Иммуномодулирующие и радиозащитные свойства биологически активных веществ из морских гидробионтов

Актуальность исследования.

С иммунобиологических позиций состояние здоровья современного человека и человечества в целом характеризуется двумя особенностями: снижением иммунной реактивности населения и, как следствие, повышением уровня острых и хронических заболеваний [103, 124]. Этим обусловлен растущий интерес врачей практически всех специальностей к проблеме иммунотерапии. Препараты, оказывающие действие на иммунитет, начинают широко применяться в клинической практике при самых разнообразных заболеваниях. Коррекция вторичных имму, но дефицитов является в настоящее время актуальным, интенсивно развивающимся направлением терапии [61].

С точки зрения современной иммунологии острая лучевая болезнь (ОЛБ) также представляет собой вторичный иммунодефицит [14, 35, 104]. Исходя из роли системы иммунитета в механизме развития лучевого поражения организма, разработаны принципы профилактики и лечения ОЛБ с помощью иммунотропных лекарственных средств [35].

Среди иммуномодуляторов противолучевым действием в широком диапазоне доз облучения обладают нуклеиновые кислоты и, в том числе, препараты, содержащие дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) [24]. Исследования их радиозащитных свойств проводились, начиная еще с 60-х годов прошлого столетия, когда было обнаружено, что профилактическое и лечебное введение препаратов преимущественно высокополимерной гомои гетерологичной ДНК способствует повышению радиорезистентности облученных животных [7, 118]. Изучение действия ДНК на иммунную систему началось сравнительно недавно, что связанно с существовавшим ранее мнением об иммунологической инертности нуклеиновых кислот [106,.

109, 249]. Известны также лейкостимулирующий, противоопухолевый, ранозаживляющий, противовирусный эффекты ДНК [84].

В настоящее время перспективным считается использование природных соединений в качестве сырья для создания лекарственных препаратов [72] и биологически активных добавок (БАД) к пище [117]. Поэтому все большее развитие получают исследования свойств биологически активных субстанций, выделенных из различных трав, семян, морских беспозвоночных, рыб, водорослей, грибов, наземных животных, микроорганизмов и т. д. [39, 88, 157, 172, 194, 226, 240].

По многочисленным литературным данным, морские гидробионты содержат уникальные биологически активные вещества (БАВ) разнонаправленного действия [10, 27, 64, 73, 82, 88, 92, 111]. Как природные источники, они характеризуются широкой и успешно воспроизводимой сырьевой базой, своим разнообразием и высокой эффективностью содержащихся в них БАВ, которые зачастую лишены отрицательных свойств, присущих веществам, полученным из традиционных источников [4].

В течение многих лет сотрудниками лаборатории иммунологии НИИЭМ СО РАМН совместно с Тихоокеанским институтом биоорганической химии ДВО РАН и Тихоокеанским научным рыбохозяйственным центром (ТИНРО-центр) проводится поиск соединений, обладающих иммуномодулирующей, радиозащитной, противоопухолевой, детоксицирующей активностью. Некоторые из этих веществ явились основой для создания БАД (тинростим, зостерин).

Известно, что при внедрении БАД не проходят ту жесткую всестороннюю экспертизу, которой подвергаются лекарственные препараты. В то же время, именно они чаще всего бесконтрольно и широко применяются населением. В связи с этим одним из направлений деятельности лаборатории иммунологии НИИЭМ СО РАМН становится изучение механизмов действия.

Б АД широко применяемых как на Дальнем Востоке, так и в других регионах России.

В настоящей работе были исследованы радиозащитные и иммуномодулирующие свойства БАВ из молок морских гидробионтов, содержащих низкомолекулярную ДНК — ДНК из молок лосося (нДНК) и гидролизата из гонад гребешка (ГГГ).

БАВ нДНК является основным действующим веществом БАД к пище ДНКаС и ДНКаВИТ, разрешенных к использованию [97, 98, 116] и широко применяемых населением. Однако свойства нДНК изучены недостаточно полно, что и послужило причиной включения ее в это исследование.

ГГГ, полученный в лаборатории прикладной биохимии ТИНРО-центра методом ферментативного гидролиза, — новое, ранее неизученное вещество, биологическая активность которого была установлена при проведении скриннингового исследования различных БАВ морского происхождения. Преимуществом ферментативного гидролиза, в сравнении с другими видами — кислотным, щелочным, — является его простота, непродолжительность (около 5 часов), экономичность (используемый в реакции фермент пилорин получают из отходов лососевых рыб).

Таким образом, актуальность настоящей работы определяется тем, что в ней исследованы свойства нового БАВ, полученного из гонад гребешка, проработана экспериментальная база для возможного создания на его основе биологически активной добавки к пище, обоснована целесообразность использования ДНК-содержащих БАД в комплексе лечения вторичных иммунодефицитов, в том числе, радиационного генеза и дальнейшего изучения свойств нДНК и ГГГ с целью возможного создания на их основе в будущем лекарственных препаратов.

