Биологический потенциал мутантных вариантов генов Е6 и Е7 вируса папиллом человека тип 18

ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Биологический потенциал мутантных вариантов генов Е6 и Е7 вируса папиллом человека тип 18 (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Содержание

Глава 1. Введение
Глава. 2, Обзор литературы: Вирусы папилломы человека как модель изучения молекулярных механизмов канцерогенеза
- 2. Л, Генетическая структура вирусов папиллом и их роль в канцерогенезе 9 V человека
  - 2. 2. Регуляция транскрипции вирусных генов
  - 2. 3. Трансформирующие гены вирусов папиллом 19 2.3,1, Ген Еб 19 23.2. Ген Е
  - 2. 4. Функциональная кооперация онкобелжов Е-6 и Е
Глава 3. Материалы и методы
- 3. 1. Список использованных растворов и сред 3!
- 3. ^-Молекулярное клонирование
  - 3. 2. Л -Ферменты
  - 3. 2. 2-Бактериальные штаммы и плазмиды
- 32. 3-Трансформация бактерий Е.еоН. плазмидной ДНК а). Получение компетентных клеток б). Введение в клетки шгазмидной ДНК
  - 3. 2. 4, Выделение плазмидной ДНК
  - 3. 2. 5, Рестрикция и яигирование 37 3 2,6. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов
    - 3. 2. 7. Секвенирование
    - 3. 2. 8. Эяектрофоретическое разделение продуктов ееквенирования 38 в денатурирующем полиакрнламндном геле (ПААГ)
    - 3. 2. 9. Амплификация ДНК
    - 3. 2. 10. Клонирование генов Е6 и Е7 НРУ
    - 3. 2. 11. Сайт-направленный мутагенез
  - 3. 3. Получение и анализ культур клеток млекопитающих
    - 3. 3. 1. Плазмиды и векторы
    - 3. 3. 2. Клеточные линии 46 3.3,3 Трансфекция клеток млекопитающих
    - 3. 3. 4. Выделение РНК и ДНК с помощью гуанидин изотиоцианата
    - 3. 3. 5. Препаративное выделение специфических фрагментов 48 ДНК и:? агарозных гелей
    - 3. 3. 6. Препаративный электрофорез ДНК в агарозных гелях
    - 3. 3. 7. Г ибридизация 49 3.3.7.1. Перенос ДНК из геля на нейлоновый фильтр (НуЬош! М+)
      - 3. 3. 7. 2. Получение молекулярных ДНК-зондов
      - 3. 3. 7. 3. Гибридизация ДНК, иммобилизованной на фильтрах
      - 3. 3. 7. 4. Авторадиография j I
      - 3. 3. 7. 5. Пробы для гибридизации 5 i 3.3.8. RT-PCR 51 3.33, Биологические свойства
  - 3. 3. 3 ¦. 1, Рост клонов
    - 3. 3. 9. 2. Измерение времени удвоения и насыщения плотности клеточной популяции
    - 3. 3. 9. 3. Культивирование клеток в полужидкой среде
    - 3. 3. 9. 4. Введение клеток в сингенны крыс (линия Фишер)
Глава 4. Результаты исследования
- 4. 1. Введение
- 4. 2, Молекулярное клонирование
  - 4. 2. 1, Анализ последовательностей вставки в шхазмиде рС
  - 4. 2. 2, Субкяонировшгае генов Бб и Б? а). Ген Еб о). Ген Е
  - 4. 2. 3, Получение и клонирование новых мутантных вариантов гена Е7 68 HPV тип
  - 4. 3. Исследование биологической активности клонированных генов
  - 4. 3. Л, Трансфекция чувствительных клеток
  - 4. 3. 2, Идентификация последовательностей трансфицированных генов
    - 4. 3. 2. 1. Саузерн б лот гибридизация
    - 4. 3. 2. 2. Полимер азная цепная реакция (PCR)
- 43. Экспрессия генов Еб и Е7 в трансфицированных клетках
  - 4. 3. 4. Характеристики роста полученных клонов
  - 4. 3. 5. Анализ морфологии клеток
  - 4. 3. 6. Субстратная зависимость размножения клеток
  - 4. 3. 7. Анализ туморогенности полученных клонов
Глава 5. Обсуждение результатов
Глава 6. Выводы
Глава. 1, Список литературы J
СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
HPV вирус папиллом человека
EMBI, — Европейский Банк данных молекулярной биологии
Ш — интразпителиальная днеплазия
URR -регуляторный район HPV pRB -белковый продукт гена ретинобластом ы
МЦ -метил-целлюлоза н.п. — нуклеотидная пара тл.я. -тысяча иуклеотидных пар
ФНГ1 -фланкирующая последовательность
CR -консервативный район
ND анализ не проводился. pRB bdg — сайт связывания ретинобластомы бедка ловя 1* Введение

Вирусы папиллом человека (HPV) являются этиологическим фактором ори раке шейки матки, Многочисленные данные свидетельствуют о том. что генетический материал этих вирусов присутствует практически во всех опухолях этой локализации, причем превалирующим среди них являются HPV !6 и 18 типов* За последне годы достигнуты существеные успехи в пониманий механизмов действия этих вирусов. Оказалось что ключевую роль в этом процессе иг рают 2 вирусных гена Е6 и Е7, которые нарушают функции основных генов, контролирующих размножение клеток, т. е. генов" супрессоров и генов-регуляторов клеточного цикла. Гены Еб и Е7 клонированы и секвенированы. получено достаточное количество как делециошшх, так н точечных мутантов этих генов. Благодарим этому имеется достаточно подробная информация о роли отдельных участков указанных генов в проявлении трансформирующих потенций, однако эта информация в основном касается генов Еб и Е7- HPV 16 типа и имеется сравнительно мало данных о генах HPV 18 тина.

В силу этого целью настоящего исследования было изучение биологического потенциала генов Еб и Е7 HPV 18 типа, т.к. существует предположение о том, что HPV именно этого типа обнаруживается в более агрессивных опухолях шейки матки. Тема настоящей работы является актуальной как в теоретическом, так и в практическом плане, т. е. получение любого генетического маркера, обладающего биологическим эффектом на грансфицированные им клетки, является необходимым для дальнейшего прогресса биологии, медицины и онкологии в частности. Для выполнения этой задачи были использование экспериментальные модели, полученные в лаборатории молекулярной биологии вирусов ранее: иммортализованые клетки крыс IE5 и плазмида рС7, содержащая гены Её и Е7, обладающая трансформирующим эффектом на эти клетки. Гены Еб и Б? HPV (В были субклонированны и установлено, что эти гены в дополнение к нескольким бессмысленным мутациям, содержат по одной точечной мутации в С концевой области. С помощью сайт — направленного мутагенеза было получено еще 2 варианта гена Е7 по доменам CR1 и CR2 и показано, что точечная мутация по кодону 24 (CR2 домен) элиминирует трансформирующий потенциал вируса. Таким образом, полученные нами клоны генов Е6 и Е7 дополняют коллекцию существующих вариантов этих генов и получение результаты нереданы в Европейский Банк Молекулярной Биологии (EMB L).

1 шва 2. Обзор шжершпуры Вирусы попито мы человека как модель изучения молекулярных механизмов канцер о генз а,

2.1. Генетическая структура вирусов папиллом и их роль в канцерогенезе у человека.

За последние десятилетие особый интерес к изучению вирусов папиллом вполне объясним. После того как в середине 70-х годов было высказано предположение [1], что вирусы папиллом человека (HPV) являются этиологическим агентом рака шейки, эта область вирусологии и онкологии подучила стремительное развитие. С одной стороны, это привело к твердым доказательствам этнологической роли HPV при данной формы рака, что окончательно подтверждено в Бюллетене Всемирной Организации Здравоохранение [2], а с другой -способствовало стремительному прогрессу в анализе не только вирусов этой группы, но и механизмов превращения нормальной клетки в опухолевую под действием этих вирусов,

В настоящем обзоре мы не ставили своей задачей представление всех данных по доказательству роли HPV в возникновении раки шейки матки, таких как частота встречаемости вирусной ДНК в опухолях, экспрессия этой ДНК. форма ее персистентнии. эпидемиологические данные (об этом подробно см. раздел 2.3), а хотели бы акцентировать особое внимание на тех вирусных генах, которые играют ключевую роль в процессах злокачественной трансформации клеток.

Известно более 100 типов вирусов папиллом человека [3]. Одной из наиболее характерных особенностей вирусов этой группы является отсутствие адекватной чувствительной клеточной модели для их размножения, поэтому подавляющее большинство вирусов этой группы идентифицированы на основании выявления в зараженных клетках вирусной ДНК, последующего ее клонирования и секвенирования.

Фактически все HPV можно условно разделить на две большие группы, которые ассоциируются либо с поражениями кожей, либо поражениями слизистых ободочек. Наиболее типичными проявлениями инфекции кожи являются доброкачественные бородавки, а слизистых — предраковые и раковые поражения шейки матки [4].

Все HPV имеют весьма сходную структуру. Они содержат ДНК в 8.000 пар оснований, содержащую 9 открытых рамок считывания, причем две из них (LI и L2) кодируют структурные белки вириона, остальные 7 (El — Е?) относятся к так называемым «ранним» вирусным генам, контролирующим функции, необходимые для репродукции и проявления патогенного потенциала [5].

Среди всех известных HPV лишь сравнительно небольшое количество связано с различными злокачественными поражениями. К числу «кожных» вариантов HPV, относятся те, которые были обнаружены при бородавчатой эшщермодисшгазии, заболевании, при котором пноскокпеточные карциномы возникают ш папиллом в результате воздействия солнечной радиации [6]. Наиболее часто при этом заболевании выявляется HPV 5 типа, а существенно реже HPV других типов (типы 8,14,17,20) [7], и поскольку отсутствуют какие-либо клеточные модели этого заболевания о механизмах (Ьункниониоования вирусов (этих типов) практически ничего неизвестно,

2. а* А. JL а* .'А

Наиболее серьезные данные о связи HPV с канцерогенезом у человека были получены для вирусов, выявляемых в слизистых оболочках прежде всего при раке шейки матки. Пионерские исследования группы zur Hansen Н, [8-!1| в середине 80-х годов убедительно показали, что как миниум 2 типа HPV: 16 и 18 типов выявляются при раках шейки матки, в то время как при доброкачественных поражениях были обнаружены в основном HPV 6 и 1! типов. В дальнейших исследованиях еще несколько типов HPV было обнаружено как при раках шейки матки, так и при других злокачественных поражениях аногенитальной области у женщин, и у мужчин (типы 31, 33, 35, 39,45, 51, 52,56, 58, 59, 66, 70), в то же время количество новых типов HPV, которые были выделены из папиллом (доброкачественных поражений) этой области, и папиллом ротовой полости было существенно меньше (типы 3,? 'i > Ч? ч Г i — Vi

32a >г, !.?} j h: j.

К настоящему времени сложилась ситуация, что при использовании соответствующих чувствительных методов исследований, ДНК HPV различных типов выявляются более, чем в 90% опухолей шейки матки. Это является важным аргументом в пользу того, что присутствие вирусного генетического материала необходимый фактор для превращения нормальных клеток в опухолевые.

На основании вышеизложенных данных все HPV, выделенные при доброкачественных и злокачественных неоплазиях, были разделены на так называемые HPV «низкого» и «высокого» риска. Анализ этих 2 классов HPV не выявил принципиальных структурных отличий в генетической структуре — и те и другие содержат по 2 структурных гена (L1 и L2) и 7 функциональных генов (El — Е7) (рис.1). Кроме того, в составе всех HPV была идентифицирована регуляторная область (URR — upstream regulatory region), локализующаяся непосредственно перед генами Е6 и Е7. В URR было выявлено значительное количество сайтов, способных взаимодействовать как с позитивными, так и негативными факторами транскрипции. Необходимость такого взаимодействия очевидна, исходя из того, что инфекция HPY для плоскоклеточного и слизистого эпителия является персистентной и вызывает ускоренную пролиферацию зараженных клеток. Для достижения такой инфекции вирус должен инфицировать банальные клетки, поскольку только эти клетки эпителия способны к размножению. Эти клетки активируют все остальные клетки вышележащих слоев, которые в процессе дефференцировкн теряют способность к размножению и отслаиваются от поверхности. Репликация вирусной ДНК, экспрессия поздних генов и сборка вирионов тесно связаны со стадией дифференцировки и происходят только в верхн ел ежащих клеточных слоях.

