Помощь в написании студенческих работ
Антистрессовый сервис

Клонирование генов вне клетки

Диссертация: Клонирование генов вне клетки
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

На примере кДНК гена люциферазы светляка Luciola mingrelica продемонстрирована возможность бесклеточного клонирования и последующего размножения in vitro индивидуальных последовательностей из библиотеки кДНК. Показано, что клонирование может быть осуществлено с использованием генетического материала, эквивалентного содержанию всего одной клетки. Данная работа была выполнена в Лаборатории биохимии… Читать ещё >

Клонирование генов вне клетки (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Содержание

  • Использованные сокращения.- б
  • ВВЕДЕНИЕ
  • 1. Обзор литературы
    • 1. 1. Подходы in vivo (методы, использующие клетки)
      • 1. 1. 1. Фаговый дисплей
      • 1. 1. 2. Дисплей на поверхности клеток
  • Ф 1.1.3. «Пептиды на плазмидах»
    • 1. 1. 4. Преимущества и недостатки дисплеев in vivo
    • 1. 2. Подходы in vitro (бесклеточные методы)
    • 1. 2. 1. Дисплеи, где белок связан с РНК
      • 1. 2. 1. 1. Нековалентная связь мРНК с белком
      • 1. 2. 1. 2. Ковалентная связь мРНК с белком
      • 1. 2. 2. Дисплеи, где белок связан с ДНК
      • 1. 2. 3. In vitro компартментализация
      • 1. 2. 3. 1. Простая эмульсия
      • 1. 2. 3. 2. Двойная эмульсия
      • 1. 2. 3. 3. Особенности метода in vitro компартментализации
      • 1. 2. 4. Преимущества и недостатки дисплеев in vitro
  • 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
    • 2. 1. Штаммы E. coli и плазмиды
      • 2. 1. 1. Штаммы E. col
      • 2. 1. 2. Плазмиды
    • 2. 2. Микробиологические среды. ь
    • 2. 3. Трансформация клеток E. col
    • 2. 4. Выделение и очистка плазмидной ДНК
      • 2. 4. 1. Грубое выделение плазмидной ДНК
      • 2. 4. 2. Очистка плазмидной ДНК при помощи кипячения в присутствии
  • Мд2+ и Трис-HCI (рН 9,0)
    • 2. 4. 3. Фенольная депротеинизация ДНК
    • 2. 5. Выделение РНК из светляка Luciola mingrelica
    • 2. 6. Электрофорез нуклеиновых кислот и белков
    • 2. 6. 1. Электрофорез ДНК и РНК в агарозных гелях. ф 2.6.2. Электрофорез ДНК и РНК в полиакриламидных гелях
      • 2. 6. 2. 1. В денатурирующих условиях
      • 2. 6. 2. 2. В неденатурирующих условиях
      • 2. 6. 3. Электрофорез белков в присутствии додецилсульфата натрия
    • 2. 7. Саузерн-блот анализ
      • 2. 7. 1. Перенос ДНК из геля на мембрану
      • 2. 7. 2. Гибридизация с меченым зондом
    • 2. 8. Определение концентрации белка
    • 2. 9. Выделение и очистка термостабильных ДНК-зависимых ДНК-полимераз
      • 2. 9. 1. Получение препарата (Н1з)б-Риго-полимеразы
      • 2. 9. 2. Получение препарата (Ыэ^-Гад-полимеразы
    • 2. 10. Ферментативные реакции
      • 2. 10. 1. Рестрикция
      • 2. 10. 2. Обратная транскрипция (синтез кДНК)
      • 2. 10. 3. Транскрипция
      • 2. 10. 4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
    • 2. 11. Получение экстракта зародышей пшеницы
      • 2. 11. 1. Обработка зародышей пшеницы перед разрушением
      • 2. 11. 2. Разрушение зародышей пшеницы
      • 2. 11. 3. Гель-фильтрация экстракта зародышей пшеницы
    • 2. 12. Совмещенная транскрипция-трансляция in vitro
      • 2. 12. 1. Транскрипция-трансляция в системе на основе экстракта S30 E. col
      • 2. 12. 2. Транскрипция-трансляция в системе на основе экстракта зародышей пшеницы
    • 2. 13. Метод молекулярных колоний
      • 2. 13. 1. Подготовка полиакриламидных гелей
      • 2. 13. 2. Полимеразная цепная реакция в геле
      • 2. 13. 3. Транскрипция в геле
      • 2. 13. 4. Совмещенная транскрипция-трансляция в геле