Цель работы:

Целью настоящей работы явилось изучение радиозащитных и иммуномодулирующих свойств ДНК из молок лососевых рыб и гидролизата из гонад гребешка для обоснования перспективности их применения при вторичных иммунодефицитах, в том числе и радиационного генеза и возможного создания на их основе лекарственных препаратов.

Основные задачи исследования:

1. Изучить действие различных доз нДНК и ГГГ на иммунные реакции гуморального и клеточного типа.

2. Исследовать влияние нДНК и ГГГ на кроветворение в интактном и облученном организме.

3. Определить эффективность различных доз и схем введения нДНК и ГГГ при костно-мозговом синдроме острой лучевой болезни.

4. Оценить воздействие нДНК и ГГГ на продукцию цитокинов (ИЛ-3, ГМ-КСФ, ФНО-а, ИФН-у и ИЛ-10) клетками крови здоровых доноров.

Научная новизна и теоретическая ценность работы:

Новизна работы заключается в том, что впервые на обширном экспериментальном материале показана иммуномодулирующая активность нДНК и ГТГ. Установлено, что БАВ оказывают выраженное влияние на гуморальный и клеточный иммунитет — обеспечивают увеличение числа антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей, изменяют интенсивность реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), индуцированную у мышей введением эритроцитов барана (ЭБ). В реакции бласттрансформации (РБТЛ) выявлено, что под действием БАВ происходив стимуляция спонтанной и митогениндуцированной пролиферации Т-лимфоцитов.

Впервые исследованы радиозащитные свойства нДНК и ГГГ. Доказана их способность при введении после воздействия ионизирующей радиации в дозах, вызывающих развитие костно-мозгового синдрома^ стимулировать репаративные процессы в кроветворной системе. Выявлено, что нДНК и ГГГ при: лечебной схеме введения обладают свойством увеличивать выживаемость и среднюю продолжительность жизни f (СПЖ) облученных животных.

Впервые установлено модулирующее действие нДНК и ГГГ на продукцию цитокинов (ИЛ-3, ГМ-КСФ, ФНО-а, ИФН-у и ИЛ-10) клетками крови здоровых доноров.

На основании полученных данных^ сделано: предположение, что стимулирующее действие ДНК-содержащих БАВ на систему кроветворения в облученном организме реализуется через иммунную систему.

Новизна результатов, подтверждена получением патентов на изобретения (2).

В результате проведенных исследований раскрыты некоторые механизмыиммунотропного, и радиозащитного действия. ГГГ и нДНК Последняя: является основным действующим веществом таких широко применяемых населением биологически активных добавок к пище как ДНКаС и ДНКаВИТ, однако, механизмы действия нДНК до. сих пор, были мало изучены.

Практическая значимость.

На основании: результатов экспериментов разработаны дополнения к инструкции по: применению БАД, созданных на основе ДНК из молок лососевых рыб. ДНКаС и ДНКаВИТ рекомендуется применять в следующих случаях:

• При радиационных: иммунодефицитах (при облучении в дозах не превышающих костно-мозговой диапазон) — в группах радиационного риска (персонал ремонтных подразделений атомных электростанций, рабочие урановых рудников и предприятий по переработке урановых руд, врачи рентгенологи, радиологи и т. д.), в том числе, у онкологических больных, получающих радиотерапию- • При вторичных иммунодефицитах, протекающих без клинических проявлений и регистрируемых только по изменениям в иммунологических тестах. Лица с такими нарушениями иммунной системы относятся по классификации P.M. Хаитова и др. [124] к группе, которой не показано назначение иммуномодулирующей терапии с использованием лекарственных препаратов.

Внедрение результатов исследования в медицинскую науку и практику.

1. Получены 2 патента на изобретение — № 2 230 559 «Способ стимулирования колониеобразования кроветворных клеток-предшественников в селезенке при облучении животных» (ДНК из молок лососевых рыб) и № 2 236 456 «Способ стимулирования колониеобразования кроветворных клеток-предшественников в селезенке при облучении животных» (гидролизат из гонад гребешка).

2. Советом экономической безопасности на основании инвентаризации принадлежащего нам патента № 2 230 559 «Способ стимулирования колониеобразования кроветворных клеток-предшественников d селезенке при облучении животных» установлена фактическая возможность его использования для внедрения или инвестирования (письмо №Д-25 от 28.12.2004).

3. В ООО «Биополимеры» (г. Партизанск) направлено письмо, в котором рекомендовано расширить область применения БАД на основе низкомолекулярной ДНК из молок лососевых рыб (ДНКаС и ДНКаВИТ).

4. В ТИНРО-центр направлено письмо, в котором рекомендовано продолжить исследование свойств гидролизата из гонад гребешка для возможного создания на его основе биологически активной добавки к пище.

Апробация результатов диссертационной работы:

Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (Владивосток, 2005).