На разных стадиях инфекции после проникновения вирусной ДНК в клеточное ядро транскрипция генов НРУ зависит в основном от клеточных транскрипционных факторов. На более поздних стадиях в регуляции экспрессии как ранних, так и поздних вирусных функций принимают участие и вирусные факторы.

Вирусный геном в зараженных кллетках может персистировать как в эписомальной, так я в интегрированной формах [13] и первые данные свидетельствовали и том, что на ранних стадиях опухолевого процесса (интраэпителиальной днсплазии — CIN) эписомальная форма является превалирующей, в то время как в карциномах основная масса вирусной ДНК интегрирована в клеточный геном [14]. Однако, в настоящее время столь однозначная трактовка этих результатов вряд ли справедлива. По-видимому, в опухолевых линиях, подученных из карцином шейки матки, в подавляющем большинстве случаев вирусная ДНК интегрирована в клеточную ДНК, в то время как в опухоли (где выявляется высокая гетерогенность клеточной популяции) возможно выявление обеих типов персистенции вирусной ДНК [15], Б какой степени, интеграция является определяющим фактором для поддержания опухолевого статуса клетки, остается неясным, поскольку отсутствует полная информация о том, какие типы РНК считываются с интегрированного и эписомального вирусного генома.

Р"йон,& котором при неэкспрессирующийся при интеграции

Рис. 1 Структура генома папиллом человека 16 тала

1Л* Регуляция транскрипции вирусных генов.

Из представленных выше данных с очевидностью следует, что поддержание трансформированного фенотипа контролируется вирусными генами. В настоящее время можно считать установленным, что основными трансформирующими генами вирусов папиллом человека являются гены Е6 и Е7, экспрессия которых модулируется областью URB. Размер этой области составляет от 800 до 1000 пар оснований для HPV различных типов и условно может оыть разделена на 3 участка — 5' область, центральный сегмент, и V- область, которая расположена непосредственно перед двумя вышеуказанными генами. За генами Е6 и Е7 локализуются гены Е! и Е2, причем последний перекрывает ген Е4, и ген Е5, который также возможно является трансформирующим геном. Сигнальная терминирующая последовательность для поли, А локализуется на 3'-конце ранней области, Транскрипция РНК начинается с промотора в У — области URR, непосредственно перед началом гена Е6. Этот промотор получил обозначение Р97 для HPV 16 и PI05 для HPV 18. Промотор содержит 1АТА бокс и сайт инициации транскрипции, которые регулируются различными знхансерными элементами, локализованными в центральном и V = сегментах ORR. Именно они и узнаются клеточными факторами. 3f — область URR содержит также 2 сайта для вирусного траскрипционного фактора Е2, сайты связывания для клеточных транскрипционных факторов Spl и YYI и ориджины репликации с сайтом связывания для вирусного белка Ei,

Центральный сегмент URR содержит конститутивный энхансер, наиболее активный в эпителиальных клетках и зависящий только от клеточных факторов [16−19]. В этом участке идентифицированы сайты связывают для различных клеточных факторов, включая API, NF1, Octl, TEF1, TEF2, YY1, рецепторы стероидных гормонов. Все эти факторы являются убнквнтарными и могут функционировать в клетках различных типов. 5' -участок URR содержит сигналы для терминации и полиаденилирования поздних вирусных транскриптов [18].

Среди многочисленных факторов, способных взаимодействовать с участком URR. имеется лишь один фактор вирусной природы (продукт гена Е2), активность которого может иметь существенное значение для функционирования трансформирующих генов HPV. URR HPV содержит 4 В2 — связующих сайта. Данные по действию Е2 на транскрипцию генов Е-6 и Е7 носят противоречивый характер. С одной стороны, белки-продукты гена Е2 могут функционировать в качестве репрессоров для промотора HPV 18 типа [20], а мутации по гену Е2 увеличивает уровень иммортализации под действием генов Е6 и Е? [21]. С другой стороны — имеются данные о том, что белки Е2 HPV 16 и 18 типов активируют промотор в URR [22]. По-видимому эти различия обусловлены синтезом различно сплайсированных aiРНК данного гена, приводящих к образованием белков Е2 меньшего размера. Именно белок Е2, утерявшей N-концевой, трансакхнвирующий домен, может интерферировать с активирующими потенциями полноразмерного белка Е2 [22]. Таким образом, регуляция активности генов Е6 и Е7 под действием продукта вирусного гена Е2 является достаточно сложной, т.к. этот белок обладает двойной функцией — активатора и репрессора.

Среди многочисленных клеточных факторов, способных взаимодействовать с участком URR, отметим лишь некоторые из них, значимость которых для проявления функций генов Е6 и Е7 представляется очевидной, Это прежде всего фактор АР!, представляющий собой димерный белковый комплекс, содержащий по одному из представителей двух семейств генов Jim н fos. URR HPV 16 и 18 типов содержат соответственно 3 и 2 АР1 — связывающих сайтов. По-видимому, основная функция АР!-сайта — участие в определении специфичности транскрипта и уровня дифференцировки на транскрипционную активность URR [23]. Другим важным регулятором O RR является фактор YY1, причем в данной системе он может функционировать как активатор и как репрессор транскрипции в зависимости от типа вируса, типа клеток и активности других транскрипционных факторов и прежде всего фактора АР! [24,25]. Еще одна группа сайтов способна связывать С/ЕВР — (ССААТ/ знхансер связывающий белок) [26], причем факторы этого типа также могут взаимодействовать не только непосредственно с соответствующей областью ДНК в участке URR, во и образовывать комплексы с другими клеточными факторами. Основная функция этой группы генов — регуляция клеточной дифференцировки и активация генов различных цитокинов. Фактор SP1 способен связываться с элементом GC боксов и его сайт находится непосредственно рядом с ТАГА боксом. Этот фактор необходим для транскрипции вирусного генома [27]. Среди транскрипционных факторов, принадлежащих к группе ядерных рецепторов, две группы (рецепторы стероидных гормонов и тироид’ретиноидные) имеют рецепторы в URR области. Среди рецепторов стероидных гормонов — гликокортикоидные н прогестероновые, [28−30]. Сайт, отвечающий на гликортикоид (GRE) локализуется в 3' области между API и Spl связывающим сайтом. Оба типа рецепторов являются активаторами транскрипции. Фактор, специфический для керагиноцитов KR. F1, взаимодействуют с API для активации транскрипции ?31]. URR содержит также несколько связующих сайтов для белков с так называемым POU доменом, которые способны связываться с канонической октамериой последовательностью ATGCAAAT (тогда эти белки обозначаются как Oct). Один из белков этой группы (OctГ) репрессирует URR HPV 18 [32], а другом представитель этого семейства (Ерое 1), обладает обратным эффектом [33]. Для факторов семейства NF1 имеется несколько сайтов связывания в области конститутивного реп рессора [34]. Эти сайты обладают сравнительно низким аффинитетом и до-видимому являются необходимыми для проявления специфичности транскрипции в эпителиальных клетках, Транскрипционные факторы TEF1 и TEF2 имеют 4 сайта в энхасере HPV16 и они по-видимому являются активаторами для промотора Р97 [35],

Таким образом, представленная выше краткая сводка по факторам, регулирующим транскрипцию трансформирующих генов HPV, свидетельствует о том, что этот контроль носит весьма сложный характер, поскольку осуществляется многочисленными факторами, которые способны взаимодействовать как непосредственно с областью URR вирусного генома, так и друг с другом н обладающими позитивным и негативным влиянием на транскрипцию

2.3. Трансформирующие гены вирусов папиллом.

1 1 1 Т-1С<

J.X. J ш С/

Из представленных выше данных следует, что в злокачественных опухолях вирусная ДНК персиетирует как правило в интегрированной форме, причем разрыв в вирусном геноме, необходимый для встраивания в клеточный, происходит в основном в рамках El Е2, Из этого следует вывод о том, что, а трансформированных клетках интактными могут оставаться гены Е6 и Е7, экспрессия которых контролируется областью URR, Три группы доказательств свидетельствует в пользу того, что именно эти гены контролируют трансформированный фенотип клеток: I) гены Е6 и Е7 обладают трансформирующим потенциалом in vitro, 2) трансфецированные этими генами клетки способны индуцировать опухоли у бестнмусных мышей и 3) ингибирование экспрессии генов Е6/Е7 вызывает в клетках реверсию трасформированного фенотипа.

Ниже будут представлены данные о трансформирующим потенциале этих генов.

Гены Ш и Е7 транскрибируются с промотора Р9? (для HPV16) или Р! 05 (для HPV18) как полицистроииые тРНК [36]. Идентифицированы 5 различных тРНК, содержащих рамку- Е6, но только одна из них является полноразмерной = Четыре остальных вида являются укороченными и возникают в результате дифференциального сплайсинга либо внутри рамки

Еб, либо между рамкой Е6 и рамками Ei или Е2″ последовательности которых выявляются в этих еплайсированных РНК. Наиболее часто встречаемой является РНК, содержащая урезанный вариант Еб (обозначаемый Еб*) и полноразмерный — Е? [37,38]. Функции такой РНК остаются неясными.

Продукты генов Еб — белок, содержащий 150 аминокислот, с отсутствием каких-либо ферментативных активностей. Локализуются белки Еб в ядре, цитоплазме и мембранной фракции [39]. Белки достаточно консервативны и Еб HPV «низкого риска» гомологичны между собой на 80−90%, примерно сходные уровни гомологичности наблюдается и у HPV группы «высокого риска.» Между собой Еб этих двух групп сходны на 50−60%. Характерной особенностью белков Еб всех HPV является наличие 4 мотивов «цинковых пальцев» ?40], т. е. последовательностей, xapaKTq>Hbix для белков, способных взаимодействовать с ДНК, однако все попытки выявить такое взаимодействие закончились неудачно,

Исследование биологической активности генов Еб HPV высокого риска показало, что он как в одиночестве, так и в сочетании с геном Е7 способен к иммортализации клеток плоскоклеточного эпителия человека [41J и в отсутствие Е7 — к интерференции с дифференцировкой кератиноцитов, индуцируемой сывороткой и ионами Са2+ [42]. Кроме того, белки Еб способны к иммортализацин эпителия молочных желез человека [43]. Еб в кооперации с активированным онкогеном ras иммортализует фибробласты грызунов [44], а в сочетании с Е7 — индуцирует образование опухолей у трансгенных мышей [45].

В отличие от Е6 HPV «высокого риска» Еб HPV «низкого риска55 не способны ни к иммортализации, ни к трансформации [46].

Одной из главных мишеней действия гена Е6 является продукт генар53. Как известно, ген pS3 [47] является модулятором транскрипции и специфически взаимодействует с ДНК. Он способен трансактивировать такие важные гены как р2! WAFi, который является ингибитором циклин-зависимых киназ [48] и Ьах, участвующих в аноптозе клеток [49]. Этот ген активируется при обработке клеток ДНК — повреждающими агентами и в условиях гипоксии [50,51]. Мутантный вариант гена р53, регулярно выявляемый во в многих опухолях, не способен к осуществлению функций, описанных выше, и. кроме того, в некоторых опухолях его локализация ограничена цитоплазмой [52].

Ранее было показано, что белок гена р53 способен копрецшгатироваться с большим Т-антигеном вируса SV40 и продуктом раннего гена El, а аденовируса из клеток, зараженных этими вирусами [53,54]. На основании этого было высказано предположение о роли р53 в проявлении онкогенного потенциала этих вирусов. Оказалось, что белок Еб HPV «высокого риска» (но sie «низкого риска») также способен взаимодействовать ср53 в системах in vitro [55]. Однако, по-видимому, биологический смысл взаимодействия вирусных генов с р53 в этих трех системах различен, поскольку для' первых двух систем образование комплекса способствует стабилизации белка р53, а в системе с Е7 HPV период полужизни р53 наоборот уменьшается. Это связано с тем, что происходит деградация белка р53 за счет системы убвквитина. [56], которая является основным элементом селективной деградации цитозольных и ядерных белков в клетках эукарнот [57], Для деградации р53 под действием Е6 необходимо предварительное образование комплеса между Е6 и одним из компонентов этого комплекса -убнквитин — протеин лигазы, обозначаемой как Е6-АР [58] и имеющей молекулярную массу в 100 кД.