      • 2. 13. 5. Обнаружение колоний ДНК и РНК
        • 2. 13. 5. 1. Перенос нуклеиновых кислот из геля на мембрану
        • 2. 13. 5. 2. Гибридизация с меченым зондом
      • 2. 13. 6. Детекция белков, синтезированных в геле
        • 2. 13. 6. 1. Детекция по включению радиоактивной метки
        • 2. 13. 6. 2. Детекция флуоресценции GFP
  • 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
    • 3. 1. Цели и экспериментальные задачи
    • 3. 2. Разработка ПЦР-версии метода молекулярных колоний
      • 3. 2. 1. Выбор иммобилизованной среды
      • 3. 2. 2. Смесь термостабильных ДНК-полимераз
      • 3. 2. 3. Эффективность переноса днк из геля на мембрану
      • 3. 2. 4. Размножение генов обелина и GFP в виде молекулярных колоний
    • 3. 3. Клонирование in vitro «ДНК люциферазы
      • 3. 3. 1. Синтез и размножение кДНК люциферазы в жидкой среде и в геле
      • 3. 3. 2. Отбор и размножение молекулярных клонов
    • 3. 4. Транскрипция в молекулярных колониях
    • 3. 5. Синтез белка в молекулярных колониях
      • 3. 5. 1. Выбор системы транскрипции-трансляции
      • 3. 5. 2. Транскрипция-трансляция в геле
      • 3. 5. 3. Проблема несовместимости условий ПЦР и транскрипции-трансляции и ее решение
      • 3. 5. 4. Экспрессия гена GFP в молекулярных колониях
  • 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
    • 4. 1. Истинно молекулярное клонирование генов
      • 4. 1. 1. Преимущества бесклеточного клонирования
      • 4. 1. 2. Ген люциферазы: от светляка до индивидуальных молекулярных клонов
    • 4. 2. Экспрессия генов в молекулярных колониях
      • 4. 2. 1. Новая разновидность генетического дисплея
      • 4. 2. 2. Универсальный способ смены реакционной среды в геле
    • 4. 3. Перспективы развития метода клонирования генов вне клетки
      • 4. 3. 1. Методы детекции молекулярных колоний
      • 4. 3. 2. Изотермические системы размножения генов
      • 4. 3. 3. Использование бесклеточной системы экспрессии, собранной из очищенных компонентов
  • ВЫВОДЫ
  • Цитированная
  • литература
  • Использованные сокращения бисакриламид — N. N'-метиленбисакриламид БСА — бычий сывороточный альбумин
  • Да — дальтон — единица молекулярной массы, равная массе атома водорода
  • ДНК — 2-дезоксирибонуклеиновая кислота кДНК- ДНК-копия РНК
  • ПЦР — полимеразная цепная реакция
  • РНК — рибонуклеиновая кислота
  • Трис- трис (оксиметил)аминометан
  • ТХУ — трихлоруксусная кислота
  • А — аденин или остаток адениловой кислоты
  • С — цитозин или остаток цитидиловой кислоты
  • DTT — дитиотрейтол dNTP — дезоксирибонуклеозид-5-трифосфаты (N = А, С, G, Т)
  • EDTA — этилендиамин-Ы.М.Ы'.М'-тетрауксусная кислота
  • G — гуанин или остаток гуаниловой кислоты
  • GFP — зеленый флуоресцирующий белок
  • HEPES — М-2-оксиэтилпиперазин-1Г-2-этансульфоновая кислота
  • I. PTG — изопропилтиогалактопиранозид
  • NTP — рибонуклеозид-5-трифосфаты
  • PMSF — параметилсульфонилфторид
  • SDS — додецилсульфат натрия
  • Т-тимин или остаток тимидиловой кислоты
  • TEMED — М. М^'.М'-тетраметилэтилендиамин
  • U -урацил или остаток уридиловой кислоты

На сегодняшний момент все большее применение находят и большее значение приобретают методы in vitro. По сравнению с подходами in vivo, они имеют существенные преимущества: позволяют исследователю в большей степени менять и контролировать условия эксперимента, они быстрее и их проще автоматизировать, они позволяют избежать ограничений, накладываемых живыми клетками и векторами, соответственно, здесь меньше выражен естественный отбор и, наконец, они позволяют работать с большим разнообразием последовательностей нуклеиновых кислот и белков.