Материалы диссертации представлены на IV Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием (Владивосток, 2003 г.), Международной научно-практической конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет» (Санкт-Петербург, 2002 г.), IV всемирном конгрессе по астме, IX международном конгрессе по клинической патологии, X и XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Пермь, 2003 и 2004 г.), Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование» (Пермь, 2003 и 2004 г.), Объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004 г.), Региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии» (Владивосток, 2004 г.), VI Дальневосточной онкологической конференции «Вопросы диагностики и лечения злокачественных опухолей» (Владивосток, 2004 г.), научной сессии Дальневосточного отделения РАН и Сибирского отделения РАМН (Владивосток, 2004 г.).

По материалам диссертации опубликована 21 работа — 4 статьи и 15 тезисов, получены 2 патента на изобретение.

Объем и структура диссертации. Ма териал диссертации изложен на 158 страницах машинописного текста, проиллюстрирован 11 таблицами и 19 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, заключения, общих выводов, рекомендаций практическому здравоохранению, указателя литературы (138 отечественных и 125 иностранных источников).

127 ВЫВОДЫ:

1. Применение низкомолекулярной ДНК из молок лососевых рыб и гидролизата из гонад гребешка вызывает усиление образования эндогенных и экзогенных селезеночных колоний, что проявляется как при профилактической так и при лечебной схеме введения БАВ, однако, при использовании последней это действие более выражено. Наиболее значимый эффект получен при дозе 10 мг/кг.

2.

Введение

низкомолекулярной ДНК из молок лососевых рыб и гидролизата из гонад гребешка мышам через час после облучения способствует более полному и раннему восстановлению числа лейкоцитов, а также массы и клеточности лимфоидных органов — тимуса и селезенки и клеточности костного мозга.

3. Низкомолекулярная ДНК из молок лососевых рыб и гидролизат из гонад гребешка повышают уровень выживаемости и увеличивают среднюю продолжительность жизни облученных мышей. Это действие является более выраженным при лечебной схеме применения БАВ в дозе 10 мг/кг. Полученный эффект практически равнозначен как при подкожном, так и при пероральном введении нДНК и ГГГ.

4. Низкомолекулярная ДНК из молок лососевых рыб и гидролизат из гонад гребешка оказывают иммуностимулирующее дозозависимое действие на гуморальное звено иммунного ответа. Наиболее значительное повышение количества АОК по сравнению с контролем наблюдалось при введении БАВ в индуктивную фазу антителообразования, при дозах 10 и 100 мг/кг. Низкомолекулярная ДНК из молок лососевых рыб и гидролизат из гонад гребешка вызывали незначительное повышение титра сывороточных антител, дозозависимого эффекта при этом практически не отмечалось.

5. Низкомолекулярная ДНК из молок лососевых рыб и гидролизат из гонад гребешка оказывают выраженное дозозависимое влияние на клеточный иммунитет, стимулируя развитие реакции ГЗТ. При этом наибольшая эффективность наблюдалась при введении БАВ в дозе 10 мг/кг — нДНК только в индуктивную, а ГТТ в индуктивную и в эффекторную фазы иммунного ответа. С помощью РБТЛ установлено, что БАВ способствуют активации процесса пролиферации лимфоцитов.

6. Низкомолекулярная ДНК из молок лососевых рыб и гидролизат из гонад гребешка оказывают модулирующее действие на секрецию ИЛ-3, ГМ-КСФ, ФНО-а, ИФН-у и ИЛ-10 клетками крови здоровых доноров, повышая исходно низкую их концентрацию, снижая исходно высокую и не оказывая существенного влияния при среднем уровне их секреции. Исследуемые БАВ оказывают более выраженное стимулирующее действие на продукцию провоспалительных (ФНО-а), нежели противовоспалительных цитокинов (ИЛ-10).

7.

Введение

низкомолекулярной ДНК из молок лососевых рыб обуславливает повышение уровня цитокинов, вырабатываемых преимущественно Txl-клетками (ИФН-у), т. е. может способствовать развитию клеточного иммунного ответа. Напротив, гидролизат из гонад гребешка оказывает равнозначное действие на выработку цитокинов Txl и Тх2.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ВНЕДРЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ В МЕДИЦИНСКУЮ НАУКУ И ПРАКТИКУ.

1. Разработаны дополнения к инструкциям по применению Б АД, созданных на основе низкомолекулярной ДНК из молок лососевых рыб.

ДНКаС и ДНКаВИТ рекомендуется применять в следующих случаях:

• При радиационных иммунодефицитах (при облучении в дозах не превышающих костно-мозговой диапазон) — в группах радиационного риска (персонал ремонтных подразделений атомных электростанций, рабочие урановых рудников и предприятий по переработке урановых руд, врачи рентгенологи, радиологи и т. д.), в том числе, у онкологических больных, получающих радиотерапию;

• При вторичных иммунодефицитах, протекающих без клинических проявлений и регистрируемых только по изменениям в иммунологических тестах. Лица с такими нарушениями иммунной системы относятся по классификации Р. М Хаитова и др. [124] к группе, которой не показано назначение иммуномодулирующей терапии с использованием лекарственных препаратов.

