Помощь в написании студенческих работ
Антистрессовый сервис

Выделение, иммобилизация и практическое использование липолитического комплекса Rhizopus oryzae 1403

Диссертация: Выделение, иммобилизация и практическое использование липолитического комплекса Rhizopus oryzae 1403
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались и обсуждались на Международных научных конференциях: «Пищевые продукты XXI века» (Москва, 2001) — «От фундаментальной науки к передовым технологиям» (Москва, Тверь 2001) — «Биотехнология на рубеже третьего тысячелетия» (Саранск, 2001) — 6-ой Международной научной конференции памяти В. М. Горбатова «Биотехнологические процессы… Читать ещё >

Выделение, иммобилизация и практическое использование липолитического комплекса Rhizopus oryzae 1403 (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Содержание

  • ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
    • 1. 1. Синтез липолитических ферментов микроорганизмами
    • 1. 2. Характеристика свойств микробных липаз
      • 1. 2. 1. Выделение и очистка препаратов липаз
      • 1. 2. 2. Физико-химические свойства и особенности строения нативных липаз
      • 1. 2. 3. Специфичность действия микробных липаз
    • 1. 3. Иммобилизация липолитических ферментов
      • 1. 3. 1. Физико-химические свойства иммобилизованных липаз
    • 1. 4. Практическое использование липолититческих ферментов

Актуальность темы

Липолитические ферменты всегда вызывали интерес ученых в связи со своими уникальными свойствами. Это действие на поверхности раздела фаз, разнообразие субстратной специфичности, способность катализировать как гидролиз триглицеридов, так и обратные реакции в микроводных условиях.

Ферментативный гидролиз жиров имеет несомненные преимущества по сравнению с химическим расщеплением. Помимо физиологического значения он используется человеком для получения глицерина и жирных кислот, удаления жировых примесей. С помощью позиционно-специфичных липаз можно осуществить избирательный гидролиз, который позволяет получать монои диглицериды, а также изменять функциональные свойства природных жиров, что важно для некоторых технологий. Исследования в области ферментативного катализа, реакций этерификации открыли новые возможности использования липаз.

Таким образом, липолитические ферменты представляют ценность для многих отраслей промышленности (олеохимической, текстильной, кожевенной, пищевой), для медицины и как биохимические реагенты.

Однако, внедрение липаз в производство сдерживалось в связи с их высокой стоимостью. Возможность иммобилизации ферментов в большей части решило эту проблему. Поэтому в последнее десятилетие исследования липаз развернулись в большем масштабе.

Несмотря на множество работ, посвященных липазам, трудно назвать такие, в которых они охарактеризованы достаточно полно с точек зрения свойств и структуры белка, строения активного центра, каталитического действия, специфичности, кинетических и термодинамических характеристик. Поэтому проблема глубокого изучения свойств нативных и иммобилизованных препаратов липолитических ферментов и разработка научно-обоснованных подходов к их применению является актуальной в теоретическом и практическом отношении.

Настоящая работа выполнялась в соответствии с тематикой научных исследований кафедры микробиологии и биохимии ВГТА, соответствующих плану госбюджетной НИР на 2001;2005 гг. (№ гос. регистрации 1 930 004 491) по проблеме «Изыскание оптимальных условий биосинтеза микроорганизмами биологически активных веществ и изучение их физико-химических свойств». Данная проблема включена в координационный план РАН по программе «Микробиологический синтез и научные основы микробиологического получения практически ценных веществ».

Цели и задачи исследования. Цель работы — получение препаратов липазы Rhizopus oryzae 1403, иммобилизация фермента, исследование физико-химических свойств нативной и иммобилизованной липазы, изучение некоторых аспектов практического использования липазы в хлебопечении. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи.

S разработка технологии получения ферментных препаратов липазы с различной степенью очисткиS установление фракционного состава липолитического комплекса продуцентаS исследование некоторых свойств изоферментов липазыS изучение каталитических свойств Липазы I: идентификация функциональных групп активного центраопределение кинетических характеристик гидролиза три-глицеридовизучение специфичности действия.