Кроме способности вызывать деградацию p53s Еб ингибирует такие функции р53 дикого типа как транскрипционная активация и транскрипционная репрессия, т. е. конкурирует за те функции, которые являются определяющими в выполнении р53 супрессорных функций в опухолевом росте. Показано также, что Е6 увеличивает уровень мутагенеза и генетической нестабильности [59]. Поскольку в подавляющем большинстве карцином шейки матки (в отличие от многих других опухолей человека) отсутствуют мутации в гене р53 [60], можно предполагать, что экспрессия белка Еб HPV «высокого риска» в итоге оказывает на р53 такое же воздействие, как и соматические мутации, т. е. потеря р53 регулируемой транскрипции и ингибировании нормального клеточного ответа на повреждения ДНК.

Кроме основного свойства белка Еб взаимодействовать с р53. этот белок обладает ещё рядом свойств, которые могут вносить вклад в процесс трансформации и которые независимы от р53. К их числу относятся активация гетеролох ичных промоторов [61], уменьшение апоптоза [62], активация теломеразы, ферментативного РНК-белкового комплекса, полдерживающего размер теломерной области хромосом [63], связывание с Са2+ - связывающим белком Е6БР, идентичным белку ERC 55 [64], взаимодействие с малоизученной протеинкнназой и ее субстратом [65], трансактивации промоторов а- протимозина и с-тус [66].

Функциональная значимость этих взаимодействий остается пока неясной. 2.3.2. Ген Е7.

Продуктом гена Е7 является сравнительно небольшой фосфобелок, содержащий 98 аминокислот. N-концевой домен этого белка (аминокислоты !-38) содержит в основном гидрофильные аминокислоты, в то время как С-концевой домен (аминокислоты 39−98) — более гидрофобен. Несмотря на расчетный молекулярный вес И кД белок Е-? HPV i 6 мигрирует при электрофорезе в п оли акр и ламид н ом геле как молекула с массой в 18−20 кД [67]. Е7 структурно и функционально родственен белкам других ДНК-содержащих вирусов, таких как большой Т-антиген вируса SV40 и ранний бедок El, А аденовируса. Белок Е7 может быть разделен на 3 основных домена — консервативный участок i (CRI), консервативный участок 2 (CR2) и консервативный участок 3 (CR3). Все три домена необходимы для проявления биологической активности Е7 {68].

Участок CRI кодирует короткую последовательность аминокислот (6−20), которая является высококонсервативной и сходной с таковой в CRI EiA аденовируса. Несмотря на это существует функциональное различие- между CRI v белков этих bhovcob — CRI El, А способен взаимодействовать с такими

J Я. *> ' pocket" бешеами как рЗОО и с меньшей эффективностью с pRb. а то время как CR1 Е7 не способен взаимодействовать с этим белком [69]. Делеции или точечные мутации в CRI F.7 HPV 16 приводят к резкому снижению трансформирующего потенциала этого гена [70].

CR2 HPV 16 Е7 содержит домен LXCXE (аминокислоты 21−40), который ответственен за взаимодействие с «pocket» белками (белок pi05 гена еупрессора pRb и родственные белки р!07 и р130). Любые мутации в этой области элиминируют способность взаимодействовать с pRb и подавляют трансформирующую активность Е7 [71]. HPV «низкого риска», имеют одно характерное отличие — в CR2 домене вместо аспарагиновой кислоты в позиции 21 в Е7 HPV16, и в CR i HPV типов 6 и 11 находятся глицин. По-видимому, именно эта замена обеспечивает Е7 HPV «высокого риска» более высокое сродство с pRb и способность кооперировать с активированным онкогеном ras при трансформации первичных клеток грызунов [72]. Кроме главного сайта связывания с pRb в CR2, возможно, существует еще один сайт в домене CR3, участвующий в ассоциации epRb [73].

С-концевая область домена CR2 содержит сайт для казеин-киназы II (CK II) (серины в позициях 3! и 32). Именно эти два аминокислотных остатка фосфорилируются in vitro CK II. Билогический смысл фосфорилирования остается неясным, но не исключено, что этот сайт каким-ro образом вовлечен в трансформацию. Замена Двух указанных сериновых остатков незаряженными остатками аланина снижает способность Е7 к трансформации первичных клеток при совместной траисфекции с Ras, в то время как: замена на отрицательно заряженый остаток аспарагиной кислоты приводит к формированию фенотипа дикого тина [74]. Кроме того, фосфорнлование этих двух сериновых остатков резко усиливает взаимодействие белка Е7 HPV! 6 с TATA — боксом связующего белка ТВР

Домен CKJ HPV 16 Е7 имеет очень слабую гомологию с CR3 доменом белка El, А аденовируса, но оба домена содержат две СХХС п о следов ат ел ь н о от и, участвующие в связывании с Zn2+ [76]. Последовательности CR3 Е7 (аминокислоты 41−98) существенно отличаются от таковых у белков, содержащих «цинковые пальцы». Связывание Е7 с Zn2+ приводит к димеризации белка Е7 и невидимому димеризация является важным моментом в проявлении трансформирующей активности Е7 [77].

Что касается локализация Е7, хо первоначально были получены противоречивые результаты, повидимому обусловленные тем, что этот белок замаскирован в клетках и далеко не все его эпитопы доступны используемым антителам. Совокупность имеющихся данных позволяет считать, что Е7 локализуется в нескольких клеточных фракциях — главным образом в ядре и ядрышке [78,79].

Иммортал изующие и трансформирующие потенции Е7 HPV «высокого риска» зависят от типа используемых дня этой цели клеток, Е- HPV 16 и 18 типов способен индуцировать образование фокусов трансформации и рост в полужидком агаре в различных стабильных клеточных линиях фибробластов грызунов., таких к примеру как NIH ЗТЗ и Y31 [80,81]. Для Е7 HPV «низкого риска» наблюдается меньшая эффективность трансформации: клетки не способны к росту в полужидком агаре, но являются туморогенными для бестимусных мышей [82].

Е7 белки HPV! 6 или HPV 18 сами по себе способны к иммортализации первичных клеток грызунов [83], а в сочетании с активированным ras — к их трансформации [84]. В системе кератиноцитов человека ген Е7 вызывает ймморталйзацию, эффективность которой существенно возрастает при котрансфекции с геном Е6 HPV «высокого риска/' В некоторых случаях такая котрансфекция может приводить и к трансформации [85]. Кроме того, ген Е7 может вызывать иммортализацию еще нескольких типов клеток, таких как эпителиальные клетки молочных желез, клетки поверхностного эпителия яичника [86,87]. Е7 и Е6 гены HPV «низкого риска» не способны к имморталиэации первичных кератиноцитов [88].

Основная функция гена Е7 HPV «высокого риска» сводится к дерегулирующему эффекту на прохождение клеточного цикла, в основном йидуцируя переход покоящихся клеток из Сто — в S — фазу. Это осуществляется за счет активации некоторых клеточных генов иод влиянием Е7 и в результате прямого взаимодействия Е7 с белками, регулирующими прохождение клеточного цикла.

В клеточном цикле можно выделить 2 основных этапа — репликация генома и последущее деление клетки. Эти 2 события разделены 2 фазами — Gi до репликации ДНК и Gi до митоза. Правильность прохождения цикла контролируется циклин-зависимыми протеннкиназами (CDK). В нормальных клетках переход из Go фазы запускается факторами роста, и рецепторами этих факторов, специфичными для данного типа клеток. На этом этане ростовые факторы активируют экспрессию циклинов Д-типа и ассоциированных с ними киназ. (CDK 4 или CDK 6), индуцируя в свою очередь переход клеток в (.< j фзну, активируют ЦИКЛИHЫ Е И A, И фактор транскрипции E2F-1. Белки семейства гена ретинобластомы («pocket») -pRb, pi 07, pi 30 блокируют прогрессию клеточного цикла путем взаимодействия с клеточными транскрипционными факторами семейства T2 °F и DP. «Pocket» белки инактивируются в результате фосфоршгароваиия по многим сайтам под действием СВК, что приводит к образованию транскрипционно активных гетеродамеров E2F/DP. Такие ингибиторы CDK как р!5 ink 4 В, р! б ink Y, p21 waf-l и p27 kip 1 задерживают клетки в G! фазе, путем ограничения фосфорнлирования pRb и родственных белков [89].

Ген Е7 HPV16 обеспечивает переход клеток из G1 в S фазу клеточного цикла и увеличивает пролиферативную активность первичных кератиноцитов и эпителиальных клеток молочных желез человека. Ген Е7 способен преодолевать контроль за прохождением клеточного цикла на границе G1/S, что позволяет предполагать, что Е7 способен либо нейтрализовать, либо преодолевать блокирующий эффект физиологических ингибиторов CDK таких как p21 waf и p27kip J, которые индуцируются р53 и удалением сыворотки [90].

Ген Е7 HFV16 способен к взаимодействию с белком гена=супресеора pRMOS, что приводит к возрастанию деградации pRb [91[, Это сопровождается индукцией активности семейства клеточных транскрипционных факторов, состоящих из множественных E2F/DP гетероднмеров. Е7 и E2F-1 связываются с различными сайтами на pRb [92]. С участком CR2 на Е7 связывается также pRb — родственный белок р 107 [93].

На разных фазах клеточного цикла существует 2 различных комплекса. E2F-р 107, но Е7 селективно разрушает комплекс, специфичный для Gl фазы [94].

Среди генов, которые активируются в результате освобождения E2 °F. идентифицирован ген Е2 аденовируса 5 типа, а также гены, кодирующие В-myb, циклины, А и Е [95−97].

Кроме pR b и его родственников, связанных с регуляцией клеточного цикла, существуют и другие белки-регуляторы транскрипции, являющиеся мишенями для Е7. Сюда относятся семейство транскрипционных факторов АР-1. В результате взамодействия с АР-1. происходит трансактивация АР-1 направляемых генов [98]. Кроме того, Е7 HPV!6 способен связываться с ТАТА-бокс взаимодействующим белком и ТВР — ассоциированным факторм TAF 110 [99].

Доказана возможность физического взаимодействия Е7 HPV 16 с циклином, А и CDK2 через CR2 домен [100], а также с циклином Е в комплексе CDK2 и р 10? [101]. Не исключено, что взаимодействие Е7 с циклинами опосредовано рЮ7, который, как было указано выше, способен ассоциироваться с циклинами, А и Е [102]. Ингибитор CDK p27kip 1 связывается с Е7 через С-концевой домен, что приводит к функциональной инактивации р27 kip 1 [103].

Одной из удивительных способностей Е7 HPV 16 является его способность и к пролиферации и к апонтозу. Последний феномен четко проявляется в нормальных фибробластах человека в отсутствии активности гена Е6 [104]. Ответственным за проявление этой активности является pRb — связывающий домен Е7. Характерно, что апоптоз под действием Е7 проявляется в клетках

ГиЫШёЙ С УД ЗЛЁН H hi m T’cHuM рэЗ. Iffi? ai ОбрШЮМ, ЭПОПХ’ОЗ под действием Е/ может проявляться по р53 зависимому и р53~ не- зависимому пути [S3].

4″ Ф^Ж1ди0?.1"1-льн"я кэ". жЁрз5д||н оккоб^лков Еб и F/7, Как видно из представленных выше данных, оикобепки Еб и Е7 обладают оикогенным потенциалом per se, но этот потенциал существенно возрастает при совместной экспрессии [4!, 85]. Это свидетельствует о том, что вирусные факторы могут функционально кооперировать в процессе клеточной трансформации. По-видимому наиболее интересный аспект этой проблемы состоит в том. что Еб может потенциировать нарушение контроля за регуляцией размножения путем активирования апоптоза, направляемого Е7. Это нашло экспериментальное подверждение на модели трансгенных мышей [105], а также в уроэпитеяиальных клетках человека [106]. Таким образом, функциональная кооперация между белками Еб и Е7 HFV '"высокого риска"'' в процессе трансформации хотя бы частично может быть связана с Еб — индуцированным ингнбированием апоптоза. Это сопровождается элиминацией клеток с нарушенной системой ростовых сигналов, включая и т. е. которые направляются Е7. функции Еб и Е7 также тесно связаны и на уровне дерегуляции клеточного цикла и размножение клеток. По этой схеме pRb является общей мишенью для обоих вирусных белков в результате физического взаимодействия с Е7 и изменения уровня фосфорилирования под действием Еб. По этому сценарию Еб подавляет активацию p21 waf (ингибитор цимшн — зависимых киназ), опосредованную р53 [48]. Индукция p2i waf под действием р контролирует нефоефоршгарованый рКЬ, который является необходимым для функционирования р!.Ь, как контролирующего фактора в О ¡--фазе клеточного цикла [107]. Йнгибирование индукции р21 \-af (опосредованное р53) под действием р53 может приводить к нарушениям в контролирующих функциях рКЬ и таким образом кооперировать в инактивации рКЬ при связывании с Е7.