• Для профилактики различных заболеваний, и, в частности, в периоды сезонного повышения заболеваемости ОРВИ, в целях укрепления общей резистентности организма и повышения его сопротивляемости к инфекции;

• На этапах выздоровления, для устранения астенического синдрома и повышения адаптационных механизмов организма.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Конец XX — начало XXI столетия характеризуется значительным ростом заболеваний, обусловленных нарушениями в системе иммунитета [61, 103]. Развивающийся на фоне дисфункции иммунной системы вторичный иммунодефицит (ВИД) не только осложняет клиническое течение, но и прогноз в клинике внутренних болезней [103].

Формированию ВИД могут способствовать многочисленные факторы инфекционной и неинфекционной природы, загрязнение окружающей человека внешней среды, острые и хронические стрессы, нарушение питания, длительное применение медикаментов, обладающих иммунодепрессивными и иммуносупрессивными свойствами, физические и психоэмоциональные травмы и многое другое [52, 122, 125].

Нарушение нормального функционирования иммунной системы определяет более тяжелое, затяжное течение любых болезней, способствует генерализации воспалительных процессов, развитию осложнений, снижению и/или отсутствию клинического эффекта на проведение базисной терапии.

С этим связан необычайно большой интерес врачей практически всех специальностей к проблеме иммунотерапии. Препараты, оказывающие действие на иммунитет, начинают широко применяться в клинической практике при самых разнообразных заболеваниях [61, 103].

Согласно В. М. Манько и др. [72], большинство современных иммуномодуляторов оказывают выраженное побочное действие, вследствие чего, немногие из них используются в широкой клинической практике. Это требует разработки новых средств для регуляции нарушенных функций иммунной системы.

В последние годы все большее развитие получают исследования, направленные на выделение из различных трав, семян, морских водорослей, грибов, животных биологически активных субстанций, характеризующихся иммуномодулирующим действием [39, 88, 147, 172, 194, 226, 240], созданием на их основе фармакологических препаратов [72] и биологически активных добавок к пище [117].

По многочисленным литературным данным морские гидробионты содержат уникальные БАВ разнонаправленного действия [10, 27, 64, 73, 82, 88, 92, 111]. Это связанно с условиями их существования в водной среде, характеризующейся высоким содержанием соли, низким освещением или полным его отсутствием, высоким давлением и необычно высокими или низкими температурами. Подобные условия жизни обеспечивают отличие морских организмов и их метаболитов, от организмов с земной биологией [170, 204]. Как природные источники они характеризуются не только разнообразием и высокой эффективностью содержащихся в них БАВ, которые зачастую лишены отрицательных свойств, присущих веществам, полученным из традиционных источников, но и широкой и успешно воспроизводимой сырьевой базой [4]. Последнее обстоятельство может оказаться важным при необходимости получения каких-либо определенных химических веществ (белков, полисахаридов, нуклеиновых кислот и т. д.) в промышленном масштабе.

Известно, что нуклеиновые кислоты и, в частности ДНК, обладают иммуностимулирующими свойствами [123]. На сегодняшний день иммунотропное действие обнаружено у ДНК из молок осетровых рыб (деринат) и бактериальной ДНК.

В данной работе исследовались иммуномодулирующие и радиозащитные свойства ДНК-содержащих БАВ из морских гидробионтовнДНК и ГГГ. В состав нДНК входит 79,0% ДНК, 7,8% белка, 2,1% липидов и 10,7% водыГГГ — 35,2% ДНК, 54,4% белка, 0,4% липидов и 10,0% воды [42, 10]. Различное содержание ДНК, преобладание в составе ГГГ белка могут обуславливать отличие в степени выраженности эффектов вызываемых исследуемыми веществами.

Необходимо отметить, что существует некоторое сходство между нДНК и деринатом: молекулярная масса составляющей их ДНК, высокий процент ее содержания [5, 42]. нДНК получают из молок лососевых рыб. Она является основным действующим веществом БАД к пище ДНКаС и ДНКаВИТ, разрешенных к использованию [97−98, 116] и широко применяемых населением. Однако механизм действия БАВ нДНК изучен недостаточно полно, что и послужило причиной включения ее в это исследование.

ГГГ, выделяют из гонад гребешка, он получен в лаборатории прикладной биохимии ТИНРО-центра и является новым, не изученным ранее веществом, биологическая активность которого была установлена при проведении скриннингового исследования различных БАВ морского происхождения.

В задачи данного исследования входило изучение влияние нДНК и ГГГ на реакции специфического иммунного ответа. Действие БАВ на гуморальное звено иммунитета оценивалось путем подсчета АОК в селезенке и определения титра гемагглютининов в сыворотке крови интактных мышей.

В результате проведенных экспериментов было установлено, что наиболее значительное повышение количества АОК по сравнению с контролем наблюдалось при введении БАВ в индуктивную фазу гуморального иммунного ответа в дозах 10 и 100 мг/кг. Индекс стимуляции при применении нДНК составил 2,6−2,5. ГГГ оказывал менее выраженное, по сравнению с нДНК, и также преимущественное воздействие на индуктивную (ИС=2,0−1,9) фазу образования АОК. Исследуемые БАВ вызывали незначительное повышение титра сывороточных антител, дозозависимого эффекта при этом практически не отмечалось.