S иммобилизация липазы химическим и физическим способами- •S исследование физико-химических и кинетических характеристик реакции гидролиза трибутирина иммобилизованными липазамиS проведение непрерывного гидролиза растительного масла в реакторе с иммобилизованными липазамиS изучение роли гидролизованного масла в технологии хлебопечения (влияние на жизнедеятельность дрожжей, клейковину пшеничного теста и пшеничный крахмал).

Научная новизна. Установлено, что липолитический комплекс гриба Rhizopus oryzae 1403 состоит из двух изоформ.

На основе анализа кинетических параметров гидролиза трибутирина Липазой I при различных значениях рН, а также в присутствии специфических ингибиторов, установлено, что в акте катализа принимает участие гистидин и она относится к сериновым ферментам. В поддержании активной конформации фермента определенную роль играют SH-группы.

Выявлено, что Липаза I обладает 1,3-позиционной специфичностьюселективно гидролизует связи, образованные жирными кислотами со средней длиной цепи и содержащими не более двух двойных связей.

Исследованы некоторые свойства и установлены кинетические параметры гидролиза трибутирина липазой, иммобилизованной различными способами.

Практическая значимость работы. Разработаны технологические стадии производства препаратов липазы различной степени чистоты, предложена схема получения изоферментов липазы. Осуществлена иммобилизация ацетоноса-жденного препарата липазы на гидрофобном сорбенте и анионите АВ-17−2П. Показана возможность непрерывного гидролиза растительного масла в установке с иммобилизованной липазой. Доказана целесообразность использования гидролизованного растительного масла в хлебопечении на основании того, что оно интенсифицирует процесс потребления углеводов дрожжевыми клетками, улучшает свойства клейковины и пшеничного крахмала.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались и обсуждались на Международных научных конференциях: «Пищевые продукты XXI века» (Москва, 2001) — «От фундаментальной науки к передовым технологиям» (Москва, Тверь 2001) — «Биотехнология на рубеже третьего тысячелетия» (Саранск, 2001) — 6-ой Международной научной конференции памяти В. М. Горбатова «Биотехнологические процессы переработки сельскохозяйственного сырья» (Москва, 2002) — 2-ой Всероссийской научно-технической конференции «Современные достижения биотехнологии» (Ставрополь, 2002) — 7-ой Пущин-ской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2003) — Международном форуме «Аналитики и аналитика» (Воронеж, 2003) — Всероссийском симпозиуме «Биотехнология микробов» (Москва, 2004) — ежегодных научных конференциях Воронежской государственной технологической академии 1999;2002 г. г. и др.

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 5 статьях, 1 патенте и 6 тезисах докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, основных выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 203 страницах машинописного текста, содержит 52 рисунка и 14 таблиц.

Список литературы

включает 281 наименование, в том числе 165 на иностранных языках.

ВЫВОДЫ.

1. Разработана технология получения препаратов липазы микромицета Rhizopus oryzae 1403 на основе ультрафильтрации, осаждения органическими растворителями, вакуум-сублимационной сушки. Активность препаратов составила 2424 и 2746−3647 ед/г соответственно.

2. Методами гель-фильтрации и ионообменной хроматографии установлено наличие двух изоформ фермента, обозначенных как Липаза I и Липаза II. Удельная активность Липазы I составила 880,2- Липазы II — 683,2 ед/мг белка. Изо-ферменты отличались pi: 1−3,0, Н-4,2- рН-оптимумом — 6,5 и 6,0 соответственно. Оптимальная температура действия для обеих изоформ — (35±1) °С. Молекулярная масса была одинаковой — (44±2) кДа.

3. Значения рК ионизации Липазы I — 5,2 и 6,9 позволяют предположить участие в её каталитическом действии остатков гистидина и карбоксильной группы.

4. Наличие гистидина в активном центре Липазы I доказано значениями рК и теплоты ионизации (29,1 кДжмоль'1), инактивацией фотоокислением и снижением Vl7m при ингибировании диэтилпирокарбонатом. Фермент относится к сериновым гидролазам, так как ингибируется фенилметилсульфонилфторидом.

