Актуальность проблемы. Боль, как непременный спутник болезней человека, на протяжении всей истории борьбы за здоровье являлась и остается центральной проблемой теоретической и практической медицины. Представления о формировании болевых сигналов, их трансляции и превращении в ощущения в связи с достижениями нейрохимии и физиологии мозга существенно изменились. Новое направление в понимании боли стало формироваться благодаря открытию оксида азота, его участию в ноцицептивных восприятиях и взаимодействию этой молекулы с пептидами и медиаторами, традиционно рассматриваемыми как агенты, реализующие боль (Aley et al., 1998; Millan, 1999, 2002).
Ощущение, проведение и интеграция болевого сигнала обеспечивается системой пространственно распределенных центральных структур, имеющих многоуровневую организацию. Восходящие из спинного мозга болевые (ноцицептивные) импульсы активируют многочисленные мозговые центры, совокупная работа которых определяет целостную реакцию организма на боль. В этой системе оксид азота (N0) выступает в роли интегративного звена, модулирующего деятельность различных нейромедиаторных систем, и как посредник в регуляции мозговой гемодинамики (Дюйзен и соавт., 1998; Estrada, DeFelipe, 1998; Faraci, Brian 1994; Jones et al., 1999).
В последние десятилетия работы, посвященные исследованию роли N0 в регуляции боли, ведутся достаточно интенсивно во всем мире. Использование в эксперименте предшественников синтеза N0 или активация глутаматной нейропередачи изменяет функциональное состояние болевого анализатора (Дюйзен, 2002; Aley et al., 1998; Coutinho et al., 2001), активирует защитные резервы, либо, напротив, провоцирует дисметаболические процессы в нервной ткани, приводя к гибели нейронов (Викторов, 2000; Раевский и соавт., 2000; Golde et al., 2002; Iravani et al., 2002). В то же время торможение NO-зависимых сигнальных путей создает наиболее оптимальные условия для проведения лекарственного обезболивания (Babey et al., 1994; Furst, 1999; Leza et al., 1996;
Мао, 1999). Эти свойства нитроксидергической трансмиссии определили реальные предпосылки для изыскания новых методов фармакологической коррекции болевых синдромов (Elliot et al., 1995; Janero, 2000; Licinio et al., 1999; Trujillo, 2000). Несмотря на столь значительные успехи в расшифровке нейрохимических механизмов боли, картина NO-зависимой регуляции этого феномена остается неполной по нескольким причинам:
Во-первых, отсутствуют данные о динамике собственных, эндогенных систем синтеза NO в мозге при болевых реакциях. Большинство работ посвящены NO-ергическим процессам, происходящим в спинном мозге и в периферических тканях, где за оксидом азота прочно закрепилась роль про-болевого фактора (Levy et al., 1999; Lin et al., 1999; Traub et al., 1994). В то же время известно, что в координационных центрах головного мозга NO во многом определяет эффективность вегетативных, эмоционально-когнитивных и антиболевых адаптаций (Kolhekar et al., 1997; Masood et al., 2004; Morimoto et al, 2000; Prevot et al., 1998; Seo et al., 2002; Urban Gebhart, 1999). Поэтому интегративная оценка нейрохимических перестроек при боли возможна лишь с учетом особенностей системы эндогенного синтеза NO на всех уровнях ЦНС.
Во-вторых, используемые в мировой науке методы биохимической регистрации активности NO-синтазы (NOS) не всегда позволяют определить степень вовлеченности отдельных центров головного мозга, а такжеустановить тканевой источник избыточной либо недостаточной продукции NO при болевых воздействиях. Наиболее информативными методами анализа внутриклеточной активности NO-синтазы являются гистои иммуноцитохимическая диагностика (Kuo et al., 1994; Matsumoto et al., 1993). Эти методы позволяют не только изучать морфо-химические параметры нейронов, но проследить особенности их связей и охарактеризовать их нейротрансмиттерный тип.
В-третьих, возможности применения уже полученных данных в клинической практике весьма ограничены без учета нитроксидергических событий, происходящих в мозге человека при болевом воздействии. К сожалению, усилия исследователей по данному вопросу ограничиваются лишь картированием NO-ергических нейронов мозга человека в норме (Egberongbe et al., 1994; Sangruichi, Cowall, 1991).
Цель настоящей работы — установить закономерности организации и функционирования NO-ергических систем головного мозга человека и животных, вовлеченных в модуляцию болевого сигнала.
