Исследование сезонных изменений в микросомальной фракции, обогащенной Na, K-АТФазой, из почек сусликов Spermophilus undulatus

VI. выводы.

1. Проведен сравнительный анализ микросомальных препаратов, обогащенных Ка, К-АТФазой, из почек активных и спящих сусликов.

2. Активность ИаД-АТФазы при гибернации снижается в 1,8−2,0 раза в диапазоне температур от 15 до 37 °C. При более низких температурах различия менее выражены.

3. В препаратах присутствует только а1-изоформа каталитической субъединицы Ыа, К-АТФазы, содержание которой при гибернации уменьшается на 25%. Чувствительность фермента к уабаину во время спячки не изменяется.

4. Не выявлено глутатионилирования а-субъединицы №, К-АТФазы и сезонного изменения уровня ее фосфорилирования.

5. Содержание холестерина в препаратах увеличивается при гибернации в 1,9 раза. Содержание белка, степень ненасыщенности жирных кислот липидов и структурное состояние липидной фазы мембран во время спячки не изменяются.

6. При гибернации ИаД-АТФаза в мембранах находится в более агрегированном состоянии.

V.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Изложенные в настоящей работе результаты оригинальных исследований позволяют сделать несколько заключений и ряд предположений. При попытке разобраться в противоречивых данных литературы по сезонным изменениям активности №, К-АТФазы из почек зимоспящих животных [Fang, Willis, 1974; Charnock, Simonson, 1978; Bennis et al., 1995; McDonald, Storey, 1999] установлено на примере фермента из наружной медуллы почек сусликов, что при гибернации активность Ка, К-АТФазы (при 37°С) падает почти в 2 раза (р<0,1).

Сезонное снижение активности Ыа, К-АТФазы из почек сусликов не связано с фосфорилированием или глутатионилированием молекул этого фермента и не является следствием изменения свойств и структуры мембран, несмотря на почти двукратное увеличение при гибернации содержания холестерина в микросомах, который, по-видимому, находится в рафтах [Simons, Ikonen, 1997]. Согласно полученным данным, основными причинами сезонного снижения активности натриевого насоса из почек сусликов является его более агрегированное состояние во время зимней спячки наряду с некоторым уменьшением содержания фермента в микросомах.

Иммунохимическое окрашивание а-субъединицы №, К-АТФазы (наиболее доступный и прямой метод сравнительной оценки количества фермента в препаратах) показало, что в микросомальных фракциях из почек сусликов содержание натриевого насоса уменьшается лишь на 25%. Полученный результат не согласуется с данными работ, авторы которых объясняли более чем двукратное падение при гибернации активности Na, K-ATOa3bi (при 37°С) из почек зимоспящих животных именно пропорциональным снижением содержания фермента в препаратах [Charnock, Simonson, 1978; Bennis et al., 1995]. К такому выводу исследователи пришли, установив, что отношение количества связавшегося [3Н]уабаина к активности №, К-АТФазы для препаратов из почек активных и спящих животных достоверно не различается. Однако нужно отметить, что в этих работах не применялись каналообразователи или детергенты, необходимые для обеспечения проницаемости лигандов внутрь замкнутых везикул [Walter, 1975; Jorgensen, Skou, 1971; Besch et al., 1977; Bonnafous et al., 1979], составляющих значительную часть (~75%) микросомальных препаратов плазматических мембран [Walter, 1975]. Применение подобных веществ принципиально важно, поскольку в молекуле ИаД-АТФазы центры связывания АТФ и уабаина расположены по разные стороны мембраны, из-за чего в замкнутых везикулах только один тип центров связывания (субстрата или ингибитора) доступен для присутствующих в среде инкубации лигандов (АТФ, уабаина).

В настоящей работе определение активности Na, К-АТФ азы проводили в присутствии каналообразователя аламетицина. Добавление данного ионофора в установленной оптимальной концентрации увеличивало активность Na, K-АТФазы при 37 °C из почек активных сусликов в -3,2 раза. Это означает, что в данных препаратах значительная часть фермента (—70%) была неактивна и, по-видимому, находилась в замкнутых везикулах. Этот результат хорошо согласуется с упоминавшимися выше данными литературы о доле замкнутых везикул (-75%) в микросомальных препаратах, полученных из почек морских свинок, не способных гибернировать [Walter, 1975]. Однако в препаратах из почек спящих сусликов, находящихся в состоянии гипотермии, активность №, К-АТФазы в присутствии аламетицина увеличивалась лишь в 1,9 раза, притом что в отсутствие ионофора базовая активность Na, К-АТФ азы при 37 °C в препаратах микросом из почек как активных, так и спящих сусликов не различалась (р=0,2).

