Влияние паратиреоидного гормона на кроветворные и стромальные клетки-предшественники

1 Актуальность проблемы.

Кроветворение представляет собой процесс образования, по меньшей мере, 10 видов зрелых клеток крови, выполняющих совершенно разные функции. Клетки крови имеют короткий жизненный цикл и погибают в течение нескольких дней или месяцев. Основная масса клеток крови представлена конечными специализированными, неспособными к делению клетками. Поэтому в течеиие всей жизни происходит новообразование и созревание клеток крови в специальных кроветворных тканях — в костном мозге, селезенке, тимусе, лимфатических узлах. Известно, что в основе гемопоэза лежит стволовая кроветворная клетка (СКК). Большинство СКК находятся в стадии покоя клеточного циклами в каждый момент времени только несколько клеток поддерживают гемопоэз. Основополагающими свойствами СКК являются способность к самоподцержанию, под которым понимают высокий пролиферативный потенциал, и к дифференцировкам в предшественники каждого из ростков клеток крови. Главным кроветворным органом млекопитающих является костный мозг (КМ), который обеспечивает специфическое микроокружение, необходимое для развития и поддержания пула стволовых клеток на протяжении жизни организма, а кроме этого регулирует процессы дифференцировки СКК. В норме гемопоэз поддерживается за счет взаимодействий между стволовыми клетками и стромой КМ (17,44,46). К строме КМ относят разные типы клеток: фибробласты, адипоциты, гладкомышечные клетки, остеобласты, хондроциты, эндотелиальные клетки, а также вырабатываемый ими внеклеточный матрикс. Все эти элементы формируют кроветворные «ниши» (131), регулирующие функциональное состояние СКК и препятствующие потере их высокого пролиферативного потенциала. В настоящее время очень актуальна возможность воздействия на кроветворные «ниши» или на молекулы сигнальных путей взаимодействия СКК с микроокружением для стимуляции их роста, т.к. задача получения большого количества полноценных СКК имеет важное значение для лечения больных, нуждающихся в пересадке таких клеток.

Не так давно было установлено, что основным структурным элементом ниши являются остеобласты, количество и активацию которых можно регулировать с помощью паратиреоидного гормона (ПТГ). В организме ПТГ регулирует обмен кальция и остеогенез. В зависимости от дозы и условий введения он может вызывать как увеличение массы кости (благодаря активации остеобластов), так и ее резорбцию (активируя остеокласты). Показано, что СКК локализуются на эндостальной поверхности губчатой кости (49,106) и контактируют с веретеновидными остеобластами. Недавние эксперименты показали, что после инъекций небольших количеств ПТГ, сопоставимых с используемыми для лечения остеопороза (43), число самых ранних полипотентных СКК увеличивалось в 2 раза, а мыши, восстановленные после летального облучения обработанным ПТГ костным мозгом, лучше выживали (15). Этот эффект связан с повышением экспрессии Jagged 1 — лиганда, локализованного на поверхности остеобластов, который взаимодействует с рецептором Notch 1, экспрессированным на поверхности СКК. Такое взаимодействие стимулирует пролиферацию СКК.

Таким образом, впервые был выявлен системный регулятор кроветворных нишпаратиреоидный гормон. В связи с этим, появилась возможность: во-первыхвоздействовать на ранние кроветворные клетки-предшественники, чего раньше не удавалось, во-вторых — воздействовать на ниши СКК, и в-третьих — изучать регуляторные механизмы задействованные в этих процессах. Полученные результаты могут быть использованы в экспериментальной гематологии и работах по экспансии стволовых кроветворных клеток in vivo.

2 Цель работы.

Целью настоящей работы было изучение влияния паратиреоидного гормона на кроветворные клетки-предшественники из отделов полии олигопотентых стволовых кроветворных клеток, на мезенхимальные стволовые клетки, отвечающие за перенос кроветворного микроокружения и на их потомков, in vivo и в длительных культурах костного мозга (ДККМ) мыши и человека.

3 Основные задачи.

1. Оценить основные характеристики кроветворения in vivo и изменения происходящие in vitro, в ДККМ мыши и человека под воздействием паратиреоидного гормона.