5. Липаза I проявляет селективность к жирным кислотам со средней длиной цепи (С12-С18), содержащим не более 2 двойных связей и обладает специфичностью к 1 и 3 положению в триглицеридах.

6. Установлены оптимальные условия иммобилизации ацетоносажденной липазы с помощью адсорбции на стиросорбе и связывания с анионитом АВ-17−2П. Эффективность иммобилизации составила 67,5 и 23,0% соответственновремя полужизни препаратов при непрерывной работе лабораторного реактора 18 и 96 ч соответственно.

7. Обоснован положительный эффект влияния масла, подвергнутого ферментативному гидролизу липазой Rhizopus oryzae 1403, в хлебопечении по увеличению интенсивности потребления глюкозы дрожжевыми клетками, улучшению свойств клейковины теста и суспензий пшеничного крахмала.

6.4.

Заключение

.

Таким образом, данными исследованиями обоснован положительный эффект использования масла, подвергнутого ферментативному гидролизу иммобилизованной липазой Rhizopus oryzae 1403 в производстве хлебобулочных изделий. Улучшаются физические свойства теста, интенсифицируется брожение и замедляется черствение готовых изделий. Это подтверждено производственными испытаниями в заводских условиях.

Показать весь текст

Список литературы

  1. А. Бысторое замораживание пищевых продуктов / Пер. с англ. А. Алмаши, Л. Эрдели, Т. Шарой. — М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1981. -408 с.
  2. Аре Р. Ю. Очистка, физико-химические и каталитические свойства микробных липаз. Обзор. / Р. Ю. Аре, Б. Я. Лусиня, М. Г. Плата и др. // Известия АН Латвийской ССР. 1979. -№ 6. — С. 92−106
  3. Л. Я. Технология хлебопекарного производства. 8-е изд. пере-раб. и допол. -М.: Легая и пищевая пром-сть, 1984. -416 с.
  4. И. Изучение возможности применения липолитически активныхштаммов дрожжей для улучшения органолептических качеств ветчины / И. Байчев, М. Радева, Е. Митева и др. // Мясопромышленность. 1980. — Т. 13-№ 4. — С. 16−18
  5. Н. А. Липазы некоторых грамотрицательных бактерий // Ав-тореф.. к. б. н. М.: МГУ, 1980. — 23 с.
  6. Л. П. Химия жиров. Учебник для техникумов пищевой промети. 3-е изд.перераб. и доп. М.: Пищевая пром-сть, 1975. — 279 с.
  7. И. В. Введение в прикладную энзимологию. Иммобилизованныеферменты / И. В. Березин, К. Мартинек / Учебн. пособие для студ. хим. и биол. фак-в ун-в. М.: МГУ, 1982. — 383 с.
  8. И. В. Иммобилизованные ферменты. Биотехнология / И. В. Березин, Н. В. Клячко, А. В. Левашов и др. М.: Высшая школа, 1987. — 159 с.
  9. Д. Биология дрожжей / Пер. с англ. В. Г. Горбулева, под ред. Н. М. Мейселя.-М.: Мир, 1985.-95 с.
  10. К. Липолитические ферменты / К. Брокерхоф, Р. Дженсен, пер. с англ. Т. П. Левчук и др., под ред. Браунштейна А. Е. и др. —1. М.: Мир, 1978.-396 с.
  11. В. И. О функциональной роли гистидиновых остатков а-кетоглутаратдегидрогеназы / В. И. Буник, В. С. Гомазкова // Биохимия. 1987. — Т. 52. — С. 1235−1247
  12. С. Д. Биокинетика: Практический курс / С. Д. Варфоломеев, К. Г. Гуревич. М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999. — 720 с.