Однако среди всего многообразия подходов in vitro нет метода, который позволил бы провести экспрессию наборов РНК и ДНК, их скрининг по свойствам синтезированного продукта и в результате получить индивидуальные последовательности (то есть выделить клоны).

Необходимо отметить, что к настоящему моменту все же описан ряд экспериментальных бесклеточных подходов, с использованием которых в принципе возможно получить индивидуальные клоны. Эти подходы основаны на той идее, что если сильно разводить экспериментальный образец, то рано или поздно в одном сортировочном компартменте (это может быть, например, реакционная ячейка, элемент микрочипа, микрошарик или капля водно-масляной эмульсии) окажется единичная молекула исследуемой библиотеки. Однако это вовсе не означает, что результатом такой селекции всегда будет истинный молекулярный клон, и сами разработчики этих методов вынуждены в каждом случае проверять чистоту полученных клонов при помощи обычного клонирования с использованием векторов и живых клеток.

Истинные молекулярные клоны можно получить in vitro с помощью метода молекулярных колоний (Четверин и Четверина, 1998), экспоненциально размножая нуклеиновые кислоты в пластинке геля. В результате потомство каждой исходной молекулы концентрируется в ограниченной зоне вокруг родительской молекулы, образуя колонию. Такая колония по сути и является молекулярным клоном. Ранее в нашей лаборатории была продемонстрирована возможность клонировать таким образом молекулы РНК, размножая их с помощью QP репликазы (Chetverina & Chetverin, 1993).

Целью данной работы было создание версии метода молекулярных колоний, позволяющей клонировать молекулы ДНК, в том числе целые гены, а также разработка метода экспрессии генов в молекулярных колониях.

Данная работа была выполнена в Лаборатории биохимии вирусных РНК Института белка РАН. Автор искренне благодарит сотрудников Лаборатории Е. В. Четверину, В. И. Угарова, М. В. Фалалееву, З. В. Валину, Е. А. Узлову и технический персонал за помощь в планировании и проведении экспериментов, обучение и критическое обсуждение результатов.

Автор благодарен Е. С. Высоцкому (Институт биофизики, Красноярск), В. Н. Ксензенко (Институт белка РАН), С. Дабровски и Й. Куру (Технический университет Гданьска, Польша), а также Н. Н. Угаровой (Московский Государственный Университет) за предоставление генетического материала, использованного в работе.

Автор признателен Л. А. Шалойко (филиал Института биоорганической химии РАН, Пущино), В. А. Яшину (Институт биофизики клетки РАН, Пущино), а также сотрудникам Института белка РАН А. А. Минину и В. А. Широкову за помощь в проведении некоторых предварительных экспериментов.

Особую признательность автор выражает своему научному руководителю А. Б. Четверину за искренний интерес, постоянное внимание и прекрасную школу научной работы.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ДИСПЛЕИ.

— 101 -выводы.

1. Разработана ПЦР-версия метода молекулярных колоний. Найдены условия для размножения полноразмерных генов (свыше 1500 пар оснований) в виде колоний ДНК, содержащих до 100 миллионов копий исходной матрицы. Таким образом, впервые осуществлено истинно молекулярное клонирование генов.

2. На примере кДНК гена люциферазы светляка Luciola mingrelica продемонстрирована возможность бесклеточного клонирования и последующего размножения in vitro индивидуальных последовательностей из библиотеки кДНК. Показано, что клонирование может быть осуществлено с использованием генетического материала, эквивалентного содержанию всего одной клетки.

3. Осуществлена транскрипция генов в молекулярных колониях с выходом не менее 10 РНК-копий длиной 1700 нуклеотидов на молекулу ДНК. Разработанный метод может быть использован для прямой селекции РНК с заданными свойствами, таких как рибозимы и аптамеры.

4. Осуществлена экспрессия (транскрипция и трансляция) генов в молекулярных колониях с выходом около 10 копий белка на молекулу ДНК. На примере гена зеленого флуоресцирующего белка (GFP) продемонстрировано, что синтезированный в молекулярных колониях белок является функционально активным. Разработанный метод может быть использован для скрининга генов по функции кодируемого белка. Также, поскольку синтезированный белок находится в той же колонии, что и кодирующий его ген, метод может быть использован в качестве альтернативы фаговому и иным формам генетического дисплея.