Согласно общепринятым представлениям, базовая активность Na, K-АТФазы (в отсутствие активаторов) принадлежит ферменту, находящемуся в «разорванных» (поврежденных) мембранах [Walter, 1975], в которых также может быть нарушена и организация белков. Одинаковый уровень базовой активности в препаратах из почек активных и спящих сусликов может свидетельствовать о том, что микросомы в них повреждены в равной степени. Это неудивительно, так как использовался общий метод выделения.

Латентная" же активность обусловлена АТФазой, находящейся в нормальных неповрежденных мембранах. Однако, как установлено, при гибернации наблюдается агрегация Ка, К-АТФазы, приводящая, по всей видимости, к ингибированию фермента. Поэтому логично предположить, что и при добавлении аламетицина активность таких агрегированных молекул остается скрытой, что выражается в меньшем активационном эффекте ионофора в препаратах из почек спящих сусликов по сравнению с препаратами из почек активных животных.

При определении температурной зависимости активности №, К-АТФазы в препаратах из почек сусликов (в присутствии аламетицина) установлено, что активность фермента при гибернации ниже в 1,8−2,0 раза в диапазоне температур от 15° до 37 °C (р<0,0005). Однако при более низких температурах различия менее выражены (р<0,05), а при температурах ниже 10 °C становятся недостоверными (р>0,5). Это сказывается на характере графиков Аррениуса для активности №, К-АТФазы из почек сусликов при температурах выше и ниже критической (18−20°С), при которой наблюдается перегиб. Аномалии в области 20 °C отмечены также на графиках Аррениуса для параметра порядка 5, определенного по ЭПР-спектрам спинового зонда 5-доксилстеарата, и на графиках Аррениуса для степени эксимеризации флуоресцентного зонда пирена в общих и аннулярных липидах мембран микросом из почек сусликов. Это согласуется с общепринятыми взглядами о связи между изменениями свойств интегральных ферментов и структурными перестройками мембранных липидов в критической области температур [СпзЬаш, Вашей, 1973; СЬагпоск й а1., 1973; Клте1Ьег& РараЬафроЫоб, 1974; ВоПугеу а1., 1977; ВоМугеу & а1., 1982].

При температурах выше критической (~20°С) графики Аррениуса практически параллельны, то есть энергия активации №, К-АТФазы из почек активных и спящих сусликов в этих условиях существенно не различается (11,2— 11,8 ккал/моль). При падении температуры с критической отметки (~20°С) до крайней точки температурной зависимости (2,5°С) сезонные различия в активности №, К-АТФазы становятся менее выраженными. Это находит отражение на характере графиков Аррениуса, наклон которых в данной области температур заметно различается. Рассчитано, что при температурах ниже критической энергия активации №, К-АТФазы в препаратах из почек спящих сусликов примерно на 7 ккал/моль меньше по сравнению с препаратами из почек активных животных (27,9 и 35,0 ккал/моль соответственно). По-видимому, такое изменение свойств фермента позволяет натриевому насосу быстрее включиться в работу почек при повышении температуры тела пробуждающихся сусликов, которым необходимо быстро восстановить гомеостаз.

Установленный вид графиков Аррениуса для активности ]^а, К-АТФазы из почек сусликов можно объяснить температурной зависимостью процесса агрегации натриевого насоса, происходящего в мембранах микросом. Повидимому, в крайней точке температурной зависимости (2,5°С) активность.