  13. С. А. Липолитическая активность гриба Blakeslea trispora / С. А. Васильченко, Л. В. Баталкина, С. В. Васильченко и др. // Вопр. химии и хим. технол. Харьков. — 1989. — № 91. — С. 49−52
  14. О. Л. Пищевые добавки липидной природы и перспективы их применения в хлебопекарной промышленности / О. Л. Вершинина, Н. Н. Корнен, С. А. Ильинова // Изв. вузов. Пищевая технол. — 2001. -№ 1. С. 25−28
  15. Вода в пищевых продуктах. / Под ред. Р. Б. Дакуорта, пер. с англ. Р. Н. Евтеевой, Г. Е. Русанова, под ред. А. С. Гинзбурга, Г. Е. Русанова. М.: Пищевая пром-сть, 1980. — 376 с.
  16. Т. Ю. Разработка способа получения растворимой и иммобилизованной липазы Rhizopus oryzae 14 и её характеристика: Дисс. .к. т. н. М.: МГАПП, 1995. — 194 с.
  17. Дж. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. М.: Мир, 1988.-215 с.
  18. Э. Электорофорез в разделении биологических макромолекул. / Э. Гааль, Г. Медьеши, Л. Верецкеи: Пер. с англ. Е. Б. Мейзеля и др., под ред. В. И. Розенгарта. М.: Мир, 1982. — 446 с.
  19. А. Ф. Пути улучшения качества хлеба и сохранение его свежести / А. Ф. Горячева, Р. В. Кузьминскаий. М.: ЦНИИТЭИпищепром, 1984.-28 с.
  20. А. Ф. Жиры в хлебопечении / А. Ф. Горячева, В. С. Семенов, И. П. Изосимова. М.: ЦНИИТЭИпищепром, 1985. — 35 с.
  21. Ю. П. Математические методы планирования экспериментов. — М.: Пищевая пром-сть, 1979. 199 с.
  22. И. М. Технология ферментных препаратов / И. М. Грачева, А. Ю. Кривова / Учебник для студ. вузов. 3-е изд., перераб. и доп. М.: Элевар, 2000.-512 с.
  23. Т. А. Изучение процесса ультрафильтрации растворов грибной липазы / Т. А. Григорьева, А. М. Рожанская и др. // Прикл. биохимия и микробиол.- 1977.-Т. 13.-Вып. 5.-С. 779−781
  24. К. Д. Выделение и характеристика внеклеточных липаз микро-мицета Penicillium sp. / К. Д. Давранов, К. А. Тумялова, Б. Розмухамедова, М. Шамилева // Прикл. биохимия и микробиол. 1994. — Т. 30. — № 2. -С. 234−237
  25. К. Д. Липаза гриба Rh. microsporus / К. Д. Давранов, М. 3. Заки-ров, М. И. Ризаева // Химия природ, соед. 1976. — № 5. — С. 636−639
  26. К. Д. Липаза Oospora lactis / К. Д. Давранов, 3. Р. Ахмедова, М. И. Ризаева и др. // Прикл. биохимия и микробиол. 1984. — Т. 20. — № 2.-С. 166−174
  27. К. Д. Некоторые свойства внеклеточной липазы Rhizopus microsporus УзЛТ-3 / К. Д. Давранов, И. Т. Куйлибаев, Б. X. Розмухамедова, А. А. Махсумханов // Прикл. биохимия и микробиол. — 1995. — Т. 31. № 4. — С. 405−411
  28. К. Д. Препаративное выделение, очистка, кристаллизация и некоторые свойства липазы из Oospora lactis / К. Д. Давранов, М. Я. Табак, А. С. Саггаров//Биохимия. 1989.-Т. 54.-№ 11.-С. 1866−1872
  29. К. Д. Микробные липазы в биотехнологии. Обзор // Прикл. биохимия и микробиол. 1994. — Т. 30. — №. 4−5. — С. 527−534
  30. Г. Гель-хроматография. М.: Мир, 1970. — 320 с.
  31. . X. Липазы микромицетов: Дисс.. д. б. и. ПУЩИНО: И-т биохимии и физиологии микроорганизмов, 1994. — 400 с.
  32. . X. Очистка и свойства внутриклеточных липаз гриба Rhizopus microsporus / Ж. X. Диеров, А. Б. Циоменко, К. Д. Давранов, и. С. Кулаев // Биотехнология. 1993. — № 7. — С. 26−30