Задачи исследования:
1. Изучить локализацию и активности NADPH-диафоразы и NO-синтазы в тех регионах головного мозга человека и животных, причастность которых к модуляции болевого сигнала является установленной.
2. С помощью гистои иммуноцитохимических методов охарактеризовать медиаторный тип NO-ергических нейронов в нервных центрах головного мозга человека и животных.
3. На модели тонической воспалительной боли изучить динамику активности NO-синтазы в ядерных и корковых формациях головного мозга крыс и оценить характер изменений нейронального, эндотелиального и индуцибельного компонентов синтеза NO.
4. Дать количественную оценку биохимической активности фермента в отделах головного мозга и определить содержание метаболитов NO (нитратов и нитритов) в периферической крови экспериментальных животных.
5. Провести комплексное исследование нитроксидергической активности в соответствующих структурах головного мозга людей, погибших в различные сроки после развития травматического болевого шока.
6. Изучить состояние нитроксидергических процессов в мозге экспериментальных животных при системном воздействии опиатов и у людей, погибших в результате опийной интоксикации.
7. На основе полученных результатов и при их соотнесении с литературными данными составить нейрохимическую и динамическую модель нитроксидергической модуляции системной болевой реакции.
Научная новизна работы. В настоящей работе проведено комплексное исследование синтеза оксида азота в нервных центрах и корковых формациях головного мозга человека и животных, участвующих в формировании системной интегративной болевой реакции.
Впервые представлена количественная характеристика NO-ергических нейронов в отделах головного мозга человека и экспериментальных животных и выявлены межвидовые сходства и отличия.
Впервые изучена динамика активности NADPH-диафоразы, нейрональной и индуцибельной NO-синтазы в различных структурно-функциональных ансамблях болевого анализатора и проведен сравнительный анализ изменений, происходящих в мозге экспериментальных животных и у людей, погибших от травматического болевого шока.
Впервые показан дозо-зависимый эффект опиатных аналгетиков на состояние NO-ергического синтеза в серотонинергических ядрах у экспериментальных животных.
В коре головного мозга людей, погибших от опийной интоксикации, впервые идентифицированы аберрантные NO-ергические комплексы, формирующие морфологический субстрат для нейротоксического действия оксида азота.
Впервые установлена индукция NOS в норадренергических нейронах голубоватого пятна мозга наркоманов.
Впервые создана нейрохимическая и динамическая модель нитроксидергической модуляции различных компонентов системной болевой реакции.
Теоретическая и практическая ценность работы. Результаты исследования топографических взаимоотношений между медиаторной специализацией нейрона и его NO-ергической функцией необходимы для выяснения роли нейромодуляторных влияний N0 при развитии болевых феноменов. Эти данные также важны для обоснования закономерностей, лежащих в основе аналитического и аддиктивного действия используемых в клинике опиатных аналгетиков.
Предложенная в работе концепция NO-ергической модуляции центральных механизмов боли способствует пониманию нейрохимических основ патогенеза боли и открывает перспективы для более рациональной коррекции болевых синдромов при использовании специфических регуляторов активности NO-синтазы самостоятельно или в комбинации с другими препаратами.
Полученные данные о топографии NO-ергических нейронов головного мозга человека и животных и их динамических перестройках в условиях болевого стресса могут быть использованы в нейрохимии, токсикологии, психофармакологии, психиатрии, клинической и экспериментальной неврологии, анестезиологии, наркологии и судебной медицине. Эти данные необходимы также для поиска и оценки фармакологических препаратов направленного действия.
На защиту выносятся следующие положения:
1. В головном мозге стволовые и корковые отделы, участвующие в интеграции болевого сигнала, продуцируют оксид азота.
2. NO-ергические нейроны различных мозговых формаций человека и животных характеризуются медиаторной и нейрохимической гетерогенностью, которая определяет их неравнозначное участие в формировании болевой реакции.
3. В системной болевой реакции течение перцептуально-дискриминативного, эмоционально-когнитивного, вегетативного и антиболевого компонентов регулируется NO-ергическим механизмом.
4. В основе аналитического и аддиктивного эффектов опиатных аналгетиков лежат изменения активности N0 в эндогенных антиболевых центрах.
Апробация работы.
Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на III Международной конференции стран СНГ по функциональной морфологии, посвященной 100-летию со дня рождения Н. Г. Колосова (Санкт-Петербург, 1997) — V Международном симпозиуме Японско-Российского медицинского обмена (Япония. Саппоро, 3−49. 1997) — Международном симпозиуме «Роль монооксида азота в процессах жизнедеятельности» (Минск, 17−21X02, 1998) — VI Съезде анестезиологов и реаниматологов (Москва, 1998) — V Всероссийском съезде судебных медиков (Москва-Астрахань, 2000) — I и III Тихоокеанской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины» (Владивосток, 45. 2000; 254. 2002) — Центральном Европейском конгрессе по нейробиологии (Польша. Краков, 2001) — Международной научной конференции «Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере» (Сургут, 29−315, 2002) — X Международном конгрессе нейрохимического общества Чехии и Словакии «Нейронауки в третьем тысячелетии» (Словакия. Каста, 1−5X06. 2002) — IV Международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения — 2002» (Санкт-Петербург, 29−31X05, 2002) — XIX конгрессе Международной академии судебной медицины (Италия. Милан, 3−69. 2003) — XX Конгрессе Международного общества судебных генетиков (Франция. Бордо, 9−139. 2003).
ВЫВОДЫ.
1. В головном мозге NADPH-диафораза (NO-синтаза) локализуется в нейронах ядер шва, тонкого и клиновидного ядер, центрального серого околоводопроводного вещества среднего мозга, черной субстанции, вентрального тегментального поля, ядрах покрышки мозга (дорсо-латеральном и ножко-мостовом), ядер гипоталамуса, таламуса и базального переднего мозга, сомато-сенсорной и лимбической коры.
2. NO-продуцирующие клетки головного мозга химически гетерогенны: в ядрах шва NO-синтаза со-локализована с серотониномна уровне покрышковых ядер и в области базального переднего мозга NO синтезируют холинергические нейроныNO-ергические эндокриноциты супраоптического и паравентрикулярного ядер гипоталамуса экспрессируют ангиотензин-превращающий ферменттопографические и морфологические характеристики NADPH-d-позитивных клеток в ядрах задних канатиков, центральном сером веществе среднего мозга, черной субстанции и вентральном тегментальном поле, таламусе и коре позволяют причислить их к категории тормозных ГАМК-ергических интернейронов. Оксид азота не синтезируется в норадренергических и дофаминергических нейронах.
3. В исследованных отделах головного мозга экспериментальных животных и человека характер NO-ергической активности коррелирует со степенью вовлеченности нервного центра в процессы модуляции болевого сигнала, зависит от длительности болевой экспозиции и обусловлен характером афферентно-эфферентного устройства его нервных связей. В разных нейротрансмиттерных и функциональных системах NO-ергическая активность имеет индивидуальный динамический рисунок.
4. У крыс в ядрах, осуществляющих перцептуально-дискриминативный анализ болевого импульса, регистрируются однонаправленные нейрохимические перестройки:
• в тонком ядре при болевом воздействии происходит отсроченный, билатеральный и непродолжительный (4−5 часов) всплеск нитроксидергической активности. Последовательная активация NO-ергических структур ипсии контралатеральной стороны определяется характером двойственной иннервации ядра;
• в вентро-базальных отделах таламуса регистрируется уплотнение NO-ергического нейропильного компонента на стороне, противоположной повреждению. Активация нейронного пула NADPH-диафоразы наблюдается в ретикулярном таламическом ядре;
• в корковых регионах мозга крыс изменения наиболее выражены через 6 часов болевой экспозиции и связаны с увеличением числа N0-позитивных нейронов и длины NO-ергического капиллярного русла.
5. Интегративная оценка динамики NO-ергических процессов в ядрах, участвующих в регуляции вегетативных адаптаций, позволяет условно выделить два периода.
• Первая фаза болевого ответа характеризуется гиперактивностью NO-синтазы в мелкоклеточной зоне паравентрикулярного ядра гипоталамуса и тканевых элементах срединного возвышения, заметным угнетением показателей гистохимической реакции в эндокриноцитах супраоптического и паравентрикулярного ядер и умеренной активацией нейронов дорсо-латерального сегмента центрального серого околоводопроводного вещества среднего мозга;
• Вторая фаза NO-ергических сдвигов регистрируется через 3 часа после начала болевого воздействия — для нее характерна реверсия NO-ергического ответа в мелкои крупноклеточных ядрах гипоталамуса и выраженная экспрессия фермента в дорсои вентро-латеральных сегментах центрального серого вещества среднего мозга.