Глава 5, Материалы и методы

ЗЛ, Список использованных растворов и сред.

5ТЕ буфер: 100 rnMNaCl, 10 шМ трис-HCl, рН 8.0,1 тМЭДТА ТЕ буфер: 10 тМ трис-HCl, рН 8.0, 1 тМЭДТА

SDS: додецилсульфат натрия

SSC буфер: 0.15 MNaCi, u. OlS М цитрат натрия, рН 7.

Буфер R для рестрикции («Сибэнзим», 10 mM Tris-HCl рН 8.5, 10 тМ

MgCls, 100 rnMNaCl, 1 шМDTT).

Буфер для лигирования: 50 тМ хрис-HCi, рН 7.5, 7 шМ MgCb, 1 mM Дитиотритол, 1 mM спермидин, 1 тМАТФ.

Набор для элюцин фрагментов ДНК из агарозных гелей, «-Gene Clean Kit» (Bio 101)

Набор для получения радиоактивно меченых зондов при помощи фрагмента Кленова («Muiiiprime DNA Labelling System"Amersham5').

Растворы для выделения шхазмнд:

N1: 50 юМ глюкозы, 25 тМ трис-HCl, рН 8.0, 10 тМЭДТА N2: 0.2 М NaOH, 1% SDS «N3: 5 М ацетат калия, рН 4.

Среда LB: 10 г NaCl. 10 г пептона. 5 г дрожжевого экстракта на 1л Селективный агар Мс Coneey ('Gibco'). Раствор CaCli для трансфекции (2.5 М CaCh). ixHBS-буфер для трансфекции: 2.80 mMNaCi, 10 mMKCl, 1.5 inM NaaHPO/t <2НгО, 12 mM декстрозы, 50 шМ HEPES

Буфер для гибридизации: 7% SDS, 0.25 М NaHP04 (0.5 М NaHP04 + 0.5 М

В обзоре литературы настоящей работы обобщены данные по этиологической роли HPV в канцерогенезе шейки матки. Основную роль в превращении нормальных клеток в опухолевые играют 2 ранних гена Е6 и Е7, контролируемых собственным промотором. Эти гены взаимодействуют с генами — супрессорами и генами — регуляторами клеточного цикла, нарушают нормальный контроль клеточного деления. Как следствие этого опухолевая клетка приобретает способность к неограниченному росту. По-видимому, один из ключевых моментов в этом процессевзаимодействие гена Е-7 HPV высокого риска с продуктом гена ретинобластомы Rb 105. Белок этого гена, как это было показано главным образом на модели HPV 16, взаимодействует с доменом CR2 гена Е7, нарушая функции гена Rb. Функции двух других доменов этого генаCR! на У-конце гена н СЕЗ на З'-конце до конца окончательно не выяснены (ем. обзор литературы), но точечные мутации в CR I домене могут влиять на трансформирующий потенциал гена Е7.

Функциональнаязначимость различных доменов гена Е7 сравнительно подробно проанализирована на HPV тип 16, в то время как для HPV других типов этот вопрос изучен сравнительно мало.

В связи с этим мы поставили своей задачей получить различные мутанты гена Е7 по указанным доменам и изучить их биологические свойства и трансформирующий потенциал.

С этой целью мы использовали плазмиду рС7, любезно предоставленную нам проф. Н. zur Hausen (DKFZ. Germany). По информации, полученной ох Д-р Е. Schwarte, было известно, что эта нлазмида содержит вставку в 1400 пар иуклеотидов, содержащую в том числе и последовательности генов Е6 и Е7 HPV тин 18 и клонированную из карциномы шейки матки. Плазмида была сконструирована таким образом, что оба гена находились под контролем промотора вируса цитомегалии (CMV), (рис.2а). Ранее было показано [115], что эта плаз ми да обладает способностью к трансформации имморталиэованных фибробластов крыс и можно было предполагать, что гены Е6 и Е7 сохранили свой исходный трансформирующий потенциал. Поскольку подробная информация нуклеотидной последовательности вставки в плазмиде рС7 отсуствовала, представлялось целесообразным провести секвенирование этой вставки и охарактеризовать имеющиеся последовательности, Все исследования по клонированию и секвенированито выполнены совместно с В. П. Вейко и Л. Б. Гулько (Лаборатория биоорганической химии, Государственного Научно-Исследовательского Института Генетики и Селекции Промышленных Микроорганизмов. Москва).

1.2. Молекулярное клонирование.

4.2.1.Анализ последовательное! ей вставки в нлязшаде рС7.

На первом этапе фрагмент ДНК EcoRI-EcoRI размером 1400 пар нуклеотидов был переклонирован в плазмиду pUCIS (рис.З). Последующий сиквенсный анализ показал, что эта вставка имеет комплексную структуру, состоящую из 5 типов последовательностей (рие.26) — на «левом» конце между сайтом EcoRI и 5® началом гена Е6 выявлена 40 — членная фланкирующая последоватеш, ность (ФНП 1), следующего состава: GA АТТ CGG TGT ATA ТАА AAG ATG TGA GAA ACG САС САС ААТ ACT. За этой последовательностью следует ген Е6, содержащий 477 пар нуклеотидов, затем межгенный спейсер в 8 пар нуклеотидов, затем ген Е7 из 318 пар нуклеотидов и вторая фланкирующая последовательность (ФНП2) до второго сайта EcoRI, содержащая ~500 нар нуклеотидов, 102 нуклеотида этой последовательности, от сайта EcoRI в сторону 5' -аставки, были секвенированы. Данная последовательность была проведена через банк данных EMBL. Однако гомологии с какими — либо вирусными последовательностями обнаружено не было.

Можно предполагать, что эта последовательность имеет клеточное происхождение и подтверждением этому служит тот факт, что на 3'- конце ФНП-2 выявлено тракт олиго (dT), содержащий ! 1 нуклеотидов, который комплементарен поли Аучастку на мРНК.

Секвенирование генов Ео и Е7 показало, что их рамки считывания содержат по 477 и 318 пар нуклеотидов соответственно, что соответствует литературным данным. Полученные результаты представлены на рис 4а и.

46, где для сравнения приведены данные по нуклеотвднон последовательности указанных генов прототипного варианта HPV 18 [12!]. Из этих данных следует, что в гене Еб, содержащим 477 пар нуклеотидов и кодирующим 158 аминокислот, выявлено несколько мутаций в кодонах 49, 127 (в обоих замена ТГТ на ITC), 90 (замена TTG на ITA), 148 (замена GAA на GAG), 149 (замена CGA на AGA), которые не приводят к изменению аминокислотных остатков в последовательности белка. В одном случае мутация является значащей — в кодоне 129 замена ААС на AAA и как результат этого замещение аспарагина на лизин. Примерно сходная картина наблюдается и для гена Е7 (содержащим 318 пар нуклеотидов и кодирующим белок в 105 аминокислот). Однако, в этом случае выявлена только одна незначащая мутация в кодоне 17 (замена ССС на ССТ) и одна значащая — в кодоне 92 (замена ААС на AAA), также приводящая к замене аспарагина на лизин .

Таким образом, в исиользованой плазмиде рС7 присутствуют оба интактных гена Б6 иЕ7, каждый из которых содержит по несколько точечных мутаций, причем одна из этих мутаций для каждого из генов является значащей и локализуется в С-конце каждого из генов (для гена Е7 это CR3 домен).

Eco RI E6-E7 / 1400 п.н. on /* цач/ Г .1. iyi V.

-.C'l ie-oRI.

EcoRI s.

ИГ.

Рестрикция EeeRi.

Ретрикция.

E&-E7 (1400 lui.) pUCIS (EeoRi).

EcoRI Е6-Б7.

У 1400.

H.H., / ио.

Vй5″ .

RI l PUCE6-E7.

Сявшцмшшше кришшг.

Секвеннрование.

Рие:3.

Схема субвинширования фрашшта ДНК" содержащего гены Еб и Е7 HPVIS a pUCIS.

Рис:4.

Сравнение последовательностей генов Е6 (а) и Е7(б) HPV18, клонированньга: в составе шгашиды рС7, с их нрототипным вариантом. Р-носледовательносп" прототипа генов Е6 и Е7 HPV 18. М-последовательность генов Е6 и Е7 HPV18, клонированных в составе плазмиды рС7.

N/Kмут ация (замена aciiapaiima на лизин). аДмдМШательтащ^шаЖНЕ08 в состав^вС?:

Ш A R F F D Р Т R R Р Y К L Р D 1,17 A. TG GCG CGC Т Т Т GAG GAT CCA АСА CGG CGA CCC TAC AAG СТА CGI GAT CTG P ATG GCG CGC T T T GAG GAT CCA АСА CGG CGA CCC TAC AAG СТА CCT G AT CTG M.

18CTBLNTSLQ DI EI T С V Y34.

TGC AGG GAA CTG AAC ACT TCA CTG CAA GAC ATA GAA ATA ACC TGT G 'TA TAT P TGC ACG GAA CTG AAC ACT TCA CTG CAA GAC ATA GAA ATA ACC TGT GTA TAT M.

35CK T V L E L T E V FE F A F К D 51 TGC AAG ACA GTA TTG GAA GTT АСА GAG GTA TTT GAA TTT GCA TTT AAA GAT P.

TGC AAG АСА GTA TTG GAA CTT АСА GAG GTA TTT GAA TTT GCA TTC AAA. G AT M.

52L F V V Y R D S I P H A A С H К С 68 TTA TTT GTG GTG TAT AGA GAC AGT ATA COG GAT CCT GCA TGC CAT AAA TGT P.

Г T’A TTT GTG GTG TAT AGA GAC: AGT ATACCG CAT GCT GCA TGC CAT AAA TGT M.

691 D F Y S R I R E L R H Y 3 D S V 85 ATA GAT TTT TAT TCT AGA ATT AGA GAA TTA AGA CAT TAT TCA GAC TCT GTG P.

ATA G AT TTT TAT TCT AGA ATT AGA GAA TTA AGA CAT TAT TCA GAC TCT GTG M.

8oY G D 'Г L E К L T N T G L Y N L L102 TAT GGA GAC АСА T TG GAA AAA СТА .ACT AAC ACT GGG T TA TAC AAT T TA T TA P TAT GGA GAC ACA. TTA GAA AAA СТА ACT AAC ACT GGG T TA TAC AAT T TA TTA M.

1031 RCLRCQKP L N P A E К L R1S9 ATA AGG TGC CTG CGG TGC GAG AAA CCG TTG AAT CCA GCA GAA AAA. CT T AGA P ATA. AGG TGC CTG CGG TGC CAG AAA CCG T TG AAT CCA. GCA GAA AAA CT T AGA M.

20H L N E К. R R F PI N/K I A G H Y R G136 CAC CTT AAT GAA AAA CGA CGA TTT CAC AAC ATA GCT GGG CAC TAT AGA GGC P CAС CTT AAT GAA AAA CGA CGA TTC CAC AAA ATA GCT GGG CAG TAT AGA GGC M.

1370 С H SC С N R A R Q В R L Q RR 153 CAG TGC CAT TOG TGC TGC AAC CGA GCA CGA GAG GAA CGA CTC CAA. CGA CGC P CAG TGC CAT TCG TGC TGC AAC CGA GCA CGA CAG GAG AGA CTC CAA CGA CGCM.

54R E T Q У & 159 AGA GAA ACA CAA GTA TAA P.

AGA GAA ACA CAA GTA TAA M.

6- Последовательность гена Е7 HPVI8 в составе рС7: M H GPK A TL QD I VL HL Б P17 ATG CAT OGA CCT AAG GCA ACA TTG CAA GAC ATT G TA TTG CAT TTAGAGCCC P.

ATG CAT GGA CCT AAG GCA ACA TTG CAA GAC ATT GTA TTG CAT TTA GAG CCT M.