Показать весь текст

Список литературы

  1. В.В., Аковбян Н. А., Ефременко Е. Н., Варфоломеев С.Д., Вржещ
  2. П.В. (2001) Кинетический анализ созревания и денатурации красного флуоресцентного белка DsRed. Биохимия, т.66 (12), с.1656−1667.
  3. А.Б., Четверина Е. В. (1998) Способ клонирования нуклеиновыхкислот. Патент РФ № 2 114 175.
  4. Agterberg, М., Adriaanse, Н., van Bruggen, A., Karperien, М. and Tommassen, J.1990) Outer-membrane PhoE protein of Escherichia coli K-12 as an exposure vector: possibilities and limitations. Gene 88:37−45.
  5. Alberts, В., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. and Watson, J.D. (1994)
  6. Molecular Biology of the Cell. 3rd edn. Garland Publishing, NY
  7. Alimov, A.P., Khmelnitsky, A.Yu., Simonenko, P.N., Spirin, A.S. and Chetverin,
  8. A.B. (2000) Cell-free synthesis and affinity isolation of proteins on a nanomole scale. BioTechniques 28:338−344.
  9. Amstutz, P., Pelletier, J.N., Guggisberg, A., Jermutus, L., Cesaro-Tadic, S.,
  10. Zahnd, C. and Pluckthun, A. (2002) In vitro selection for catalytic activity with ribosome display. J. Am. Chem. Soc. 124:9396−9403.
  11. Aruffo, A. and Seed, B. (1987) Molecular cloning of a CD28 cDNA by a highefficiency COS cell expression system. Proc. Natl Acad. Sci. USA 84:85 738 577.
  12. Bernath, K., Hai, M., Mastrobattista, E., Griffiths, A.D., Magdassi, S. and Tawfik,
  13. Birnboim, H.C. and Doly, J. (1979) A rapid alkaline extraction procedure forscreening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7:1513−1523.
  14. Boder, E.T. and Wittrup, K.D. (1997) Yeast surface display for screeningcombinatorial polypeptide libraries. Nat. Biotechnol. 15:553−557.
  15. Brunet, E., Chauvin, C., Choumet, V. and Jestin, J.-L. (2002) A novel strategy forthe functional cloning of enzymes using filamentous phage display: the case of nucleotidyl transferases. Nucleic Acids Res. 30: E40.
  16. Chen, L., MacMillan, A.M., Chang, W., Ezaz-Nikpay, K., Lane, W.S. and
  17. , G.L. (1991) Direct identification of the active-site nucleophile in a DNA (cytosine-5)-methyltransferase. Biochemistry 30:11 018−11 025.
  18. Chen, W. and Georgiou, G. (2002) Cell-surface display of heterologous proteins: from high-throughput screening to environmental applications. Biotechnol. Bioeng. 79:496−503.
  19. Chen, Y. (2003) Novel approach to generate human monoclonal antibodies by
  20. PROfusion™ Technology. Cambridge Healthtech Institute 4th Annual Conference on Recombinant Antibodies, Cambridge, MA, USA.
  21. Chetverina, H.V. and Chetverin, A.B. (1993) Cloning of RNA molecules in vitro.
  22. Nucleic Acids Res. 21:2349−2053.
  23. Chetverina, H.V., Samatov, T.R., Ugarov, V.I. and Chetverin, A.B. (2002)
  24. Molecular colony diagnostics: detection and quantitation of viral nucleic acids by in-gel PCR. BioTechniques 33: 150−157.
  25. Cohen, H.M., Tawfik, D.S. and Griffiths, A.D. (2004) Altering the sequencespecificity of Haelll methyltransferase by directed evolution using in vitro compartmentalization. Protein Eng. Des. Sel. 17:3−11.
  26. , J. (1991) Nucleic acid sequence-based amplification. Nature, 350:9192.
  27. Cormack, B.P., Valdivia, R.H. and Falkow, S. (1996) FACS-optimized mutants ofthe green fluorescent protein (GFP). Gene 173:33−38.
  28. Cull, M.G., Miller, J.F. and Schatz, P.J. (1992) Screening for receptor ligandsusing large libraries of peptides linked to the С terminus of the lac repressor. Proc. Natl Acad. Sci. USA 89:1865−1869.
  29. Dabrowski, S. and Kur, J. (1998) Cloning and expression in Escherichia coli ofthe recombinant His-tagged DNA polymerases from Pyrococcus furiosus and Pyrococcus woesei. Protein Expr. Purif. 14:131−138.