6. В аналитических центрах головного мозга крыс изменение синтеза N0 имеет динамическое развитие:
• острый период боли связан со снижением уровня NADPH-диафоразы в серотонинергических ядрах шва крыс, умеренной активацией синтеза NO в центральных структурах среднего мозга, латеральном ядре гипоталамуса и может формировать благоприятные внутриклеточные условия для запуска нисходящей серотонинергической аналгезии;
• в отсроченный период нарастание NO-ергической активности в нейронах шва является механизмом, лимитирующим синтез серотонина, что определяет про-ноцицептивный этап нисходящей серотонинергической модуляции боли;
• заметная активация NADPH-диафоразы в нейронах вентро-медиального, латерального гипоталамических ядер, дорсои вентро-латерального сегментов околоводопроводного вещества среднего мозга, а такжеэкспрессия фермента в афферентных системах голубоватого пятна обусловливает в фазу тонической боли серотонин-независимые аналитические механизмы.
7. У крыс регуляция «arousaP'-систем протекает без участия NO-ергического механизма — болевое воздействие приводит к значительному снижению числа и активности NO-продуцирующих элементов в холинергических зонах мозга (дорсо-латеральном и ножко-мостовом ядрах покрышки, структурах базального переднего мозга).
8. В большинстве исследованных образований мозга человека и экспериментальных животных топография, морфологические характеристики и показатели гистохимической активности NADPH-d-позитивных нейронов совпадают, однако характер связанных с болью нитроксидергических перестроек в мозге человека имеет ряд особенностей:
• в тонком ядре доминирующим типом нейрохимического ответа на болевое повреждение является изменение NO-ергической активности волокон и нейроглиальных элементов заднего канатика;
• в таламусе формируются нейроперестройки двоякого рода: в неспецифических отделах и в ретикулярном ядре более выражены изменения со стороны NO-ергических нейронов, а в вентро-базальных ядрах изменения затрагивают их нейропильный компонент;
• в сомато-сенсорной и лимбической коре на первый план выступают изменения NO-ергической активности нейроглиоцитовколичество и активность NADPH-d-позитивных нейронов достоверно не изменяются;
• развитие болевого шока у человека сопровождается экспрессией NADPH-диафоразы в нейронах мелкоклеточной и эндокринной зоны паравентрикулярного ядра, в локальных микрососудах и волокнах гипоталамо-гипофизарного тракта;
• у людей, погибших в результате травматического шока экспрессия NADPH-диафоразы происходит только в дорсо-латеральном сегменте ЦСОВ;
• во всех ядрах шва регистрируется стойкое угнетение активности NO-синтазы.
9. В большинстве исследованных ядер человека и крыс изменение активности NO-синтазы связано с нейрональным типом фермента: исключение составляет а-часть парагигантоклеточной ретикулярной формации, где на фоне болевого воспаления регистрируется индуцибельная форма NOS.
10. Течение болевого процесса изменяет биохимическую активность NO-синтазы в регионах головного мозга человека и животных и сопровождается параллельными сдвигами концентрации нитратов и нитритов в периферической крови.
11. Антиболевой эффект опиатных аналгетиков связан с активностью NO-ергических систем мозга:
• однократное воздействие препарата на фоне болевого синдрома или у интактных животных угнетает NO-синтетические процессы в серотонинергических ядрах шва крыс;
• эти влияния зависят от дозы вводимого препарата, коррелируют с уровнем опиатных рецепторов и чувствительны к действию антагониста опиатов — налоксона.
12. Аддиктивные и нейротоксические эффекты опиатов реализуются при содействии NO-ергической системы:
• нарастание толерантности и развитие спонтанного или вызванного налоксоном синдрома отмены сопровождаются экспрессией NADPH-диафоразы в серотонинергических ядрах крыс;
• при интоксикации опиатами происходит индукция NO-синтазы в норадренергических нейронах голубоватого пятна у человека;
• в коре головного мозга наркоманов формируются высоко-активные аберрантные сплетения NO-ергических волокон, которые предопределяют развитие нейродеструктивных изменений. Избыточное образование оксида азота за счет активности индуцибельной NO-синтазы в пирамидных нейронах коры головного мозга наркоманов подтверждается иммуноцитохимическими и генетическими методами.
13. На основании полученных данных сформировано представление о том, что в реализации системной болевой реакции у животных и человека участвуют NO-ергические механизмы подкорковых и корковых центров головного мозга.