8Q N В I P VDLL CHE О L S D S 34 CCA AAT GAAATT CCG GTT GAC CTT СТА TGT CAC GAG CAA TTA AGG GAC TCA P CCA AAT GAA ATT CCG GTT GAC CTT СТА TGT CAC GAG CAA TTA AGG GAC TCA M.

3SB В ENDE I D G? N H О H L P A5I GAG GAA GAAAAC GAT GAA ATA GAT GGA GTT AAT CAT CAA CAT TTA CCA GCC P.

GAG GAA GAA AAC GAT GAA ATA GAT GGA GTT AAT CAT CAA CAT TTA CCA GCC M.

52RRA E F O R H T M L С M С С К C6B CGA COA GCC GAA CCA. CAA CGT CAC ACA ATG T TG TGT ATG TGT TGT AAG TGT P CGA CGA GCC GAA CCA CAA CGT CAC ACA ATG TTG TGT ATG TGT TGT AAG TGT M.

59EARIELVVE SSADDLR A85 GAA GCC AGA AT T GAG СТА GTA GTA GAA AGC TCA GCA GAC GAC CT T CGA GCA P.

GAA GCC AGA ATT GAG СТА GTA GTA GAA AGC TCA GCA GAC GAC CTT CGA GCAM.

86 °F O Q L F I, N/K T L S F? С P W С АЮ2 TTC CAG CAG CTG TTT CTG AAC ACC CTG ТСС TTT G TG TGT CCG TGG TGT CAG P TTC CAG CAG CTG TTT CTG AAA ACC CTG ТСС TTT G TG TGT CCG TGG TGT CAG M.

1038 О О S i 06.

GCA ТСС CAGT5AA P.

GCA TCC CAG VA. U M.

1.2.2. Субклонирование генов Еб и Е7. а). Ген Еб.

Субклонирование гена Еб проводили в два этапа (рис.5). Сначала проводили PCR с использованием пряного праймера, локализированного в области CMV-промотора, и обратного праймера, локализованного в 3'-области гена Е6. Этот праймер, кроме того, содержит сайт чувствительности к реетриктазе EcoRI. Полученный продукт клонировали в составе плазмиды poC'18 для определения нуклеотидиой последовательности. Сиквенс такого клона показал, что каких — либо дополнительных изменений в составе гена Е6 не обнаружено. Полученная плазмида получила обозначение pUC-Еб.

Для проверки биологической активности данного гена EcoRI — EcoRI фрагмент pUC-E6, содержащий соответственно 540 пар нукпеотндов (т.е. ФНШ 4- ген Еб), был лигирован с рестрицированным по EcoRI бифункциональным вектором DelpC'7. Этот последный вектор был получен в результате вырезки из состава исходной плазмиды EcoRI ~ EcoRI фрагмента, содержащего оба гена Еб и Е7. Схема этого протокола представлена на рис. 5. Полученной лигазной смесью трансформировали клетки Е. coli С600 гесА, и плазмидную ДНК отобранных трансформантов проверяли рестрикционным анализом. Как следует из электрофоретического разделения продуктов рестрикции (рис.6) и PCR, плазмида. DelpEo содержит фрагмент в 540 п.н., который содержит ФНШ (40 п.н.) и кодирующую последовательность гена Нб HPV 18. Естественно. что эта последовательность как, и в исходной плазмиде рС7, контролируется промотором CMV. kcqki И.

EPXMV В? ' E6-E7 pC7.

EcoRI 4 pi E7K-1 pr. CE 7−1.

ITnpT" «.

ECQM.

E7.

E00R! pr. CMV-2/' pr. ПЦР.

E6.

EeoRI «.

EeoRI T4-D.N.A-Pi'ClS/Ec-ofil лиг аза.

PUClS/EeoRI iieoRI. Еб.

Г «EcoKi i .Л i pUC-i?o I.

I I / / pr. CMV-2.

ПЦРП fralМШ.

•—t.

EeoRI T4-DNA-DelpCT/EcoRI миг аза.

DeIpC?/EcoRI E coRl.

Еб «.

EP. E f4(LIIT ^.

— IVl i / / fJete-Ёб и кКВкН ii FOB A H И E.

EeoRI Взаимная дострошеа i jpr CMV-2 nilPiliipr CR7-I.

EeoRI i.

EeoRI il-7.

EeoRI T4- D’N А-дигазз.

EeoRI E7 EeoRI г piKJ-E?

EeoRI j T4-DNA-I дигаза} !

ШеоЩ-Л.

EcoRI.

EP, CMV, 0y E7 «X / Ddp-E7.

Phc:5 Ciewa клонирования гшв Еб и Е7 HPV18 в составе плающды 0е1рС7, под контролем промотора CMV.

Рис:6.

Эяектрофоретическое разделение фрагментов в 1% агарозе: а: Трек 1 — ДНК фага X, расщепленная по Pst 1,.

Трек 2- ДНК плазмяды PUC-E7, расщепленная по EcoRI. Стрелка показывает фрагмент ДНК, несущий геи Е7 HPV] 8, размером 362 пн. бТрек i — ДНК плазм иды PUC-E6, реетри ц ир сран ной по EcoRi. Нижная стрелка показывает фрагмент ДНК, несущий гена Е6 HPV18, размером 540 пн,.

Грек 2-ДНК нативной плазмида PUC-E6.

Трек 3- ДНК плазмнды рС7, рестрицированной по EcoRL Верхняя стрелка показывает фрагмент ДНК, несущий гены Е6 и Е7 HPVI8, размером 1400 пн.

Трек 4- ДНК нативиой плазмнды рС7, Трек 5- ДНК фага X, расщепленная по Pst i. б). Ген Е7.

Сходная процедура была, использована нами и при клонировании гена Е7. При этом, поскольку ФНП1, выполняющий функцию инициации транскрипции, оказался эффективен в случае клонирования гена Еб, то и в этом случае мы решили его сохранить. Кроме того, первоначально мы решили сохранить и участок ФНШ, т. е. схематично получить клон, содержащий промотор CMV-ФНПI-Е7-ФНП2.

Для клонирования использовали лвухэтапный PCR (mm.'T). Для пеовой.

Ч Л. 1 • ¦=> Л г 4 л реакции использовали прямой праймер в промоторе CMV и обратный на З'-конце ФНП1, т. е. осуществляли амплификацию ФНШ. На втором этапе прямой праймер локализовался на 5'-конце гена Е7 и при этом был комплементарен обратному праймеру первой реакции амплификации, а второй праймер локализовался на З'-конце ФПН2. Полученные продукты PCR отжигали, клонировали в pUC18, трансформировали бактерии с последующим анализом клонов PCR с праймерами к 3'-5'-концам гена Е7. Однако оказалось, что в этих условиях наработать неоходимого количества шшзмидной ДНК не удавалось. Было высказано предположение, что негативным фактором может служить ФНШ, и соответственно, было решено удалить эту последовательность. Для этого использовали модифицированную схему, описанную выше (рис 5). Для этого первоначально амплифицировали участок ФНШ, затем ген Е7 из плазм иды рС7, при этом прямой праймер первой реакции и обратный праймер второй реакции были комплементарны. Кроме того, обратный праймер второй реакции содержал сайт чувствительности по EcoRI, необходимый для клонирования в pUC18. После лигирования в составе плазмиды DelpC? и трансформации клеток E. coii был отобран клон, который по данным еиквенса оказался идентиченым родительскому гену Е7, т. е. содержал мутацию в кодоне 92 (замена ААС на ААА).

Использование рестриктного анализа (рис.6) и PCR подтвердило. что плазмида, обозначенная как DeipE7, содержит ген Е7 в 362 п.н., а общая вставка имеет структуру ФНШ+ генЕ7.

Следовательно, был выполнен первый этап работы, связанный с клонированием интактных экспрессирующихся генов Е6 и Е7 HPV тип 18.

EeoRy Е6-Е7 EeoRJ.

EF.CMVi.

C7 X.

EeoRI y m~W! ^.

XjEeoKl pLiC E6-E7.

PT.CMV2? pr. R7K-l I ГЩР.

EcoRI i ФНШ pr. CMV2 j i'.rJJit s ГЩР.

SeoRX ФНП1.

Em ¦l.

EcoRI.

Рестрикции (EcoRS) PUCIS (KooRI) T4~DNA-niira3a.

Скрининг.

Сжема шюБЕЦвванш гена Е? HPV18 е фланкирующими фрашштами, в £"мтшё ш! шш!де рУС!8 .

4=2.3. Получение и клонирование новых мутантнмк вариантов гена Е7 HPV 18. Одна из основных задач этого исследования состояла в получении и клонировании мутантных вариантов гена Е7 по каждому из трех известных для этого гена доменов. Поскольку оказалось, что в гене Е7 HPV 18 в составе ялазмиды рС7 уже имеется мутация в домене CR3, то мы сосредоточили внимание на двух других доменах CRI и CR2.

Для выбора сайта мутации мы предварительно использовали литературные данные и сравнивали консервативные домены CR1 и CR2 между HPV 18 и HPV 16 (рис.8).

СЕ2.

— pR. B bdg—j ! 30 40.

DLYCYEQLN DSSEEE Dil DG I: 30 40.

PVDS.LCHEQLSD SEEENDEIDG у.

Рис.8: Сравнение аминокислотных последовательности CRi и CR2 гена Е7 между HPV 16 и HPV! 8.

Известно, что известными сайтами мутации в гене Е7 HPV 16 являются ко доны 610 в CR! домене и кодоны 21−24 в CR2 -домене, где локализован сайт связывания с белком гена ретинобластомы. Кодон 10 в Е7 HPV 16 так же соответствует кодону 10 в Е7 HPV18. а кодон 21 в HPV 16 соответствует кодону 24 в HPV18. Именно кодоны 10 и 24 в Е7 HPV 18 и были использованы для сайтнаправленного мутагенеза (рис.9).

Для этого па первом этапе синтезировали 3'-конец фрагмента гена Е7. содержащего ФНШ с помощью пранмеров, из которых прямой локализовался.

10 20 Е7 HPV16 MHGDT PTLHE YMLDLQ РЕТТ.

10 20 Е7 HPV 18 МНСРК ATLQD1V LHLEPQNEI на промоторе CMV, а обратный (таблица 2), включал ко дон для мутации, при этом содержал одну нуклеотидную замену.

Сходным образом синтезировали 5'-конец фрагмента гена Е7 с помощью двух других праймеров, причем прямой был комплементарен обратному праймеру первой реакции и тоже содержал нуклеотидную замену (таблица, 2), а обратный праймер, локализовался на 3'- конце гена Е7. В результате были получены по два фрагмента для каждой мутации;

— для. ко дона 10 — 5' фрагмент содержа:! 165 нар нуклеотидов, а 3'-фрагмент-367 пар нуклеотидов, — для ко дона 24 — 5' фрагмент содержал 205 пар нуклеотидов, и 3″ ' фрагмент -327 пар нуклеотидов.

На втором этапе PCR проводили отжиг данных фрагментов и получали полноразмерный фрагмент, содержащий ген В7 с соответствующий мутацией. Данный мутантный ген Е7 клонировали, как описано ранее (см. 4,2.2, Б). Отбор целевых трасформантов осуществляли методом PCR с помощью праймеров CM. V2 и CE7-I, комплементарных промотору CMV (рнс, 2б) и 3'=концу гена Е7 соответственно. Из отобранных клонов выделяли плазмидную ДНК и определяли нуклеотидную последовательность вставок по Sanger. В результате были получены две новых экспрес&ирующихся плазмиды, несущих целевые мутации и не содержащих таковых в остальных частях гена (рисЛ 0 а и б).

•j-jf илазмиды получили следующие обозначении :

DelpE?(92)10 — содержащая мутацию в гене Е7 в кодоне 10 (GAC-+AAC, замена Asp на Ash), и в кодоне 92 (ААС-«ААА, замена Asn на Lys) DelpE'?(92)24 — содержащая мутацию в гене Е7 в кодоне 24 (GAC-+GGC, замена Asp на Gly). и в кодоне 92 (ААС-*ААА, замена Asn на Lys).

Таким образом, поставленная задача была выполнена, т.к. исходный клон содержал мутацию в домене СЮ, а два других мутантных варианта в доменах СЕЛ и СВ.2 были получены эксперементально. Все три указанных мутантных варианта гена Е7, а так же клонированный ген Е6 были использованы: для трансфекции соответствующих клеток для изучения биологического потенциала .¡-тих генов, яраивдер i.