  30. Doi, N., Kumadaki, S., Oishi, Y., Matsumura, N. and Yanagawa, H. (2004) Invitro selection of restriction endonucleases by in vitro compartmentalization. Nucleic Acids Res. 32: E95.
  31. Ernst, W., Grabherr, RM Wegner, D., Borth, N. Grassauer, A. and Katinger, H.1998) Baculovirus surface display: construction and screening of a eukaryotic epitope library. Nucleic Acids Res. 26:1718−1723.
  32. De Figueiredo, P., Roberts, R.L. and Nester, E.W. (2004) DARTs: A DNA-basedin vitro polypeptide display technology. Proteomics 4:3128−3140.
  33. Fletcher, G., Mason, S., Terrett, J. and Soloviev, M. (2003) Self-assembly ofproteins and their nucleic acids. J. Nanobiotechnology 1:1.
  34. Francisco, J.A., Earhart, C.F. and Georgiou, G. (1992) Transport and anchoringof (3-lactamase to the external surface of Escherichia coii. Proc. Natl Acad. Sci. USA 89:2713−2717.
  35. Fraser, Т.Н. and Rich, A. (1973) Synthesis and aminoacylation of 3'-amino-3'deoxy transfer RNA and its activity in ribosomal protein synthesis. Proc. Natl Acad. Sci. USA 70:2671−2675.
  36. Gates, C.M., Stemmer, W.P.C., Kaptein, R. and Schatz, P.J. (1996) Affnityselective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor «headpiece dimer». J. Mol. Biol. 255:373−386.
  37. , G. (2000). Analysis of large libraries of protein mutants using flowcytometry. Adv. Protein Chem. 55, 293−315.
  38. Georgiou, G., Stathopoulos, C., Daugherty, P. S., Nayak, A.R., Iverson, B.L. and
  39. Curtiss III, R. (1997) Display of heterologous proteins on the surface ofmicroorganisms: from the screening of combinatorial libraries to live recombinant vaccines. Nat. Biotechnol. 15:29−34.
  40. Ghadessy, F.J., Ong, J.L. and Holliger, P. (2001) Directed evolution ofpolymerase function by compartmentalized self-replication. Proc. Natl Acad. Sci. USA 98:4552−4557.
  41. Ghadessy, F.J., Ramsay, N. Boudsocq, F., Loakes, D., Brown, A., Iwai, S.,
  42. Vaisman, A., Woodgate, R. and Holliger, P. (2004) Generic expansion of the substrate spectrum of a DNA polymerase by directed evolution. Nat. Biotechnol. 22:755−759.
  43. Griffiths, A.D. and Tawfik, D.S. (2003) Directed evolution of an extremely fastphosphotriesterase by in vitro compartmentalization. EMBO J. 22:24−35.
  44. Guatelli, J.C., Whitfield, K.M., Kwoh, D.Y., Barringer, K.J., Richman, D.D. and
  45. , T.R. (1990) Isothermal, in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication. Proc. Natl Acad. Sci. USA 87:1874−1878.
  46. Gunneriusson, E., Samuelson, P., Ringdahl, J., Gronlund, H., Nygren, P.-A. and
  47. , S. (1999) Staphylococcal surface display of immunoglobulin A (IgA)-and IgE-specific in w’fro-selected binding proteins (affibodies) based on Staphylococcus aureus Protein A. Appl. Environ. Microbiol. 65:4134−4140.
  48. Hammond, P.W., Alpin, J., Rise, C.E., Wright, M. and Kreider, B.L. (2001) Invitro selection and characterization of Bcl-X (L)-binding proteins from a mix of tissue-specific mRNA display libraries. J. Biol. Chem. 276:20 898−20 906.
  49. , H.R. (2005) Selecting and screening recombinant antibodylibraries. Nat. Biotechnol. 23:1105−1116.
  50. Huang, W., Petrosino, J. and Palzkill, T. (1998) Display of functional |3-lactamaseinhibitory protein on the surface of M13 bacteriophage. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 42:2893−2897.
  51. , G.L. (1983) A silver stain for the detection of nanogram amounts of tRNAfollowing two-dimensional electrophoresis. Anal. Biochem. 134:184−188.
  52. Illarionov, B.A., Bondar, V.S., lllarionova, V.A. and Vysotski, E.S. (1995)
  53. Sequence of the cDNA encoding the Ca2±activated photoprotein obelin from the hydroid polyp Obelia longissima. Gene 153:273−274.