Иа, К-АТФазы из почек активных и спящих сусликов находится на минимальном уровне, поскольку почти все молекулы фермента агрегированы и заингибированы в результате латерального разделения и кластеризации липидов, индуцированных низкой температурой [Ивков, Берестовский, 1982; Болдырев и др., 1985; Гулевский и др., 1990]. С повышением температуры до ~20°С влияние температуры на организацию липидов и белков в мембране, вероятно, снижается. Однако с ростом температуры в препаратах из почек спящих сусликов степень олигомеризации, видимо, снижается не так интенсивно, как в препаратах из почек активных сусликов. Вероятно, часть молекул натриевого насоса при гибернации организуется в особо прочные агрегаты (сохраняющие такую структуру в процессе выделения) [Skriver et al., 1980]. Скорее всего, такое состояние молекул фермента особым образом закрепляется, в чем может принимать участие примембранный цитоскелет, с которым посредством ряда белков способна взаимодействовать Na, K-ATOa3a [Kraemer et al., 1990; Devarajan et al., 1994; Manunta et al., 1998; Zhang et al., 1998; Батрукова и др., 2000; Lee et al., 2001; Kraemer et al., 2003]. Такое предположение о стабильной агрегации фермента при гибернации подтверждается полученными в настоящей работе данными, согласно которым №, К-АТФаза из почек спящих сусликов находится в более агрегированном состоянии по сравнению с препаратами из почек активных животных. Достижение температурной отметки в ~20°С сопровождается изменениями в организации мембран (например, распадаются кластеры и нарушается латеральное разделение лигсидов), в результате чего исчезает влияние со стороны липидного бислоя на организацию молекул натриевого насоса. Подтверждением этого служит характер графиков Аррениуса при температурах выше критической, линии которых в таких условиях параллельны.

Таким образом, основной причиной падения активности №, К-АТФазы из почек сусликов при гибернации является, по-видимому, более агрегированное состояние фермента в мембранах микросом наряду с некоторым уменьшением его содержания в препаратах во время зимней спячки.

1. Абатуров Б. Д., Магомедов М.-Р.Д. (1982) Зависимость смертности малых сусликов (С i te I? us pygmaeus) от плотности популяции и обеспеченности кормом. Зоол. журн., 61, 123−127.

2. Ануфриев А. И. (2002) Динамика массы тела у сусликов (Citelhis undiilatus) в спячке. Экология, 33, 73−76.

3. Ануфриев А. И. (2008) Механизмы зимней спячки мелких млекопитающих Якутии (Соломонов Н.Г., ред.), Изд-во СО РАН, Новосибирск.

4. Ануфриев А. И., Архипов Г. Г. (2004) Влияние размеров и массы тела на характер перезимовки у зимоспящих семейства Sciuridae северо-востока России. Экология, 35, 189−194.

5. Ануфриев А. И., Ахременко А. К. (1990) Энергетическая стоимость зимней спячки длиннохвостого суслика. Экология, 21, 68−72.

6. Батрукова М. А., Бетин B. JL, Рубцов А. М., Лопина О. Д. (2000) Анкирин: строение, свойства и функции. Биохимия, 65, 469−484.

7. Белоусов А. Б. (1993) Роль центральной нервной системы в контроле зимней спячки. Успехи физиол. наук, 24, 109−127.

8. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. (2002) Биологическая химия, Медицина, Москва.

9. Блюдзин Ю. А., Осадчая Л. М., Болдырев A.A. (1986) Жирнокислотный состав суммарных липидов и фосфолипидов мембранных препаратов транспортных АТРаз. Биохимия, 51, 1499−1505.

10. Болдырев A.A. (1982) Na, K-зависимая АТФаза как олигомерная система. В сб. Итоги науки и техники. Биологическая химия (Кретович В.Л., ред.), 17, ПИК ВИНИТИ, Москва, 75−146.

11. Болдырев A.A. (1983) Роль межбелковых взаимодействий в регуляции Са-насоса саркоплазматического ретикулума. Укр. биохим. журн., 55, 677−688.

12. Болдырев A.A. (1985) Биологические мембраны и транспорт ионов, Изд-во МГУ, Москва, 208.

13. Болдырев A.A. (1988) Характеристика температурной зависимости Na, K-АТФазы. Укр. биохим. журн., 60, 107−113.

14. Болдырев A.A. (1998) Na/K-АТФаза свойства и биологическая роль. Сорос, обр. журн., 4,2−9.

15. Болдырев A.A., Лопина О. Д., Прокопьева В. Д. (1985) Мембранные липиды как регуляторы межбелковых взаимодействий. Нейрохимия, 4, 80−95.

16. Болдырев A.A., Лопина О. Д., Рубцов A.M., Свинухова И. А. (1983) Биохимия активного транспорта ионов и транспортные АТФазы, Изд-во Московского университета, Москва, 46−59.17,18,19.