——-4 iipamiep ?

4' il иршк" 2 paimepii.

ПЦР1.

2'i sfaiirJ.

A 1i лраймер 4.

ITLfPlj .ораймерЗ праймер4.

ФрЯшКНТ гош Ь7 в щпяции в Зчкош s * mpr.a.

Фрагмент тема ЕЛ c мутящей в 5 — конце фр] Л фрг.2 иршмер! праймер4.

Ulli" ,'к,., 'S т.

Мутант гена Е7.

Рис, 9: Сжезиа получения мутантныж вариантов гена Е7 HPV18 ¿-методом сайт направленного мутагенеза € пози&щые PCR. ис. Ю Последовательности мутантных вариантов ген m Е7- ж 11оследовательность мутангного гена Е7 по 10 кодону.

M H G РКА Т L Q N* I V L H L Е Р ATO GAT GGA CCT AAG GCAACA TTG CAA AAC ATT GTATTG GAT TTA GAG CCT.

Q N E IPVDLLCHBQLS D 3 CAA AAT GAA ATT CCG GTT G AC GTT СТА TGT CAC GAG CAA. TTA AGG GAC TCA E E E M D E i D G V M H Q H L P A GAG GAA GAA MC GAT GAA ATA GAT GGA GT T AAT CAT CAA CAT T ТА CCA GCC.

E R A B PQRHTML CMC С К С CGA CGA GCC GAA CCA CAA CGT CAC AGAATG TTG TGT ATG TGT TGT .AAG TGT E A R I E L V V E 3 S A D D I, R A GAA GOT .AGA ATT GAG СТА G ТА GTA GAAAGC TCA GCA GAC" GAC CTT CGA GCA.

FQQ LFL K*TL S F V С P W С A TTC CAG CAG CTG TTT CTG AAA ACC CTG ТСС TTT GTG TGT CCG TGG TGT CAG.

S О Q & OCATCCCAGTCA0 б: Последовательность мутаншого гена E7 не 24 кодону.

M H G P К A. T L Q D I V L H L E P ATG CAT GGA CCT AAG GCA. ACA TTG CAA GAC ATT GTA TTG CAT TTA GAG CCT Q N В I P V' G* L L С H В Q L S Do CAA AAT GAA ATT CCG GTT CGC CTT СТА TGT CAC GAG CAA TTA AGG GAC TCA BEE N DE I D G V N H О H L P A GAG GAA GAAAAC GAT GAA ATA GAT GGA GTT AAT CAT CAA. CAT TTA CCA GCC.

R R A E P Q R. H T ML С M С С К С CGA. ОЗА GCC GAA CCA CAA CGT CAC ACAATG TTG TGT ATG TGT TGT AAG TGT E A R I EL V V E S8ADDLRA GAA OCT AGA. ATT GAG СТА GTA GTA GAA AGC TCA GCA GAC GAC CTT CGA. GCA.

FQ CL FL К* T L S FVC P W С A TTC CAG CAG CTG TTT CTG AAA ACC CTG ТСС TTT GTG TGT CCG TGG TGT CAG.

3 Q Q S: GCA ТСС CAG ФА®

4.3. Исследование внелогической шптаюш клонированных генов 4,3,1, Транфкцт чувтителыьа клеток.

Полученные плазмиды, несущие гены Еб и Е7, и два мутантных варианта гена Е7, использовали дня трансфекцни в клетки IE5. Этот клон был получен в результате длительного пассирования и селекции крысиных фибробластов, трансформированных геном большого Т-антигена вируса полиомы. Указанный клон в результате пассирования по данным Сауэерн-бдот гибридизации утерял этот ген, но сохранил иижмортализующие.

Ч* -?-|- V" ' ' i. i* свойства. данный клон пассировался ш vjiro в лаооратории в течении нескольких лет без видимых признаков морфологи ческой трансформации.

Поскольку во всех использованных плазмидах исходно включен ген устойчивости к антибиотику G418, то селекцию клонов проводили в присутствии этого антибиотика и полученные клоны затем инкубировали в среде ДМЕМ с добавлением 10% .эмбриональной телячьей сыворотки. В результате было получено 4 новых клеточных линии (таблица 4), обозначенных как IE5-E6 (трансфицированная геном Еб HPV 18 из Т" Ч I Т1 /* i Т1—'£1 f’t / 4 Т" ^^ шшзмиды ueipiiOj, iijj-jiiy?, (трансфицированная геном n? из нлазмнды DeipE?, т. е. с мутацией по 92 кодону), Ш5-Е7−92−10 (трансфицированная геном Е7 из плазмиды DelpE?{92)10 с дополнительной мутацией по кодону 10), а Ш5-Е7−92−24 (трансфицированная геном Е7 из плазмиды DelpE7(92)24 о дополнительной мутацией по кодону 24). Была проведена селекция клонов в каждой из этих линий и, но нескольку клонов каждой из них (таблица, 4) были подвергнуты анализу,.

Таблица 4: Линии и клоны клеток, полученных в результате траясфекции линии IE5 различными вариашши генов HPV 18,.

Клеточная линия число клонов каждой линии Проанализиро ванные клоны Саузерн анализ PCR RT-P.

IE5-E6 9 A4E6 D4E6 со РЙ + ND + ND XT 11 jJZUO В6Е6 + + IN U ND +.

IE5-E7−92 2 С4Е7−92 D5E7−92 + + + + +.

ГЕ5-Е7−92−10 5 С6Е7−92−10 СЗЕ7−92−10 С5Е7−92−10 С2Е7−92−10 + + ?i + +.

IE5-E7−92−24 б В2Е7−92−24 A3 Е7−92−24 А2Е7−92−24 + + + -fi.

ND — анализ не проводился.

1.3.2. Идштшфикащ" последовательностей трансфицированных генов 4.3.2.1. Саузерн 6 лот габридизацин.

10 мкг ДНК клеток каждой культуры обрабатывали эндонуклеазой EcoRI, поскольку именно по этому сайту проводили клонирование в плазмиду DeipC7 (см .выше). I I олученные продукты разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле и проводили гибридизацию с полноразмерными генами Е6 и Е7 HPV 18, меченых 32Р random priming. В траисфицированных культурах выявлялся фрагмент в 360 пар нуклеотидов для культур, трансфицированных геном Е7, а 540 пар нуклеотидов для культур, несущих ген Е6.

Как видно из данных, представленных в таолице 4, среди пяти проанализированных клонов культур, трансфицированных геном Еб, указанный фрагмент в 540 «ар нуклеотидов выявился только в двух клонах D4E6 и В6Е6 (рис. 11, трек 2, 4). Для родительского варианта гена В7 были проанализированы два клона и в обоих случаях был получен позитивный результат (рис. 12а, трек 1, 2), т. е. выявлялся фрагмент в 360 пар нуклеотидов. Среди четырех клонов, трансфицированных мутантом гена Е? по 10 кодону, указанный фрагмент выявлялся в двух клонах (рисЛ2б, трек 8, 9), в клетках, трансфицированных мутантом гена В? по 24 кодону, фрагмент в 360 пар нуклеотидов выявлен в двух колонах из трех (рис, 126, трек 2,3),.

В качестве позитивного контроля в этих экспериментах использовалась ДНК клеток HeLa, содержащую интегрирований геном HPV тип 18 (рис. 126. трек 1), а в качестве негативного — ДНК клеток IE5, которые использовались для трансфекции (рис, 126, трек 5,10).

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о том, что все без исключения полученные нами плазмиды способны трансфицировать иммортализованные крысиные фиврооласты и после селекции удается получить клоны, содержащие последовательности гена Е7.

РисЦ. Выявление по с л е д о в <1 тель, но с тей гена Еб МРУ пш 18 п грансфицированных клонах (Саузерн б лотгибридизация) гибридизации меченого ЛР иолноразмерного гена Е6 НРУ18 с ДНК, выделенной из клеток клонов траисфтшрованые геном Е7 ! ПЧ18 и расщепленной эндонуклеазой ЕсоК1, Трек I НеЬа, 2- 04Е6, .VА4Е6, 4-В6Е6,5 С2Еб- 5 -В2Еб.7−1Е5,8-А/РвИ.

Г'.

360 fap.

— > -т .

—SO 5.

Г514.

— J 468 —448.

—339.

Pgcll. Вьшклшне последовательностей гена Е6 HPV ттш 18 в грннсфецированных клонах (Саузерн блотгибридизация) а-гибридшацни меченого J3P полноразмерного гена Е7 HPV18 с ДНК, выделешюй из клеток клонов. трансфццировяных геном Е7 HPVIS и расщепленной эвдонуклеазон EeeRI. Трек I — клон С4Е7−92, 2- клон D5E7−92, З-Л/РеЦ. fi. -гибридизация меченого flP полноразмерного гена 157 HPVJ8 с ДНК, выделенной из клеток клонов трянсфецированых мутантными гена Е7 HPV18 н расщепленной шдонуклеа) ой EcoRI. Трек HeLa, 2- клон АЗЕ7−92−24, 3- клон В2Е7−92−24, 4- клон А2Е7−92−24, 5J0- ?E5, 6- С2Е7−92−10> 7-клон C5E7−92−1O, 8- клон C3E7−92-IG, 9-клон C6E7−92 I0,1 jЯ/Pié-L.

4.3.2.Z. Полимер, а шля цепная реакции (РСК).

Поскольку нам ire удалось выявить последовательностей генов Кб и Е7 в некоторых загонах с помощью саузерна, б лотг и бр щщз аци и мы провели дополнительное тестирование всех клонов с помощью PCR. Для тестирования гена Е7 использовали пару пранмеров NE7 и СЕ7 (см. глава 3, габлицаЗ), которые, а м пли фи цирую т рамку Е7 с образованием продукта в 500 пар нукттеотидов, Из лагшых. представленных на рис. J2 следует, что в тех образцах. где последовательности гена Е7 выявлялась методом Саузеря блоттинга, они естественно выявлялись и методом PCR (pile. 13, Треки 5, 6, 8-П) В тех же образцах, где эти последовательности отсутствовали при тестировании методом Саузерн блоттинга, они отсутствовали и к PCR (таблица 4). Эта закономерность прослеживалась как для родительского варианта гена Е7 (рис. 13, Трек 10, 11), так и дая ег о мутантных форм (рис.i 3. Треки 5,6,8,9).

Для детекции гена Ш> использовали пару праймеров NB6 и СЕ6 (см, глава 3, таблица 3). которые анпдифицируют фрагмент гена Еб в 465 пар нуклеотидов. Именно продукт такого размера выявлялся, а 1 клонах. Позитивных по PCR (рис. 14, треки 5,6).

Таким образом, данные по PCR. свадетельшауют о том, что кзюны, v, которых отсутствует гены Еб и Е7 по данным Саузерн-блоттинга, действительно не содержат этих генов,.

3 4 5 6 7 8 9 Hi 11 12.

1.0.

О." ?

0.50.

0Л5.

0.3 kb.

Рнс.13 ?ibJHBJitimt последовательностей ген-! 107 HPV 18 в грансфшшроваиных клопах (PCR).

Грек IДИК маркер, Iреакшюшгдн смесь i ДНК. 3- 4 -клоп CSE7-П-10, 5- кл"н ('6E7−92-IU, <>- клоп СЗЕ7−92−10, 7- клоп Л2Е7−92−24, 8- клоп АЗЕ7−92−24, 9- клоп В2Е7−92−24, I" - клон С4Е7-Э2, 11-клои D5E7−92, !2-HcLa.

Рнс. И. Выявление последовательностей i ена Кб HPV iS ц фонсфнцир овинных клопах (PCR). Трек ijU lk isipKep, lHeLiK 5- клон R2E6, i-клоп С 5-клонВбЕ6? 6- клоп D4F/>> 7 — клон IE5.

4.3.3. Экспрессия генов Е6 и Е7 к трансфицнронаииых клетках.