  54. Illarionov, B.A., Frank, L.A., lllarionova, V.A., Bondar, V.S., Vysotski, E.S. and
  55. , J.R. (2000) Recombinant obelin: cloning and expression of cDNA, purification, and characterization as a calcium indicator. Methods Enzymol. 305:223−249.
  56. Isticato, R., Cangiano, G., Tran, H.T., Ciabattini, A., Medaglini, D., Oggioni, M.R.,
  57. De Felice, M., Pozzi, G. and Ricca, E. (2001) Surface display of recombinant proteins on Bacillus subtilis spores. J. Bacteriol. 183:6294−6301.
  58. Jung, H.C., Lebeault, J.M. and Pan, J.G. (1998) Surface display of Zymomonasmobilis levansucrase by using the ice-nucleation protein of Pseudomonas syringae. Nat. Biotechnol. 16:576−580.
  59. Kim, D.M., Kigawa, Т., Choi, C.Y. and Yokoyama, S. (1996) A highly efficientcell-free protein synthesis system from Escherichia coli. Eur J Biochem. 239:881−886.
  60. , D.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of thehead of Bacteriophage T4. Nature 227:680−685.
  61. Leemhuis, H., Stein, V., Griffiths, A.D. and Hollfelder, F. (2005) New genotypephenotype linkages for directed evolution of functional proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 15:472−478.
  62. Lindner, P., Guth, В., WQIfing, C., Krebber, C., Steipe, В., Muller, F. and
  63. , A. (1992) Purification of native proteins from the cytoplasm and periplasm of E.coli using IMAC and histidine tails: a comparison of proteins and protocols. Methods 4:41−56.
  64. Liu, R., Barrick, J.E., Szostak, J.W. and Roberts, R.W. (2000) Optimizedsynthesis of RNA-protein fusions for in vitro protein selection. Methods Enzymol. 318:268−293.
  65. Lizardi, P.M., Huang, X., Zhu, Z., Bray-Ward, P., Thomas, D.C. and Ward, D.C.1998) Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nat. Genet. 19:225−232.
  66. Lowry, O.H., Rosenbrough, N.J., Farr, A.L. and Randall, R.J. (1951) Proteinmeasurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265−275.
  67. Madin, K., Sawasaki, Т., Ogasawara, T. and Endo, Y. (2000) A highly efficientand robust cell-free protein synthesis system prepared from wheat embryos:
  68. Plants apparently contain a suicide system directed at ribosomes. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97:559−564.
  69. Maruyama, I.N., Maruyama, H.I. and Brenner, S. (1994) Afoo: А Л phage vectorfor the expression of foreign proteins. Proc. Natl Acad. Sci. USA 91:82 738 277.
  70. Masai, H. and Arai, K. (1988) RepA protein- and oriR-dependent initiation of R1plasmid replication: identification of a rho-dependent transcription terminator required for cis-action of repA protein. Nucleic Acids Res. 16:6493−6514.
  71. Mastrobattista, E., Taly, V., Chanudet, E., Treacy, P., Kelly, B.T. and Griffiths,
  72. A.D. (2005) High-throughput screening of enzyme libraries: in vitro evolution of a (3-galactosidase by fluorescence-activated sorting of double emulsions. Chem. Biol. 12:1291−1300.
  73. Mattheakis, L.C., Bhatt, R.R. and Dower, W.J. (1994) An in vitro polysomedisplay system for identifying ligands from very large peptide libraries. Proc. Natl Acad. Sci. USA 91:9022−9026.
  74. Merryman, C., Weinstein, E., Wnuk, S.F. and Bartel, D.P. (2002) A bifunctionaltRNA for in vitro selection. Chem. Biol. 9:741−746.
  75. Milligan, J.F., Groebe, D.R., Witherell, G.W. and Uhlenbeck, O.C. (1987)
  76. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Res. 15:8783−8798.
  77. Monro, R.E. and Vazquez, D. (1967) Ribosome-catalysed peptidyl transfer: effects of some inhibitors of protein synthesis. J. Mol. Biol. 28:161−165.
  78. Notomi, Т., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, Т., Watanabe, K., Amino,
  79. N. and Hase, T. (2000) Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28: E63.