2. Изучить влияние паратиреоидного гормона на мезенхимальные стволовые клетки и строму кроветворных органов.

3. Проанализировать возможные изменения экспрессии некоторых важных генов, ответственных за поддержание СКК, маркеров дифференцировок, молекул адгезии и ростовых факторов в стромальных клетках после воздействия паратиреоидного гормона.

4 Научная новизна и практическое значение работы.

В данной работе in vivo впервые было функционально показано, что применение паратиреоидного гормона (ПТГ), приводит к увеличению количества ранних мультипотентных стволовых кроветворных клеток (СКК) в 2−4 раза, однако не оказывает действия на более поздние полипотентные стволовые кроветворные клетки. Длительное введение ПТГ снижает способность коротко репопулирующих СКК попадать в костный мозг после трансплантации, чем может объясняться отсутствие экспансии зрелых клеток крови. Аналогичное действие паратгормона наблюдалось в модельной системе кроветворения — длительной культуре костного мозга человека и мыши. Добавление ПТГ не влияет на продукцию зрелых клеток, однако число поздних олигопотентных предшественников увеличивается в 7 раз, а в культурах мышиного костного мозга количество более ранних мультипотентных предшественников увеличивается в 9−10 раз.

Полученные в работе данные выявили, что ПТГ не влияет на мезенхимальные стволовые клетки, отвечающие за перенос кроветворного микроокружения, действуя только на стромальные остеобласты и длительно репопулирующие СКК, что говорит в пользу возможного практического использования ПТГ в качестве фармакологического метода воздействия на СКК и стромальные клетки. На основе поученных данных, в настоящее время, в лаборатории физиологии кроветворения ведется работа по изучению влияния паратиреоидного гормона на стволовые клетки, в модельной системе, доноров и больных гематопролиферативными заболеваниями. Результаты работы применяются для изучения повреждений стромального микроокружения у больных апластической анемией в ГУ ГНЦ РАМН.

5 Материалы и методы исследования.

Получение длительных культур костного мозга мыши и человека и функциональные тесты проводились стандартными методами культивирования.

Функциональное состояние клеток-предшественников оценивали методом конкурентной репопуляции и в различных клональных тестах, таких, как подсчет колониеобразующих единиц селезенки на 12 день (КОЕ-С 12)) в сублетально облученных мышах-реципиентах, подсчет колониеобразующих единиц культуры (КОЕ-К) в полужидкой среде, подсчет клеток, образующих области булыжника (КООБ), с использованием метода Пломахера. Интенсивность пролиферации клетокпредшественников оценивали по доле клеток, чувствительных к воздействию цитостатиков.

Изменения функционального состояния ниш для кроветворных клеток под действием ПТГ определяли с помощью фактора оседания через 24 часа (Ф-24).

Экспрессию интересующих генов определяли методом обратной транскрипции и последующей полимеразной цепной реакции, полуколичественную оценку продукта реакции проводили с помощью метода Саузерн-блот гибридизации.

6 Основные положения, выносимые на защиту.

1. Паратиреоидный гормон стимулирует пролиферацию и увеличение количества ранних стволовых кроветворных клеток к которым относятся наиболее примитивные стволовые клетки, способные длительно поддерживать кроветворение.

2.

Введение

паратиреоидного гормона не влияет на более зрелые мультии олигопотентные клетки-предшественники.

3. Мезенхимальные стволовые клетки не чувствительны к воздействию паратиреоидного гормона.

4. Паратиреоидный гормон изменяет свойства компонентов стромального микроокружения, активирует остеобласты, регулирующие ранние СКК, и модулирует элементы васкулярной ниши, отвечающие за способность более поздних гемопоэтических предшественников находить свое место после трансплантации.

7 Содержание работы по главам.

Оглавление;

Основные обозначения и сокращенияВведение;

1 Выводы.

1. Применение паратиреоидного гормона (ПТГ), вызывающего активацию и пролиферацию остеобластов, приводит к увеличению в 2−4 раза количества ранних стволовых кроветворных клеток (СКК), способных длительно поддерживать кроветворение.