Для анализа экспрессии генов Е6 и Е7 в полученных культурах использовала метод обратной транскрипцви PCR (RT-PCR). Для этой цели на первом этапе тотальная РЫК подвергалась обратной транскрипция с помощью пруймера Frohman (см, глава 3.3,8), а полученная кДНК подвергалась сначала амплификации с использованием двух прайнеровпрямого, локализованого в 5'-областн генов Е6 и Е7 и обратного -" Adapier" из прайм ера Froh тал (таблица, 3), Продукт этой PCR использовали как матрицу во второй PCR с уже описанными прайм ерам и (таблица 3), локализованных внутри генов Е6 и Е7 соотвеетвеино, Как было описано выше в гене Е7 в этом случае амплифицируется продукт, а 300 п. н, а для гена Еб — в 465 п.н.

Как следует из данных, представленных на (рис, 15), транскрипция гена Е7 выявлена в клонах D5E7−92, С4Е7−92, C6E7−92-I0, C3E7−92I0, A3Е7−92−24, В2Е7−92−24 и в положительном контроле — клетках HeLa (греки 3, 4, o, 7, '¦>, !0, 12), Соответственно в тех клипах, в которых не выявлен сам ген Е7 его экспрессия отсутствует (треки 8, 11).

Необходимо подчеркнуть, что ген Б7 эффективно транскрибируется вне зависимости от присутствия мутации в различных его участках. Для гена Н6 картина носит несколько иной характер. Естественно, что экспрессия выявлена только в клонах, где выявлен сам ген, т. е. D4E6 и В6Е6, и в клетках HeLa (рнс.16, треки 2, 4, 5) н отсутствовала в контрольных клетках родительской линии 1Е5 (рис.!6, трек 3), Однако, для полученных клонов была выявлена одна характерная особенность, состоящая в том, что кроме одного основного фрагмента в 465 п.н.(в исследуемых клонах регулярно выявлялся еще один фра[ мент в 194 п.н. Поскольку известно, что ген Е6 способен подвергаться сплайсингу, не исключено, что именно последний фрагмент представляет собой амплифицнрованный продукт кДНК именно со сплайсярованной РНК. Гак же 2 фрагмента в 465 п.н. и 19(1 п.н. выявлены и в клетках Не Га, где феномен сплайсинга РНК, несущей последовательности гена Еб, описан.

Различия в размере второго фрагмента могут объясняться тем, что в структуре гена имеется несколько сайтов сплайсинга, активность которых может по-разному регулироваться в разных клеточных системах.

8 9 10 11 12.

1.0.

0.75 9.50.

0−25.

03 kh.

Рис. i 5: Экспрессии вариантов гена KT UPY1R в клетках, грансфшщроканных ппми генами (KT I4″ R|. Трек 1″ ДНК маркер. 2- реакционна" смесь Oei РНК, 3- клон D5E7−9Z, Iклал (ЧЕ7−92, 5- кло" 1Е5&bdquo- 6- клеи < 6E7−9J i", 7-KJIOH C3E79Z-I0. 8- юти CSE7−9I-10, 9— «лои АЗК7−92−24, lu- «.ион ЩЕ7.92−24, П-клон А2Е7 92- 24,12- fULa.

12 3 4.

0.517 0.506 0,396 0.344 0.298 0,220 0.201 0.151 0Л34 11 6.

0−603^ 465кЬ 0,310⁰.290 к Ь.

0,281 0.194 кЬ 0,234.

0,194.

Р"с.16: Экспр"с"д| гена Щ НРУ18 в клетках фансф1 широваштьп шш миом <IVГ РСК). Грек } ДНК мяркещ Iклон 1)41⁶, 5- клон М', 5, Iклон Цб*^ 5-йЛетки Не? к, 6- {ПК мщтр-ФМ71/ЬШ Ш.

4.3.4. Характеристики роста полученных клонов.

Анализ роста в полноценной среде {% сыворотки) и в среде с пониженным содержанием сыворотки (0,5%) проводили для одного клоня из каждой линии, а которых была обнаружена интеграция и экспрессия грансфнцирующих генов. Показано, что для клонов С4Е7−92 и C6E7−92-I0 характерен более короткий лаг-период по сравнению с исходным клоном (IE5), отсутствует зависимость от факторов роста, т. е. рост этих клонов в среде с пониженным содержанием сыворотки (0,5%) не отличается от такового в полноценной среде (рис17) — время удвоения 14−15 час (по сравнению с 1Е5 — 23 час) — насыщение плотности — 31−41×104 кл/см2 (таблицам).

У клонов из линии D4EO и В2Е7−92−24 был выявлен более длинный датпериод по сравнению с выше охарактеризованными клонами, у них частично сохраняется зависимость от факторов роста (рнс, 16):времуя удвоения I8−20 часнасыщение плотности при более низких показателях— 12×1кл/см2 (таблица 5), По исследованным характеристикам эти клоны более сходны с родительской линей ТЕЗ.

Следовательно, клетки, несущие исходный и мутантный, но ко дону 10 ген В7, по указанным критериям сходны с трансформированными клеткамиклетки же. несущие исходный ген В6 и мутантный по кодону 24 ген Е7, имеют сходство с иумортализованными клетками родительского клона 1Е5. о g.

S 2 S ж О t 2 2 4 8p tu л, дни.

— 1Б5(10%).

— о IE5<0,5%).

А- -С4Е7.

92(10%).

А С4Е7.

92(0,5%).

— С6Е7−92.

1″ 10%).

— C6EI-S2.

10(0,5%) Б S.

13 3 4 Время, дни.

Iflo г о м si.

S S.

2 3 4 5 Ftp"мя, дни.

О- —IES (1"%).

— ОIf S (U5).

Ar — С4Е1 92{1i%).

АC4I7 91(9,5%) B2E7 32−24(10%).

— B2? f 9i i4(tt, J%|.

Рис.17: Анялш роста полученных лишш в среде с разной концентрации" сыворотки.

Глплица Биологических ар ак те р и с тик и исследованных клонов.

1 Клоны Время удвоения культуры Насыщение Эффект нвн о ст ь.

T=txlg2/ IgN^lgm плотности N/S, клонирования в (% на 3 сут. (час.) 5 сут. (104 ют/см2) разнеры колон и й.

50−80 мкм >80 мк.

В6Б6 21.6 11.82 KD ND.

ШЕй 18.9 ?5.74 0 0.

С4Е7−92 14.62 41.33 3.44 1,27.

D5E7−92 1564 35.43 ND N" D.

В2Е7−92−24 20.01 Н .81 0 f).

A3 Б7−92−24 21,31 [3,78 ND rND.

С.ЗВ7−92−10 18.36 23.62 ND ND.

С6Е7−92−10 15.91 31.49 2.78 0.62.

JE5 23,91 9.84 0 0 где Г-время удвоения культуры N: j первоначальное число клеток N* -число клеток, после V2 чае культивирования, t аоемя кч’льтивисоватщ П2 чае!

Насыщение плотности популяции клеток определяли на 5 сутки: N/S иде' in — число клеток после :> суток культивирования Н поверхность чаашн (см2). ND — анализ не проводился.

Г C4E7−92n?c ЩщШШ С6Е7−92−10.

•л.

LagcJS" Мо[)фолоп1я клеточных культур фиормоластов. грансфинированнмх tenatvm Щ6, I57, ti штатными вариантами гена Е7 MPV ¡-Я. т.3,5. Анализ niорфо логин клеток (рнс.18).

Исходный клон IES представлял собой имнортализоваиные фнбробласты крыс, имеющие типичную для фнбробластов морфологию. Клетки клона С4Ё7−92 менее распластаны, имеют плотные межклеточные контакты, характеризуются многослойным ростом на твердом субстрате. Морфология клеток клона D4B6 отличает хорошее распластывание, слабые межклеточные контакты, часто наблюдаются свободные пространства между клетками.

Морфология клеток длена С6Я7−92-М) приближена, к морфологии клеток С4Е7−92- они менее распластаны, имеют плотные межклеточные контакты, иногда наблюдается формирование многослойных колоний, Морфология клеток клона В2Н7−92−24 сходна с морфологией исходной кулыуры IE5.

13.6. Субстратная iaB№BMDcib размношнш клеток.

Субстратная зависимость размножения — одна из основных и градационно исследуемых характеристик $ран сформированного фенотипа. Как правило, она тесно коррелирует со способностью трансформированных клеток расти jii vivo. В связи с этим мы исследовали способность клонов D4E6−92, С4Е7−92, СбЕ7-?2-Ю, ШЕ7−92−24 к исходных клеток 1Ш5 расти к полужидкой среде.

Опыты по культивированию клеток в ыетшгцеплюпоэе (i.2%) показали! таблица 5), что эффективность клонирования в клетках клона 04Е7−92 составляет 3.4% для колоний малого размера {3U-80 мкм) н 12% дня колоний большого размера (S0 мкм и выше), г> ютетках клона С6Е7−92−10.

— 2.1% для колоний малого размера и 0.6% для колоний большого размера. Клетки исходного иммортализованного клона IE5, клона D4E6 и клона В2Е7−92−24 при посеве на полужидкую среду не образовывали колоний (в исследуемом диапазоне концентраций клеток).

Можно предполагать, что клон, несущий исходный ген Е7 (С4Е7−92), и клон, несущий мутантный по 10 кодону ген Е7 (C6B7−92-I0), представляют собой типичные трансформированные клетки, в то время как клон, несуший ген Е6 (D4E6), и клон В2Е7−92−24, несущий мутантный по 24 кодону гея Е7 (в сайте связывании с продуктом гена ретинобластомы), сохраняют характеристики иммортализованных культур.

4,3.7. Анализ туморогетюетн клеток полученных клонов.

Каждый клон в количестве IxIO7 клеток вводили елнгенным крысам (линии Фишер) в возрасте Ю сут, Через 1,5 месяца после введения клеток у крыс, которым вводили клетки клопов С4Е7−92 и C6E7−92−1O, были обнаружены опухоли. Присутствие гена Е7 в опухоли проверяли при немшцн PCR, нсиояьзуя пару прайм еров NE7 и СЕ7, дающих специфический фрагмент размером -100 пар иуклеотидоа. Результаты PCR дали положительный ответген Е7 присутствует в о пух о ля л (рис! 9, Греки 4,5). Б качестве дополнительного контроля в этой серии экспериментов были использованы трансформированные клетки, несущие ген Е7 HPV 16, которые индуцировали опухоли у крыс, но с помощью праймеров к гену Е7 HPV 18. этот геи с помощью PCR в таких опухолях выявить не удалось (рис. 19, Трек 3).

В противоположность этому после введений крысам 1×107 клеток родительского клона IE5, клонов D4E6 и B2E7−92*ia+ опухоли не были обнаружены даже через 2.5 месяца наблюдений.

Таким образом, клетки клонов С4Е7−92 и С6Е7−92−10 являются туморогеиными, в то время как & клетках клонов В2Е7−92−24 и D4E6 отсутствуют туморогенныс свойства, т. е. они идентичны родительским нмиортализованным клеткам IE5. Последнее служит лишним подверждениеы, тону что мутации по домену CR2 в гене Е7 элиминируют трасформирующий н туморогенный потенциал гена Е7 HPV18.

1 2 3 4 5 6.

0.514 0.468 0.448 0.339 '0.264.

— ;

•• н «• * г •.

4 i.

Щш «» «.

Гг" 1 м' | ' У — - •Т-'л'-А.- - - ;

0.3 кЬ.

Рис. 1 у: Последовательности гена Е7 НгУ 18 в опухолях крыс, получегоялк в рпу-яь гате ирлялантащга к л е ток е су ишг различные варианты гена Е7 ме тодом РСЯ. Т^ек IДНК маркера Я/РяН 4 Iклетки 11сIл, Лклетки* граигфпцщншашиле геном Е7 ИРУ 16, 4, 5 ~онугшлн"во:шикшне и результате фапеп1-ииа-цт кл" жчущиж ДНК клона С&Е7−92−10 (4) и С4Е7−92 (5). 6-кипк 1Ё1 диёш,.?" иоеужи&ше результатов.

Таким образом, представленные выше данные свидельствуют о том ,. что нами получено несколько новых клонов, содержащих интактные гены Е6 и Б7 HPV 18, а также два клона с мутантным геном Е7, полученным с помощью сайт направленного мутагенеза.

Исходным материалом для получения этих клонов дослужила плазмида рС7, любезно предоставленная' нам проф. Н. zur Hausen (Немецкий Онкологический Центр), Ранее эта плазмида была использована в экспериментах по трансфекции крысиных иммортаяизованных клеток и оказалось, что она трансформирует иммортализованные фибробласты крыс, в которых были идентифицированы гены Еб и В7 вируса папиллом человека 18 типа [115J. Кроме того, мы располагали информацией о том s что клонированные последовательности плазмиды рС7 происходят из ДНК рака шейки матки и примерный размер вставки ~i4OO пар нуклеотидов.

