Цитокинсинтетическая активность лимфоцитов периферической крови при B-клеточном остром лимфобластном лейкозе у детей

Актуальность проблемы.

Острый лимфобластный лейкоз (OJIJI) является наиболее частым онкологическим заболеванием у детей. Использование современной программной химиотерапии в последние годы позволяет достичь выхода в ремиссию более чем у 90% больных, а пятилетней безрецидивной выживаемости у 77−80% детей [Harms DO at al., 2000; Schrappe M at al., 2000].

Несмотря на достигнутые успехи в лечении OJIJI у детей, сохраняется группа больных, у которых проведение современной комплексной химиотерапии неэффективно. Это «первично рефрактерные» к лечению больные (2−3% пациентов), а также дети, у которых развиваются рецидивы заболевания. Результаты лечения этих больных остаются неудовлетворительными. Все это стимулирует к поиску причин резистентности и возможных путей её- преодоления.

Рефрактерность лейкемических клеток к высокодозной химиотерапии, а также развитие рецидивов может быть обусловлено особенностями биологии резидуальных клеток и/или нарушениями противоопухолевого иммунитета. В механизме нарушений противоопухолевого иммунитета важную роль может играть изменение функции лимфоцитов и, в частности, нарушение синтеза таких цитокинов, как IFN-y, TNF-а и IL-2, участвующих в клеточном противоопухолевом иммунитете.

В частности, имеются данные о прямой зависимости уровня TNF-a в плазме крови и абсолютного и относительного содержания лейкемических клеток в периферической крови [Потапнев М.П. и соавт., 2003]. Предполагается, что данный цитокин участвует в миграции из костного мозга в периферическую кровь лейкемических клеток.

Однако, особенности внутриклеточного синтеза цитокинов IFN-y, TNF-a и IL-2, лимфоцитов крови у детей в разные периоды OJIJI изучены мало.

При OJIJI у детей выявлено снижение IFN-y и IL-2 продуцирующих клеточных популяций Т-хелперов и Т-супрессоров, причем наиболее низким был уровень синтеза IL-2. Для восстановления нормального количества IL-2-синтезирующих клеток требовалось 2−3 года после прекращения химиотерапии (Xao-Li Z. et al., 2000). Однако в других исследованиях обнаружено повышение уровня синтеза IFN-y в течение периода терапии и снижение после прекращения лечения (Duan Y. at al., 2001). Описана нормализация IL-2 и IFN-y синтезирующих клеточных популяций Т-хелперов и Т-супрессоров через 6 месяцев после прекращения химиотерапии во всех случаях исследования (Zhang XL at al., 2000).

В связи с изложенным представляется актуальным проведение исследований особенностей клеточного иммунитета у детей в разные периоды острого лимфобластного лейкоза с применением имуноцитологических методов оценки фенотипа и функциональных свойств клеток, в частности цитокинсинтетической активности лимфоцитов периферической крови.

Цель исследования:

Целью исследования являлось изучение цитокинсинтетической активности лимфоцитов крови у детей в дебюте острого лимфобластного лейкоза и в различные периоды ремиссии заболевания.

Задачи исследования:

1. Изучить внутриклеточный синтез цитокинов: интерферона-гамма, фактора некроза опухоли-альфа и интерлейкина-2 лимфоцитами крови у практически здоровых детей.

2. Определить основные субпопуляции лимфоцитов крови и внутриклеточный уровень интерферона-гамма, фактора некроза опухоли-альфа и интерлейкина-2 в лимфоцитах крови у детей в дебюте острого лимфобластного лейкоза.

3. Изучить иммунофенотип лимфоцитов крови и их цитокинсинтетическую активность у детей в разные периоды ремиссии острого лимфобластного лейкоза на фоне химиотерапии.

4. Определить основные субпопуляции лимфоцитов крови и их цитокинсинтетическую активность в периоде ремиссии острого лимфобластного лейкоза у детей после прекращения программной химиотерапии.

Научная новизна:

Впервые определен внутриклеточный синтез цитокинов ГБЫ-у, ТЫР-а и 1Ь-2 лимфоцитами крови у детей в различные периоды острого лимфобластного лейкоза.

Впервые установлено, что уровень цитокинсинтезирующих лимфоцитов тесно связан с количеством бластов в крови. Процент лимфоцитов, синтезирующих 1КИ-у, ТЫР-а и 1Ь-2, у больных с низким бластозом соответствовал показателям группы сравнения. При высоком бластозе в крови уровень цитокинсинтезирующих лимфоцитов был резко снижен.

Получены данные о чрезвычайно высокой интенсивности экспрессии изученных внутриклеточных цитокинов в остром периоде заболевания независимо от уровня бластоза в крови и процента цитокинсинтезирующих клеток, что отражает высокую функциональную активность лимфоцитов крови в дебюте острого лимфобластного лейкоза.

Показано, что процент цитокинсинтезирующих лимфоцитов крови сохраняется на уровне показателей группы сравнения в различные периоды ремиссии заболевания на фоне химиотерапии, а также после окончания программной химиотерапии.

Установлено, что у больных ОЛЛ с низким уровнем бластных клеток в крови в дебюте заболевания состав популяций лимфоцитов периферической крови соответствовал показателям нормы. Изменения в составе субпопуляций лимфоцитов выявлялись лишь у детей при уровне бластных клеток более 49%. На фоне лейкоцитоза за счет лейкемических клеток наблюдалось снижение как относительных, так и абсолютных показателей содержания Т-лимфоцитов и их субпопуляций.