Преимущественное влияние БАВ на индуктивную фазу иммунного ответа может быть обусловлено их влиянием на любой из процессов, протекающих в этот период — активацию (выход клеток из фазы покоя в Sфазу клеточного цикла) или пролиферацию лимфоцитов. Также, представляется возможным, что эффект нДНК и ГГГ опосредуется через действие на Тх2-клетки и выработку ими цитокинов, необходимых для развития этих процессов.

Изучение влияния БАВ на клеточное звено иммунитета проводилось с помощью РБТЛ и реакции ГЗТ. Известно, что активация (бласттрансформация) лимфоцитов является наиболее ранней реакцией лимфоидной ткани на поступление в организм антигена. Эта реакция представляет собой начальный этап иммунного ответа и имеет большое значение для его развития, так как изначально число клеток, составляющих клоны лимфоцитов, невелико [138].

С помощью РБТЛ было установлено, что нДНК и ГГГ обладают способностью стимулировать спонтанную и митогениндуцированную пролиферацию Т-лимфоцитов. Этот эффект БАВ является дозозависимымнаиболее выраженное действие наблюдалось при их введении в дозе 10 и 100 мг/кг. нДНК практически одинаково увеличивала как спонтанную (ИС=1,8), так и митогениндуцированную пролиферативную (1,6−1,8) активность лимфоцитов. ГГГ в большей степени повышал уровень спонтанной (ИС=2,0−1,9) и в меньшей степени (ИС=1,5−1,6) митогениндуцированнои пролиферации лимфоидных клеток.

В основе реакции ГЗТ лежит иммунное воспаление, в развитии которого основную роль играют активированные макрофаги. Сенсибилизированные С04±Т-клетки осуществляют вовлечение макрофагов в реакцию путем их активации. Известно, что реакция ГЗТ протекает в 2 фазы — индуктивную и эффекторную, которые развиваются в результате введения сенсибилизирующей и разрешающей доз антигена [138].

Наибольшая эффективность при введении БАВ наблюдалась при дозе 10 мг/кг. нДНК оказывала более выраженное действие на индуктивную фазу ГЗТ, при введении за 3-е суток (ИС=1,8) и за сутки (ИС=1,7) до сенсибилизирующей дозы тимусзависимого антигена (ЭБ). Применение ГГГ обеспечивало наибольший прирост массы лапки у мышей как при введении одновременно с сенсибилизирующей дозой ЭБ (ИС=1,8), так и перед введением разрешающей дозы ЭБ (ИС=1,6), то есть и в индуктивную и в эффекторную фазу.

Усиление реакции ГЗТ, наблюдаемое в 1-ю фазу клеточного иммунного ответа может быть обусловлено влиянием БАВ на процессы активации СБ4±Т-клеток и дифференцировки их в Txl. В свою очередь, действие ГГГ на эффекторную фазу ГЗТ, может опосредоваться через стимуляцию Txl к выработке цитокинов и индуцирование процесса активации макрофагов.

Стимулирующее воздействие БАВ' на гуморальное и клеточное звено иммунитета коррелировало с их влиянием на массу и клеточность лимфоидных органов, вызывая повышение этих показателей у интактных мышей, что может быть обусловлено стимуляцией под действием' БАВ процессов пролиферации и дифференцировки Ви Т-лимфоцитов.

С точки зрения современной иммунологии острая лучевая болезнь (ОЛБ) также представляет собой вторичный иммунодефицит панцитопенического типа. Для н§ го характерны: массовая гибель лимфоцитов (в большей степени В-клеток) — повреждение СКК костного мозга и связанное с этим медленное восстановление клеточного пулапоражение гуморального звена иммунитета, развитие дисфункции тимуса и дисбаланс Тх1/Тх2, в результате чего первоначально развивается нарушение антибактериальной защиты, а в более поздние сроки противоопухолевой и противовирусной резистентности [14, 35, 104].

Исходя из роли системы иммунитета в механизме развития лучевого поражения организма, разработаны принципы профилактики и лечения ОЛБ с помощью иммунотропных лекарственных средств [35]. Еще в 60-х годах прошлого столетия было обнаружено, что нуклеиновые кислоты, в том числе.

ДНК, обладают противолучевым действием и эффективны в широком диапазоне доз облучения [7, 24, 118]. Было проведено множество экспериментов, посвященных изучению радиозащитных свойств ДНК, которые связывали только с ее непосредственным влиянием на стволовые клетки костного мозга и гемопоэз, возможность иммуноопосредованного действия не рассматривалась. Первоначально в экспериментах в основном о о применялась высокополимерная (1,2×10 -2×10 кДа) ДНК и именно с молекулярной массой исследователи связывали ее радиозащитный эффект. Однако, как было показано Н. И. Рябченко и др. [112] и Е. Е. Чеботаревым и др. [127], низкомолекулярная (2×105−5×105 кДа) ДНК также обладает терапевтической эффективностью.