2. После введения ПТГ в костном мозге животных концентрация более поздних полии олигопотентных клеток-предшественников (КООБ 7, КОЕс, КОЕ-К) не изменяется.

3. Добавление ПТГ в длительную культуру костного мозга человека и мыши не влияет на продукцию зрелых клеток, однако число поздних олигопотентных предшественников (КОЕ-К) увеличивается в 7 раз, а в культурах мышиного костного мозга количество более ранних мультипотентных предшественников (КООБ 28) увеличивается в 9−10 раз.

4. На обработанных паратиреоидным гормоном стромальных подслоях длительных культур костного мозга мыши и человека адгезия и выживание кроветворных клеток улучшается, что отражается в увеличении числа ранних мультипотентных предшественников (КООБ 28) в 2−2,5 раза. Вместе с тем, отмечается увеличение уровня экспрессии гена ВМ1−1, отвечающего за самоподдержание СКК.

5. Длительное введение ПТГ снижает способность коротко репопулирующих СКК попадать в костный мозг после трансплантации, чем объясняется отсутствие экспансии зрелых клеток крови.

6. ПТГ не влияет на мезенхимальные стволовые клетки, отвечающие за перенос кроветворного микроокружения, действуя только па их потомки — стромальные остеобласты.

2 Печатные работы.

По теме диссертации опубликованы следующие печатные работы:

1. Свинарева Д. А., Нифонтова И. Н., Дризе Н. И., 2004. Влияние паратиреоидного гормона /ПТГ (1−34)/ на кроветворные и стромальные стволовые клетки. Бюлл. экспер. биол. мед., Том 138, № 12, с. 645−648.

2. Свинарева Д. А., Нифонтова И. Н., Чертков И. Л., Дризе Н. И., 2005. Действие паратиреоидного гормона на кроверворные и стромальные стволовые клетки. Научные труды I Съезда Физиологов, Том 1, с. 215.

3. Свинарева Д. А., Нифонтова И. Н., Чертков И. Л., Дризе Н. И., 2005. Экспансия кроветворных клеток-предшественников ex vivo на подслое, обработанном паратиреоидным гормоном. Бюлл. экспер. биол. мед., Том 140, № 9, с. 320−324.

4. Свинарева Д. А., Нифонтова И. Н., Чертков И. Л., Дризе Н. И., 2006. Изменение хоуминга кроветворных клеток-предшественников после длительного воздействия паратиреоидного гормона. Бюлл.экспер.биол.мед., Том. 142, № 7, с. 97−101.

5. Svinareva D.A., Nifontova I.N., Drize N.J., 2004. РТН treatment induce alterations in murine Long-Term Bone Marrow Culture. The Hematology Journal, vol. 5, Suppl. 3, S68.

6. Svinareva D.A., Nifontova I.N., Drize N.J., 2004. Mesenchymal stem cells capable to transfer hematopoietic microenvironment did not change their behavior after PTH treatment. Experimental Hematology, Vol 32, N7, Suppl. 1, p. 89.

7. Nina Drize, Daria Svinareva, Irina Nifontova, Joseph Chertkov, 2004. Parathyroid Hormone (1−34) Treatment Induces Hematopoietic Precursor Cells Expansion in Murine Long-Term Bone Marrow Culture. Blood, Vol 104, N11, part 2, p. 127b.

8. Svinareva D.A., Nifontova I.N., Momotuk K.S., Savehenko V.G., Chertkov J.L., Drize N.J., 2005. Effect of PTH on hematopoiesis in human and murine Long-Term Bone Marrow Cultures. Hematologica/The Hematology Journal, Vol. 90: Suppl. 3, S2., p. 120.

9. Svinareva D.A., Nifontova I.N., Chertkov J.L., Drize N.I., 2005. Effect of parathyroid hormone on hematopoietic and stromal precursor cells. Experimental Hematology, Vol. 33, № 7, Suppl. 1, p.121.

10. Svinareva D.A., Nifontova I.N., Chertkov J.L., Drize N.I., 2006. Effect of PTH (1−34) on homing of hematopoietic stem cells. Hematologica/The Hematology Journal, Vol. 91, Suppl. 1, p. 309.

Заключение

.