  80. Odegrip, R., Coomber, D., Eldridge, В., Hederer, R" Kuhlman.'P.A., Ullman, C.,
  81. FitzGerald, K. and McGregor, D. (2004) CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes. Proc. Natl Acad. Sci. USA 101:2806−2810.
  82. Pavlov, M.Y. and Ehrenberg, M. (1996) Rate of translation of natural mRNAs inan optimized in vitro system. Arch. Biochem. Biophys. 328:9−16.
  83. Patnaik, R. and Swartz, J.R. (1998) E. coli-based in vitro transcription/translation:in wVo-specific synthesis rates and high yields in a batch system. BioTechniques 24:862−868.
  84. Pedersen, H., Holder, S., Sutherlin, D.P., Schwitter, U., King, D.S. and Schultz,
  85. P.G. (1998) A method for directed evolution and functional cloning of enzymes. Proc. Natl Acad. Sci. USA 95:10 523−10 528.
  86. , J.M. (1984) in: Hemes, B.D. and Higgins, S.J., Eds, 179−209, IRL Press, 1. Oxford.
  87. Reiersen, H., Lobersli, I., Loset, G.A., Hvattum, E., Simonsen, В., Stacy, J.E.,
  88. McGregor, D., FitzGerald, K., Welschof, M., Brekke, O.H. and Marvik, O.J. (2005) Covalent antibody display-an in vitro antibody-DNA library selection system. Nucleic Acids Res. 33: E10.
  89. Ren, Z.J., Lewis, G.K., Wingfield, P.T., Locke, E.G., Steven, A.C. and Black,
  90. W. (1996) Phage display of intact domains at high copy number: a systembased on SOC, the small outer capsid protein of bacteriophage T4. Protein Sci. 5:1833−1843.
  91. Robert, A., Samuelson, P., Andreoni, C., Bachi, Т., Uhlen, M., Binz, H., Nguyen,
  92. T.N. and Stahl, S. (1996) Surface display on staphylococci: a comparative study. FEBS Lett. 390:327−333.
  93. Roberts, R.W. and Ja, W.W. (1999) In vitro selection of nucleic acids andproteins: What are we learning? Curr. Opin. Struct. Biol. 9:521−529.
  94. Roberts, R.W. and Szostak, J.W. (1997) RNA-peptide fusions for the in vitroselection of peptides and proteins. Proc. Natl Acad. Sci. USA 94:1 229 712 302.
  95. Rosenberg, A., Griffin, K., Studier, F.W., McCormick, M., Berg, J., Novy, R. and
  96. , R. (1996) T select phage display system: a powerful new protein display system based on the bacteriophage T7. Innovations 6:1−6.
  97. Ryabova, L.A., Desplancq, D., Spirin, A.S. and Pliickthun, A. (1997) Functionalantibody production using cell-free translation: effects of protein disulfide isomerase and chaperones. Nat. Biotechnol. 15:79−84.
  98. Ryabova, L.A., Vinokurov, L.M., Shekhovtsova, E.A., Alakhov, Yu.B. and Spirin,
  99. A.S. (1995) Acetyl phosphate as an energy source for bacterial cell-free translation systems. Anal. Biochem. 226:184−186.
  100. Saiki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Scharf, S.J., Higuchi, R., Horn, G.T.,
  101. Mullis, K.B. and Erlich, H.A. (1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239:487−491.
  102. Samatov, T.R., Chetverina, H.V. and Chetverin A.B. Real-time monitoring of
  103. DNA colonies growing in a polyacrylamide gel. Anal. Biochem. in press.
  104. Sawata, S.Y. and Taira, K. (2003) Modified peptide selection in vitro byintroduction of a protein-RNA interaction. Protein Eng. 16:1115−1124.
  105. Schaffitzel, C., Hanes, J., Jermutus, L. and Pluckthun, A. (1999) Ribosomedisplay: an in vitro method for selection and evolution of antibodies from libraries. J. Immunol. Methods 231:119−135.
  106. Schaffitzel, C. and Pluckthun, A. (2001) Protein-fold evolution in the test tube.
  107. Trends Biochem. Sci. 26:577−579.
  108. Seed, B. and Aruffo, A. (1987) Molecular cloning of the CD2 antigen, the T-cellerythrocyte receptor, by a rapid immunoselection procedure. Proc. Natl Acad. Sci. USA 84:3365−3369.
  109. Sepp, A., Tawfik, D.S. and Griffiths, A.D. (2002) Microbead display by in vitrocompartmentalisation: selection for binding using flow cytometry. FEBS Lett. 532:455−458.