Согласно Ю. И. Касьяненко и др. [93], высокомолекулярная ДНКдорогое вещество, технология ее выделения многостадийна, трудоемка и требует дорогостоящего оборудования и реактивов. В связи с этим у нас я стране и за рубежом она производится в незначительном количестве, как правило, для химико-аналитических целей. В свою очередь, из-за упрощенного технологического процесса выделения, разработанного ученными ТИНРО-центра, низкомолекулярная ДНК является значительно более дешевой и доступной. Кроме того, существует мнение, что для наилучшего проникновения ДНК в клетку ее масса не должна превышать 500 кДа (цитируется по 42).

Радиозащитные свойства нДНК и ГГГ оценивались по их действию на массу и клеточность лимфоидных органов, СКК (метод эндои экзоколониеобразования), выживаемость и среднюю продолжительность жизни у животных, облученных в костно-мозговом диапазоне доз.

По степени угрозы для жизнедеятельности всего организма радиационные повреждения отдельных его тканей и систем не равнозначны. Костный мозг и органы иммунной системы, в первую очередь тимус, являются критическими органами при тотальном облучении организма в костно-мозговом диапазоне доз (1−10 Гр) [14].

Изучение влияния нДНК и ГГГ на кроветворение, массу лимфоидных органов и клеточность костного мозга, тимуса, селезенки и на 1, 3, 9, 14 и 23 сутки после облучения (6,5 Гр) показало, что введение исследуемых БАР способствует более раннему и полному восстановлению этих показателей у животных опытных групп, получавших БАВ.

Усиление регенераторных процессов на тканевом уровне является результатом репаративных процессов на клеточном и субклеточном уровне, непосредственно связанных с генетическим аппаратом клетки, а именно с ДНК.

Эволюционно у живых организмов сформировалась устойчивость к действию повреждающих факторов внешней среды. Одним из ведущих механизмов резистентности к модифицирующему влиянию повреждающих агентов на уровне биологического вида является репарация ДНК. Она обеспечивает защиту генома от генотоксического и мутагенного действия факторов химической и биологической природы [42]. При повреждении структуры ДНК и/или процессов ее репарации развиваются патологические процессы, влияющие на нормальное функционирование органов и систем организма. Так, по мнению Е. Ю. Москалевой и др. [89], причиной развития вторичных иммунодефицитов являются структурные нарушения ДНК лимфоцитов, возникающие под действием различных повреждающих факторов. К таким факторам относится и радиация.

Особенность биологического действия ионизирующей радиации состоит в том, что оно реализуется через образование радиационноиндуцируемых радикалов кислорода и воды, главными мишенями которых являются ДНК, хромосомы, мембраны [14, 69]. Наиболее радиопоражаемыми являются клетки, находящиеся в фазе митотического цикла.

Радиационные дефекты ДНК инициируются многочисленными радиационно-химическими реакциями по механизму прямого и косвенного действия излучения, а также токсическим действием высокореакционных продуктов хиноидной природы [14, 60]. Такие повреждения ДНК проявляются в виде изменений азотистых оснований, однои двунитевых разрывов ДНК, щелочнолабильных сайтов, сшивок ДНК-белок и межи внутримолекулярных сшивок [14].

Репаративный синтез ДНК — одно из фундаментальных явлений в поддержании клеточных популяций. Клетки в S-фазе клеточного цикла, особенно в ее начале, наиболее чувствительны к действию ионизирующей радиации по показателю задержки деления [190, 246]. Другое последствие радиационного нарушения репликации ДНК — так называемый неполный ее биосинтез [190] непосредственно связан с остановкой деления клеток в фазе g2 и их гибелью [184].

Тяжесть и исход лучевой болезни при костно-мозговом синдроме ОЛБ напрямую зависят от степени и характера поражения стволовых элементов клеточных популяций. Эквивалентом СКК условно, так как тождественность их не установлена, считают колониеобразующие единицы в селезенке (КОЕс) облученных мышей [85].

В данной работе для изучения влияния БАВ на КОЕс использовались методы эндои экзоколониеобразования [250−252]. Было установлено, что нДНК и ГГГ значительно стимулируют образование колоний в селезенках облученных мышей, что наблюдалось как при профилактической, так и при лечебной схеме введения, однако при использовании последней это действие было более выраженным. Оно имело дозозависимый характер и в большей степени проявлялось при введении нДНК (ИС=2,2) и ГГГ (ИС=2,1) в дозе 10 мг/кг. Также было установлено, что БАВ обладают способностью выводить СКК из фазы покоя в S-фазу клеточного цикла с последующей клеточной репликацией. При исследовании влияния биополимеров на способность ККМ формировать КОЕ-ГМ, БОЕ-Э и КОЕ-ГЭММ-колонии было установлено, что под действием нДНК наблюдается стимуляция (ИС=8,7) преимущественно эритроидных клеток-предшественников. Под действием в 2,9 раза ГГГ повышалось количество КОЕ-ГЭММ.