Установлено, что процентное содержание зрелых Т-лимфоцитов и их СЭ4+ и СБ8+ субпопуляций, а также >1К-клеток нормализуется к окончанию интенсивной химиотерапии.

Выявлено, что на фоне проведения программной химиотерапии отмечается резкое угнетение В-линейного звена иммунитета. Содержание В-лимфоцитов возвращается в пределы нормальных значений после окончания программной химиотерапии.

Практическая значимость работы:

Определена цитокинсинтетическая активность лимфоцитов периферической крови у практически здоровых детей, что может быть использовано в качестве нормативных показателей при оценке состояния иммунной системы.

Установлено, что в дебюте острого лимфобластного лейкоза интенсивность флюоресценции внутриклеточных цитокинов в лимфоцитах крови значительно превышает показатели группы сравнения, что косвенно указывает на напряженность противоопухолевого иммунитета в остром периоде заболевания.

В различные периоды ремиссии В-линейного острого лимфобластного лейкоза процентный состав Т-лимфоцитов и их субпопуляций, а также интенсивность экспрессии внутриклеточных цитокинов соответствует показателям практически здоровых детей (группа сравнения). Полученные данные свидетельствуют о достаточной стабильности Т-клеточного иммунитета, что, вероятно, способствует поддержанию ремиссии В-ОЛЛ после окончания программной химиотерапии.

Выявлено значительное угнетение В-кпеточного звена иммунитета, что необходимо учитывать при выработке терапевтической тактики ведения данных больных и при проведении вакцинации детей в период ремиссии ОЛЛ.

Полученные данные дают представление о функциональном состоянии иммунной системы при остром лимфобластном лейкозе.

Внедрение результатов работы в практику:

Результаты исследования, в частности определение функциональной активности лимфоцитов по их способности к внутриклеточному синтезу цитокинов 1КЫ-у, ТОТ-ос и И-2, внедрены в работу клинико-диагностической лаборатории ГУ НИИ педиатрии НЦЗД РАМН и могут быть использованы в работе иммунологических и гематологических лабораторий.

ВЫВОДЫ:

1. У практически здоровых детей (группа сравнения) средний процент лимфоцитов, синтезирующих цитокины, составил: ГБЫ-у — 29+3,9%, ТМ^-а -27+3,0%, 1Ь-2 — 10,0+1,3%- абсолютное количество — ГБЫ-у -0,879±0,113×109/л, ют-а — 0,855+0,103×109/л, 1Ь-2 — 0,345±0,068×109/л. Интенсивность экспрессии внутриклеточной метки для этой группы составила: 1ЕМ-у — 303+60,8, ЮТ-а — 93±7,5, ГЬ-2 — 114+17,5.

2. В дебюте острого лимфобластного лейкоза у детей с невысоким уровнем бластов в крови процентное содержание цитокинсинтезирующих лимфоцитов достоверно не отличается от показателей группы сравнения. Абсолютное количество цитокинсинтезирующих лимфоцитов в данной группе больных достоверно выше показателей группы сравнения (р<0,001).

3. У детей с высоким уровнем бластов в крови отмечается резкое снижение как абсолютных, так и относительных показателей лимфоцитов, синтезирующих цитокины. Обнаружена отрицательная корреляция между уровнем бластных клеток в крови и количеством лимфоцитов, синтезирующих цитокины ГКЫ-у, ЮТ-а и 1Ь-2.

4. Лимфоциты периферической крови больных в дебюте ОЛЛ обладают высокой способностью к синтезу внутриклеточных цитокинов, оцениваемому по интенсивности флюоресценции внутриклеточной метки.

Средние каналы флюоресценции 1КЫ-у, ЮТ-а и 1Ь-2 в 2−4 раза превышают показатели группы сравнения, что отражает высокую функциональную активность лимфоцитов крови.

5. Относительное содержание зрелых Т-лимфоцитов, Т-хелперов/индукторов, Т-супрессоров/цитотоксических клеток, а также ЫК-клеток нормализуется к окончанию интенсивной химиотерапии. В связи с лейкопенией на фоне лечения абсолютное количество этих клеток нормализуется после окончания программной химиотерапии.

6. Содержание В-лимфоцитов значительно снижено на фоне химиотерапии и возвращается в пределы нормальных значений только после окончания программной химиотерапии.

7. Восстановление процента лимфоцитов, синтезирующих ГБЫ-у и 1Ь-2, происходит после окончания интенсивной химиотерапии, а ТЫБ-а — только в период поддерживающей химиотерапии. Среднее абсолютное количество ГБК-у-синтезирующих лимфоцитов остается низким во все периоды наблюдения, ЮТ-аи 1Ь-2-синтезирующих клеток восстанавливается после окончания программной химиотерапии.

8. Интенсивность флюоресценции внутриклеточных цитокинов 1КЫ-у, ТЫБ-а и 1Ь-2 сохраняется на высоком уровне во все периоды ремиссии, что свидетельствует о сохранности функциональных свойств лимфоцитов периферической крови.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. Полученные данные о цнтокинсннтетической активности лимфоцитов крови у больных В-линейным острым лимфобластным лейкозом могут использоваться для оценки состояния их иммунной системы.

2. Значительное угнетение В-клеточного звена иммунитета необходимо учитывать при выработке терапевтической тактики ведения больных ОЛЛ и при проведении вакцинации детей в период ремиссии острого лимфобластного лейкоза.