  110. Shaloiko, L.A., Granovsky, I.E., Ivashina, T.V., Ksenzenko, V.N., Shirokov, V.A.and Spirin, A.S. (2004) Effective non-viral leader for cap-independent translation in a eukaryotic cell-free system. Biotechnol. Bioeng. 88:730−739.
  111. Shimizu, Y., Inoue, A., Tomari, Y., Suzuki, Т., Yokogawa, Т., Nishikawa, K. and
  112. , T. (2001) Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat. Biotechnol. 19:751−755.
  113. , G.P. (1985) Filamentous fusion phage: novel expression vectors thatdisplay cloned antigens on the virion surface. Science 228:1315−1317.
  114. , E.M. (1975) Detection of specific sequences among DNA fragmentsseparated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98:503−517.
  115. Speight, R.E., Hart, D.J., Sutherland, J.D. and Blackburn, J.M. (2001) A newplasmid display technology for the in vitro selection of functional phenotype-genotype linked proteins. Chem. Biol. 8:951−965.
  116. Steiner, G., Liihrmann, R. and Kuechler, E. (1984) Crosslinking transfer RNAand messenger RNA at the ribosomal decoding region: identification of the site of reaction on the messenger RNA. Nucleic Acids Res. 12:8181−8191.
  117. Sternberg, N. and Hoess, R.H. (1995) Display of peptides and proteins on thesurface of bacteriophage Л. Proc. Natl Acad. Sci. USA 92:1609−1613.
  118. Takahashi, F., Funabashi, H., Mie, M., Endo, Y., Sawasaki, Т., Aizawa, M. and
  119. , E. (2005) Activity-based in vitro selection of T4 DNA ligase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 336:987−993.
  120. Tateyama, S., Horisawa, K., Takashima, H., Miyamoto-Sato, E., Doi, N. and
  121. , H. (2006) Affinity selection of DNA-binding protein complexes using mRNA display. Nucleic Acids Res. 34: E27.
  122. Tawfik, D.S. and Griffiths, A.D. (1998) Man-made cell-like compartments formolecular evolution. Nat. Biotechnol. 16:652−656.
  123. , R.B. (1977) Analytical Biochemistry of Insects. 3:85−130 Elsevier, 1. Amsterdam, Oxford, NY.
  124. Tyagi, S. and Kramer, F.R. (1996) Molecular beacons probes that fluoresceupon hybridization. Nat. Biotechnol. 14:303−308.-114 108. Ugarov, V.I., Samatov, T.R., Chetverina, H.V., and Chetverin, A.B. (1999)
  125. Plasmid purification using hot Mg2+ treatment and no RNase. BioTechniques26:194−198.
  126. Urban, J.H., Schneider, R.M., Compte, M., Finger, C., Cichutek, K., Alvarez
  127. Vallina, L. and Buchholz, C.J. (2005) Selection of functional human antibodies from retroviral display libraries. Nucleic Acids Res. 33: E35.
  128. Walker, G.T., Little, M.C., Nadeau, J.G. and Shank, D.D. (1992) Isothermal invitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase system. Proc. Natl Acad. Sci. USA 89:392−396.
  129. Westerlund-Wikstrom, B. (2000) Peptide display on bacterial flagella: principlesand applications. Int. J. Med. Microbiol. 290:223−230.
  130. Winter, G., Griffiths, A.D., Hawkins, R.E. and Hoogenboom, H.R. (1994)
  131. Making antibodies by phage display technology. Annu. Rev. Immunol. 12:433−455.
  132. Wittwer, C.T., Herrmann, M.G., Moss, A.A. and Rasmussen, R.P. (1997)
  133. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. BioTechniques 22:130−138.
  134. Xu, L., Aha, P., Gu, K., Kuimelis, R.G., Kurz, M., Lam, Т., Lim, A.C., Liu, H., 1. hse, P.A., Sun, L., Weng, S., Wagner, R.W. and Lipovsek, D. (2002) Directed evolution of high-affinity antibody mimics using mRNA display. Chem. Biol. 9:933−942.
  135. Yonezawa, M., Doi, N., Kawahashi, Y., Higashinakagawa, T. and Yanagawa,
  136. H. (2003) DNA display for in vitro selection of diverse peptide libraries. Nucleic Acids Res. 31: E118.
Заполнить форму текущей работой

Сессия? Спокойно!