптимальные условия разделения, зависят как от способа заполнения колонки, так и от диаметра используемых частиц (17).

Влияние температуры на условия и время разделения сказывается только косвенно (18), так как с увеличением температуры снижается вязкость элюента, что приводит к увеличению скорости элю-ента при постоянном давлении. Значения коэффициентов диффузии с увеличением температуры также возрастают, что приводит к сужению зон разделяемого вещества. Кроме того, температура влияет на кинетику и термодинамику удерживания вещества.

Характерной особенностью высокоэффективной хроматографии является специфическое требование, предъявляемое к стационарным носителям, так как для достижения максимально возможного числа теоретических тарелок необходимы носители с малым диаметром частиц, оказывающих значительное сопротивление потоку элюента. В силу этого, стационарные фазы для ВЭЖХ должны быть устойчивы к действию давления.

П. Гель-шзоникаюшая хроматогоайия.

Теоретически, гель-проникающая хроматография наиболее простейший и предсказуемый хроматографический метод. Поскольку пористые тела характеризуются удельной поверхностью, объемом и диаметром пор, то хроматографичеокое разделение макромолекул на таких носителях происходит за счет распределения молекул меаду подвижной и стационарной жидкостью, т. е. большие молекулы элюирутотся раньше, чем малые (12). Теория хроматографического процесса разделения подробно изложена в ряде книг и обзорных статьях (12,18, 19).

П. 1. Стащона]эные$азы для высокоэффективной гель-проникающей эдроматох^афии.

Для высокоэффективной жидкостной хроматографии необходимы фазы с твердой матрицей, преимущество которых заключено в том, что они не набухают, легче заполняются колонки с большим числом теоретических тарелок, обеспечивая при этом высокую проницаемость носителя независимо от давления. Разделение на таких фазах возможно с любым видом элюента. Перечисленные свойства значительно увеличивают возможности высокоэффективной гель-проникающей хроматографии.

В настоящее время выпускается два класса носителей для гель-хроматографии:

— неорганические, поверхностно-модифицированные носители- -органические носители с жесткой матрицей;

В последнее десятилетие были развиты методы получения жестких матриц с контролируемым размером пор на основе еиликагеля и пористого стекла. Описан метод (20) приготовления пористого стекла с размером пор от 40 до нескольких тысяч ангстрем. Аглютинацией субмикронных частиц еиликагеля получен другой пористый носитель (Zorbax) (21), с диаметром пор от 60 до 3000 А.

Эмульсионной полимеризацией полиэтоксисилана получен крупноо пористый силикагель с диаметром пор 300 А, размер которых может о быть увеличен до 3000 А кальцинированием (22).

Прямое использование неорганических носителей для гель-проникающей хроматографии не всегда возможно, так как отрицательно заряженные силанольные группы поверхности носителя либо адсорбируют катионные образцы, либо отталкивают анионные (23). Использование подвижной фазы с высокой концентрацией соли лишь частично устраняет эту проблему. Поэтому, для подавления активных группировок носителя, используют модификацию активных центров низкомолекулярными органосиланами.

выводы.

1. Разработана общая схема разделения пептидов бромцианового расщепления и триптических пептидов среднего размера методом обратнофазной хроматографии. Выделены бромциановые пептиды фрагмента Т-5 и ряд пептидов трипсического гидролиза EF-Gфактора, модифицированного по остаткам лизина.

2. Автоматическим методом Эдмана определены и-концевые аминокислотные последовательности пептидов, выделенных обратнофазной хроматографией.

3. Разработаны методы избирательного выделения С-концевых гомосеринсодержащих пептидов из смеси. Определены последовательности 80 аминокислотных остатков в этих пептидах на твердофазном секвенаторе.

4. Разработан метод блокирования первичных аминогрупп пептидов, образующихся в результате неспецифического расщепления белка по связям Asp-Pro и автоматическим методом Эдмана определена последовательность 73 аминокислотных остатков в пептидах с N-концевым пролином. Установлены перекрытия бромциановых пептидов cbg-13, cbg-14, cbg-15 2 Двух фрагментов, т-4 и т-5 из ограниченного трип-синолиза ef-g.

5. Проведена реконструкция ряда систем жидкофазного секвенатора, позволившая сократить количество исследуемого пептидного материала при автоматическом методе Эдмана и увеличить надежность и чувствительность работы секвенатора. В результате чувствительность метода повышена в пять раз.

Я приношу свою искреннюю благодарность моему научному руководителю Юлию Борисовичу Алахову за поддержку и внимание к моей работе, за критические замечания, за помощь в выборе направления исследований.

Всем сотрудникам лаборатории химии белка, оказавшим поддержку в выполнении данной работы.