Таким образом, введение исследуемых БАВ вызывает активацию СКК, обеспечивающую усиление процессов пролиферации и дифференцировки гемопоэтических клеток-предшественников. Согласно данным литературы такое действие можно объяснить возможным усвоением экзогенной ДНК тканями и клетками облученного организма и использованием ее в процессе пострадиационного восстановления [46, 74, 105] в качестве предшественников для синтеза собственной ДНК клеток [46]. Тем самым ДНК-содержащие БАВ оказывают стимулирующее действие на репродуктивную функцию клеток, сокращая период митотического блока, и способствуют более ранней и быстрой регенерации повреждений тканевых структур. Не исключено, что одним из механизмов радиозащитного действия исследуемых БАВ является связывание радиотоксинов хиноидной природы и предотвращение тем самым их повреждающего действия на геном клеток критических органов [78].

Выживание животного при воздействии на него ионизирующей радиации в костно-мозговом диапазоне доз создает четкую модель радиорезистентного состояния организма [69]. Поэтому, заключение о радиозащитном действии БАВ можно сделать на основании его влияния на выживаемость и среднюю продолжительность жизни животных [40].

При введении различных доз БАВ до и после облучения, наибольшая эффективность наблюдалась при лечебной схеме применения и дозе 10 мг/кг. Установлено, что ГГГ и нДНК при подкожном введении повышали выживаемость облученных животных на 25−30%, при введении per os на 2025% соответственно. Продолжительность жизни облученных мышей при лечебном применении, вне зависимости от способа введения парентерального или перорального, увеличивалась в среднем в 2 раза.

По-видимому, повышение этих показателей под действием БАВ является следствием стимуляции ими репаративных процессов на клеточном и субклеточном уровнях, регенеративных на тканевом уровне, в результате чего в более ранние сроки происходит восстановление массы и клеточности тимуса, селезенки, костного мозга, количества лейкоцитов крови и нормализуются нарушенные функции иммунной и кроветворной систем. То есть, влияние нДНК и ГГГ на основной интегральный показатель радиорезистентности — выживаемость животных в костно-мозговом диапазоне доз — является результатом суммирования различных путей реализации этого механизма.

Известно, что рост и развитие наименее дифференцированных клеток-предшественниц, из которых происходит восстановление кроветворения при облучении в дозах, вызывающих костно-мозговую форму ОЛБ [102], контролируется гемопоэзиндуцирующим микроокружением [29, 131, 188, 259]. Согласно современным представлениям, в формировании ГИМ принимают участие различные клеточные элементы и продукты их жизнедеятельности, входящие в состав как стромы, так и паренхимы кроветворных органов. Контроль над процессами кроветворения элементы ГИМ осуществляют посредством прямых контактов с гемопоэтическими клетками и через продукцию цитокинов [30, 241].

К ранним гемопоэтическим ростовым факторам относят ИЛ-3, ГМ-КСФ, ФНО-а [101]. ИЛ-3 является ростовым и дифференцировочным фактором, регулирующим гемопоэз на уровне стволовых и наиболее ранних предшественников кроветворных клеток. Он представляет собой преимущественно экстренный регулятор кроветворения, проявляющий свое действие при стрессе [44, 138, 198, 202]. ГМ-КСФ поддерживает пролиферацию несколько более дифференцированных, хотя также юных клеток [101, 191, 224]. Точками приложения ГМ-КСФ, как и ИЛ-3, являются мультипотентный предшественник КОЕ-ГЭММ, а также БОЕ-Э [ 142, 191, 224, 248]- ФНО-а на фоне подавленного кроветворения индуцирует выход СКК из фазы Go в S-фазу клеточного цикла [101, 154, 228, 233].

Для интерпретации результатоввсех доноров условно делили на 3 группы (ориентируясь на, исходный уровень продукции цитокинов): с исходногнизкими, со средними и с исходно высокими показателями.

Полученные результаты показали, что нДНК и ГГГ оказывают модулирующее действие на? выработку всех исследованных цитокинов клетками крови здоровых доноров, повышая исходно низкое их содержание, снижая1 исходно высокую и не оказывая существенного влияния при среднем уровне: их концентрации. В группах с исходно низкими показателями БАВ проявляют стимулирующее, но не равнозначное по интенсивности действие на продукцию цитокинов. нДНК и ГГГ вызывают выраженную секрецию ГМ-КСФ (ИС=5,8−9,7) и в меньшей степенивлияют на продукцию клетками крови доноров ИЛ-3 (ИС=4,4−3,2) и ФНО-а (ИС=2,5−3,3). Под действием нДНК наблюдаетсяболее значительное, по сравнению с ШЫО (ИС=Т, 9), повышение уровня ИФН-у (ИС=3,3). Добавление к культуре клеток ГГГ способствует практически равной стимуляции продукции как ИЛ-10, так и ИФН-у (ИС=2,6−2,7).

Эти результаты свидетельствуют о том, что БАВ оказывают более выраженное стимулирующее действие — на продукцию провоспалительных (ФНО-а), нежели противовоспалительных цитокинов (ИЛ-10).

Введение

нДНК обуславливает повышение уровня цитокинов, вырабатываемых преимущественно Txl-клетками (ИФН-у), т. е. может способствовать развитию клеточного иммунного ответа. Напротив, ГГГ оказывает равнозначное действие на выработку цитокинов Txl и Тх2. Аналогично мнению К. Ф. Ким с соав. [17] подобный эффект можно объяснить действием ГГГ не на дифференцировку, а лишь на синтез соответствующих цитокинов.