  33. М. Ферменты. / М. Диксон, Э. Уэбб / Пер. с 3-го англ. изд. Л. Д. Гинодмана и М. И. Левянт, под ред. акад. А. И. Опарина. М.: Мир, 1982. — Т. 1.-389 с.
  34. Г. Н. Липид-белковые комплексы пшеницы, их формирование и роль в технологических процессах. Дисс.. к. т. н. Москва: МТИПП, 1999.-650 с.
  35. А. Б. Выделение и свойства препаратов внеклеточных липаз природного (В-10) и мутантного (М-1) штаммов / А. Б. Дужак, 3. Н. Панфилов, Е. А. Васюнина // Прикл. биохимия и микробиол. 2000. -Т. 36.-№ 4.-С. 402−411
  36. Н. А. Очистка и свойства липазы Rhizopus japonicus 1403 / Н. А. Жеребцов, С. А. Шеламова, Э. А. Шишкова и др. // Ферменты микроорганизмов. Сборник статей, ч. 1. М.: ВНИИСЭНТИ, 1989. 235 с.
  37. А. В. Пути эффективного использования сахаросодержащих и жировых продуктов в хлебопекарной промышленности / А. В. Зубченко, Т. В. Санина. М.: ЦНИИТЭИхлебопродуктов, 1990. — 36 с.
  38. Иммобилизованные ферменты: современное состояние и перспективы. Т. 1,2./ Под ред. И. В. Березина, В. К. Антонова, К. Мартинека. М.: Издательство МГУ, 1976. — 296 с.
  39. Е. Д. О теоретических основах образования клейковины // Изв. вузов. Пищевая технол. 1992. — № 1. — С. 5−7
  40. Е. Д. Клейковина, ее формирование, состав. В 2-х ч. Ч. 1. / Элеваторная промышленность. Обзорная информация. — М.: ЦНИИТЭИ, 1992. -60 с.
  41. К. А. Микробные ферментные препараты: Технология и оборудование / К. А. Калунянц, JI. И. Голгер. М.: Пищевая пром-сть, 1979. -304 с.
  42. М. Техника липидологии: Выделение, анализ и идентификация ли-пидов / Пер с анг. В. А. Вавера. М.: Мир, 1975. — 324 с.
  43. Т. Основы ферментативной кинетики / Пер. с англ. JI. Ю. Бровко и др. Под ред. Б. И. Курганова. М.: Мир, 1990. — 350 с.
  44. А. И. Иммобилизованные ферменты // Успехи химии. — 1974. -Т. XLIII. Вып. 8. — С. 1480−1511
  45. О. В. Применение ферментов в масло-жировой промышленности / О. В. Кислухина, В. Д. Надыпта, Н. М. Минасян // Изв. вузов. Пищевая технол. 1993. — № 1−2.-С. 14−19
  46. А. А. Ферментативный катализ: Уч. пособие для хим. спец. унтов. В 2-х ч. Ч. 1 / А. А. Клесов, И. В. Березин. М.: Изд-во МГУ, 1980. -Т. 1.-264 с.
  47. С. В. Фотоокисление и модификация диэтилпирокарбонатом «биосинтетической» L-треининдегидротазы из пивных дрожжей Sassharomyces carlsbergensis / С. В. Ковалева, А. И. Дорожко, 3. С. Каган // Биоихимия. 1984. — Т. 49. — № 8. — С. 1253−1262
  48. Г. А. Иммобилизация ферментов на углеродминеральных носителях. Некоторые закономерности адсорбционной иммобилизации ферментов. / Г. А. Коваленко, М. П. Ванина // Биотехнология. 1997. -№ 4. — С. 3−12
  49. JI. П. Технология пищевых продуктов / JI. П. Ковальская, И. С. Шуб, Г. М. Мелькина. М.: Колос, 1999. — 752 с.
  50. Н. П. Биохимия хлебопечения. 2-е изд., перераб. и доп. -М.: Пищевая пр-сть, 1978. 277 с.
  51. Г. А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высш. школа, 1980.-272 с.
  52. В. JI. Введение в энзимологию. 3-е изд. доп., перераб., испр. — М.: Наука, 1986.-336 с.
  53. JI. С. Лабораторный практикум по технологии кондитерского производства. М.: Пищевая пром-сть, 1980. — 184 с.
  54. Л. П. Роль остатков гистидина в конститутивной НАД(Р)-глутаматдегидрогеназе Chorella pirenoidosa II Л. П. Лосева, М. В. Бен-диашвили, В. Р. Шптилов и др. // Биоихимия. 1986. — Т. 51. — С. 840−849
  55. В. И. Криоповреждения ферментов и ферментных систем. Актуальные проблемы криобиологии / Под. ред. Н. С. Пушкаря, А. М. Белоуса.- Киев.: Наукова думка, 1981. 607 с.
  56. А. Б. Физическая и коллоидная химия. М.: Химия, 1980. — 224 с.
  57. И. С. Технохимический контроль сырья в кондитерском производстве. Справочник. М.: Агропромиздат, 1987. — 271 с.
  58. К. X. Повышение качества и расширение ассортимента кондитерских изделий с использованием эффективных добавок / К. X. Маджидов, М. Г. Басиев, М. И. Мурдахиева // Изв. вузов. Пищевая технол. — 1984.-Вып. 1−2.-С. 22−26
  59. С. С. Взаимодействие аденозиндезаминазы с ингибиторами, модификация диэтилпирокарбонатом / С. С. Марданян, С. Г. Шароян, А. А. Антонян и др. // Биохимия. 2002. — Т. 67. — № 7. — С. 930−938
  60. К. Иммобилизованные ферменты. М.: Наука, 1984. — 324 с.
  61. Ю. С. Исследование ИК-спектров гемопротеидов и их составных частей / Ю. С. Манойлов, Ю. П. Комов, С. Е. Манойлов // Биофизика.- 1965 Т. 10. — № 5. — С. 782−788.
  62. В. А. Получение высокоактивных препаратов нейтральной протеазы Bacillus subtilis / В. А. Мартьянов, А. Ф. Зябрев и др. // Ферменты микроорганизмов. Сборник статей, ч. 1. М.: ВНИИСЭТИИ, 1989. -225 с.
  63. И. В. Пищевые добавки и хлебопекарные улучшители в производстве мучных изделий. / И. В. Матвеева, И. Г. Белявская. М.: МГУПП, 1998.-104 с.
  64. Микробные ферменты и биотехнология. /Под ред. Фогарти и др., пер. с англ. И. М. Грачева. М.: Агропромиздат, 1986. — 318 с.
  65. Я. А. Современная биохимия в схемах / Я. А. Мусил, О. Н. Нова-кова, К. В. Кунц. М.: Мир, 1984. — 264 с.
  66. А. Д. Биохимическая переработка жиров и масел в новые ли-пидные продкты с улучшенными биологическими и физико-химическими свойствами. (Обзор) / А. Д. Неклюдов, А. Н. Иванкин // Прикл. биохимия и микробиол. 2002. — Т. 38.-№ 5.-С. 46981
  67. А. Д. Свойства препарата иммобилизованной липазы Rhizopus oiyzae 14−14 / А. Д. Неклюдов, Б. Д. Шведов, В. В. Цибанов // Прикл. биохимия и микробиол. 1981. — Т. 17. — Вып. 4. — С. 510−515
  68. С. В. Повышение эффективности сублимационной сушки ферментных препаратов. Автореф. дисс.. к. т. н. — Воронеж: ВТИ, 2000. -24 с.
  69. Г. Ю. Механизм сорбции т-РНК неионогенным сорбентом / Г. Ю. Орос В. Ф. Селеменев, В. Ю. Хохлов и др. // Физическая химия. — 1988.- Т. 72.-№ 5.-С. 926−932
  70. Jl. JI. Применение рН-статного метода для изучения ферментив-ного действия липазы Penicillium sp. / Jl. Jl. Петрова, Г. А. Казани на, А. А. Селезнева // Прикл. биохим. и микроб. -1977. -Т. 13. -№ 5. С. 758
  71. Р. Д. Применение пищевых добавок в хлебопечении // Хлебопечение России. 1996. — № 1. — С. 25−3076
Заполнить форму текущей работой

Сессия? Спокойно!