Сопоставление иммуностимулирующего' действия БАВ: и бактериальной ДНК, позволяет: определить некоторое сходство. Однако, по данным литературы, иммуностимулирующее действие бактериальной ДНК обусловлено наличием ^ в ее структуре неметилированных CpG-динуклеотидов всоставе определенных последовательностей [205, 234]- Подобные GpG-динуклеотиды не обнаружены в ДНК позвоночных, в которойнапротив, присутствуют иммуно-нейтрализующие/иммуносупрессивные мотивы [109]. Исходяиз' этого, можно сделать предположение, что-либо иммуностимулирующий эффект бактериальной ДНК обусловлен не только GpG-динуклеотидами, либо в молекуле ДНК позвоночных существуют свои собственные структуры, ответственные за ее активирующее влияние на иммунную систему. Это делает перспективным' дальнейшее изучение нДНК и 111, их структуры и механизма действия.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что нДНК и ГГГ обладают иммуномодулирующими и радиозащитными свойствами.

Механизм иммуномодулирующего действия обусловлен влиянием исследуемых БАВ на развитие процессов гуморального и клеточного иммунного ответа и продукцию внутрии межсистемных регуляторных факторов — цитокинов.

Противолучевое действие нДНК и ГГГ реализуется через непосредственное участие в репаративных процессах поврежденных радиацией клеток, и, в первую очередь, гемопоэтических стволовых клеток костного мозга. Тем самым, БАВ укорачивают период митотического блока и способствуют более раннему выходу СКК из фазы Go в S-фазу клеточного цикла и стимулируют их дальнейшую пролиферацию и дифференцировку: Результатом является: более быстрая регенерация тканей критических органов — костного мозга и лимфоидных органов и восстановление нормального функционирования гемопоэтической и иммунной систем. Подобный вывод согласуется с данными литературы [7, 118]. Однако, по нашему мнению, механизм радиозащитного действия БАВ помимо непосредственного влияния на пораженные радиацией клетки, может опосредоваться и через иммунную систему — Ви Т-лимфоциты, которые участвуют в регуляции гемопоэза [87]. Важную роль в восстановлении кроветворения облученного организма играют гуморальные факторы, выделяемые тимусом, вероятность участия которых при применении БАВ подтверждает тот факт, [18, 126], что у облученных животных опытных групп наблюдается более значительное, по сравнению с контролем, увеличение массы и клеточности тимуса. Кроме того, радиозащитное действие БАВ может реализовываться и через активацию гемопоэзиндуцирующего микроокружения, и в частности, через стимуляцию продукции ранних гемопоэтических ростовых факторов (ИЛ-3, ГМ-КСФ и ФНО-а). Все это свидетельствует о сложности и многогранности механизма противолучевого действия исследуемых БАВ.

Полученные результаты изучения свойств нДНК позволяют частично раскрыть механизм иммуностимулирующего действия БАД, созданных на ее основе, и расширить область их применения.

Согласно P.M. Хаитову и др. [124], установление иммунодефицита еще не является основанием для назначения иммуномодуляторов. Для обоснованного проведения иммунотерапии необходимо провести клинико-иммунологическое исследование. По его результатам авторы выделяют 3 группы людей: в первую входят лица, имеющие клинические признаки нарушения иммунитета и изменения иммунологических показателейво вторую — лица с клиническими признаками нарушений иммунной системы при отсутствии изменений иммунологических показателейв третью — лица, имеющие только изменения иммунологических показателей без клинических признаков недостаточности иммунной системы. И, если назначение иммуномодулирующей терапии однозначно показано в первых 2-х группах, то третьей рекомендован только иммунологический мониторинг. Представляется возможным, что применение ДНК-содержащих БАД у этой группы лиц, особенно при нарушении клеточного звена иммунитета, будет способствовать восстановлению нарушенных иммунологических показателей и предотвратит дальнейшее развитие иммунодефицита.

Экспериментально установлено, что нДНК не только оказывает радиозащитное действие, но и обладает способностью стимулировать развитие преимущественно клеточного иммунного ответа, что может предотвратить возникновение дефицита Тх1 в поздние сроки после облучения [128]. Это позволяет рекомендовать ДНК-содержащие БАД при радиационном поражении (не превышающем костно-мозговой диапазон доз) — у групп радиационного риска (персонал ремонтных подразделений атомных электростанций, рабочие урановых рудников и предприятий по переработке урановых руд, врачи рентгенологи, радиологи и т. д.) — и обосновывает их применение у онкологических больных, получающих радиотерапию.

Кроме того, ДНК-содержащие БАД могут быть использованы: о для профилактики различных заболеваний, и, в частности, в периоды сезонного повышения заболеваемости ОРВИ, в целях укрепления общей резистентности организма и повышения его сопротивляемости к инфекциио на этапах выздоровления, для устранения астенического синдрома и повышения адаптационных механизмов организма.