Целью настоящей работы было получение независимых клонов, содержащих экспрессирующиеся последовательности генов Еб и Б7 HPV 18, а также мутантных вариантов гена Е7 для изучения функциональной значимости отдельных его доменов. Выбор именно этой модели презеде всего обусловлен тем, что имеется обширная информация об этих генах, по главным образом для HPV тип 16, а для HPV тип 18 такие данные фактически отсутствовали. Именно поэтому в качестве модели мы решили использовать шхазмиду рС7 и провести субклонирование генов Еб и Е7 из этой плазмиды. Естественно, что на первом этапе предстояло охарактеризовать всю вставку целиком. Полученные данные можно суммировать следующим образом: плазмида сконструирована так, что вся вставка находится под контролем «сильного» промотора вируса цитомегалии (CMV). Далее следует последовательность в 40 пар нуклеотидов неизвестном природы, затем ген ?6, состоявши из 4/7 нар нуклеотидов. межгенный спейсер из 8 нар нуклеотидов, ген Е? из И 8 пар нуклеотидов и заканчивается вставка последовательностью нз более чем 500 нар нуклеотидов ,.

Секвеннрование фрагмента в 102 нары нуклеотидов из этой последовательности и 40 пар нуклеотидов в начале вставки показало, что они являются уникальными последовательностями и отсутствуют в банке данных. Эти последние данные согласуются с тем что данный фрагмент ДИК клонирован из ДНК опухоли шейки матки и согласуются с полученными, но неопубликованным данными Ф. Л. Киселева и М. Von Knebel Doeberitz с соавт., которые идентифицировали несколько новых уникальных сайтов интеграции генома HPV 16 в раках шейки матки. По-видимому сходная ситуация имела место и в данном случае и авторами плазмиды рС7 была клонирована последовательность HPV именно с уникальным сайтом интеграции клеточного генома.

Последующее клонирование обоих генов выявило еще одну особенность этих последовательностей, Во — первых, клонирование проводилось таким образом, что сохранялся участок в 40 нар нуклеотидов между промотором CMY и каждым из генов (Е6 или Е7) в отдельности и наличие этой последовательности не оказало влияния на экспрессию генов Е6 и Е7.

Однако, если сохранялся «правый» участок более 500 пар нуклеотидов при клонировании гена Е7< то его присутствие оказывалось токсичным и такая олазмида была не способна к репродукции в бактериальных клетках. Удаление этого участка восстанавливало способность гена В7 к трансформации бактерий и получению плазмнды, способной к эффективной трансфекции клеток млекопитающих. Следует обратить внимание на то. что этот токсический эффект проявлялся только при субклонирований, т. е. исходная плазмида, содержащая оба гена (Еб и Е7) была способна к нормальной репликации и только в отсутсвнн гена Еб данный эффект проявлялся. Причины этого остаются неяснымы, а объяснение данного эффекта не входило в задачу исследования.

При анализе генов Еб и Е7 HPV 18 в составе плазмнды был выявлен ряд интересных особенностей. Прежде всего в составе гена Еб было обнаружено несколько точечных мутаций, причем в большинстве случаев единичные замены в кодонах 49, 90, 127, 148, 149 не изменяли аминокислотного состава белка, но в одном случае одна точечная мутация оказалась значащейзамена аспарагнна на лизин в С-концевой области белка Еб. Имеет ли эта замена какую-либо функциональную значимость оценить сложно, но следует отметить, что такой вариант гена не обладает трансформирующим потенциалом в тестированных клетках. Основное наше внимание было сосредоточено на гене Е7 и задача заключалась в том, чтобы получить мутации по трем известным доменам этого гена (CRI, CR2, CR3) и сравнить трансформирующий потенциал этих мутантных форм. Сиквеяс из плазмнды рс-у показал, что нам в какой-то степени повезло. Оказалось, что клонированный вариант гена Е? из опухоли человека уже содержит смысловую мутацию в CR3 области, то есть в ко доне 92, приводящую к замене аспарагина на лизин. Кроме того, была выявлена еще одна точечная мутация, не приводящая к замене аминокислот в составе белка (кодон 17).

Следует подчеркнуть. что описанные нами мутации являются новыми и f V '' .1 J * ранее описаны не были, эти данные переданы в EMBL банк данных. Получение двух других мутаций было проведено по аналогии с геном Е7 HPV 16, то есть в доменах СВ. и CR2. Выбор был обусловлен тем, что указанные мутации могли потенциально изменять трансформирующий потенциал гена Е7. Это предположение оказалось справедливым для гена с мутацией по кодону 2.4, т. е. в домене CR2, и в этом случае мутантный вариант терял способность к трансформации. Это в полис объяснимо. т.к. подобный эффект наблюдается и для гена Е? HPV тин 16 [122, 123], Мутация по кодону 10 не изменяла трансформирующего потенциала гена Е7.

Информация о роли мутаций в домене CRI гена Е7 HPV тип 16 носит довольно противоречивый характер [124, 125]. По-видимому делеция этой области снижает эффективность трансформации в различной степени в зависимости от того какие области с 6 по 20 кодон они затрагивают. Можно предполагать .что точечные мутации в этой области, если они и оказывают какой-то эффект, то существенно меньший чем делеции и его проявления зависят от того, в каких системах тестируется активность гена. Эти. закономерности должны существовать и для гена Е7 HPV тип 18, поэтому отсутствие изменении в трансформирующем потенциале гена Ь7 с мутацией по кодону 10, причем с такой мутацией, которая не изменяет форму радикала аминокислоты в белке (аспарагиновая кислоты на аспарагин), вполне закономерно.

Что касается природной мутации по кодону 92 в CR3 домене, то очевидно, что она не играет существенной роли в определении трансформирующего потенциала. Эта закономерность проявляется и для гена Е7 HPV тип 16.

Нам не удалось сравнить трансформирующий потенциал гена Е7 с мутацией по этому кодону с прототипным вариантом этого гена без мутации. Учитывая высокую эффективность трансформации можно думать. что данная точечная мутация по кодону CR3 не влияет на проявление трасформирующей активности гена Е7 не только сама по себе, но и в сочетании с дополнительными точечными мутациями в двух других доменах этого гена.

Совокупность представленных выше данных свидетельствует о том, что поставленные задачи исследования выполнены и полученные нами клоны генов Е6, Е7 и мутантов гена Е7 вируса папиллом человека тип 18 могут быть использовании в дальнейших исследованиях, но изучению молекулярного механизма действия этих генов.

Глава 6, Выводы Охарактеризована вставка последовательностей в плазмиде рС7, клонированная из ДНК рака шейки матки. Ее размер составляет I400 нар нуклеотидов, она находится под контролем промотора вируса цитомегалии и содержит следующий набор последовательностей: 3'-40 пар нуклеотидов неизвестной природы — 477 пар нуклеотидов (геи Е6 HPV 18) — 8 пар нуклеотидов (межгенный спейсер) •¦ 3 !8 пар нуклеотидов (ген Е7 HPV 18) -более чем 500 пар нуклеотидов неизвестной природы — 5.

2. Проведено субклонирование генов Еб и Е7 из плазм иды рС7 в независимые эспрессирующие векторы DelpC?.

3. Клонированный ген Е6 по сравнению с прототипом содержит несколько мутаций, часть из которых в кодонах 49, 90, 127, 148, 149, не являются значащими, а одна мутация в кодоне 129 приводит к замене аспарагина на лизин.

4. Клонированный ген Е7 но сравнению с прототипиым вариантом содержит одну незначащую мутацию в 17 кодоне и одну мутацию в CR3 домене (кодон 92), которая приводит к замене аспарагина на лизин.

5. Полученные данные по нуклеотидным последовательностям переданы в Европейский Банк данных EMBL (коды Y18491, Y18492, Y18493).

6. С помощью сайт — направленного мутагенеза получено 2 мутанта гена Е7 в домене СЁЛ (кодон Юзамена аспарагиновой кислоты на аспарагин) и в домене CR2 (кодон 24, замена аспарагиновой кислоты на глицин).

ОЛуЧсНЫ КуЛЫ’урЫ КрЫСИКЫХ ИММОрТЙЛЬИЫХ фибрОЁШ&СТОВ, трансфицированных исходными н мутантными вариантами генов Е6 и Е7 HPV 38, В клонах таких культур идентифицированы зкснрессирующиеея носпедовательностн указанных генов вне зависимости от наличия в них мутаций различных типов.

З.Клоны клеток, трансфнцированные геном Е7 с мутациями по 10 и 92 ко донам, имеют трансформированный фенотип и индуцируют опухоли у сингенных животных, в то время как клоны клеток, трансфицироваиные геном Ей и мутантом гена Е7 по домену CR2 (кодон 24), сохраняют свойство иммор гализованных клеток и не способны к индукции опухолей.

БЛАГОДАРНОСТИ Счипшм своим долгом выразить благодарность и прязяапшшяоеть моему научному руководителю профессору Федору Львовичу Киселеьу ж постоянную помощь, внимание и поддержку при выполнении этойработы.

Искренне благодарю д. бж В. П. Вейке и к.б.н. Л. Б. Гулько, пршшматшх непосредственное участие в работе по клотрованшо и секвеяцроват*ю, к, б.я.Н.П, Киселеву, к. ёж В. А. Журбюусую, С, Винокурову ш постоянные консультации и помощь при проведении исследований по изучению интегращш и экспрессии генов и изучении биологических свойств и туморогенности клеточных линий.

Я очень благодарен д.б.я. КН. Мазурето ш квяеутпыщш и моральную поддержку.

Выражаю признательность ееем сотрудникам лаборатории молекулярной то. итш вирусов ж постоянньге вгтмание и поддежку при выполнении этой рабояшь.

Глша 7.

Список литературы

1. zur Hausen H. Condylomata, acuminata and human genital cancer, Cancer Res. 1976. ?.36. P. 530.

2. Бюл. WHO, Press Release, WHO /47, July 3, 1996, Cervical Cancer: Этиологической роли HPV при раке шейки матки.

3. de. VUiiers Е.М., Human pathogenic papillomavirus types: an update, Current Topics in Microbiol, Immunol., Ed. zur Hausen., Berlin-Heidelberg SpringerVerlag, 1994, V-. 186, P. I-12.

4. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 3ARC Publications, 1995, V. 64, P. 35−283.

5. zur Hausen H., Papillomavirus infections — a major cause of human cancers, Biochim. Biophys. Acta., 1996, V. 1288, P. 55−78.

6. Jablonska S., Dabrowski J., Jakubowiez K., Epidermodysplasia verruciformis as a model in studies on the role of papoviruses in oncogenesis, Cancer Res., 1972, V. 32, P, 583−589.

7. Orth G., Jablonska S., Jarsabek-Chorzeiska M. et al, Characteristics of the lesions and risk of malignant conversion as related to the type of the human papillomavirus involved in epidermodysplasia verrucifomis. Cancer Res, 1979, V, 39, P. 1074″ 1082,.

8. Gissmann. L., zur Hansen., Partial characterization of viral DNA from human genital warts (condylomata acumilata), Int. J. Cancer, 1980, V. 25, P. 605−609.

9. Gissmann L., Diehi V, Schultz-Coulon H. Zur Hansen H, Molecular cloning and characterization of human papilloma virus DNA derived from a laryngeal papilloma, J. Virol., 1982, V. 44, P. 393−400.

10. Durst M., Gissmann L., Ikenberg H., Zur Hausen H., A papillomavirus DNA from a cervical carcinoma and its prevalence in cancer biopsy samples from different geographic regions., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, ?. 80, P. 381 238 i 5.

11. Boshart M" Gissmann L., l’kenberg PL, Kleinheinz A., Scheurlen W., zur Hausen H., A new type of papillomavirus DNA, its presence in genital cancer biopsies and in cell lines derived from cervical cancer, EMBO J., 1984, V. 3, P.

1151.-1157.

12. zur Hausen H., Rosl F., Pathogenesis of cancer of the cervix. Cold Spring Harborg Symp. Quantit. Biol., 1994, V. 59, P. 623−628.

13. Durst M" Kleinheinz A., Hots M., Gissmann L., The physical state of human papillomavirus type 16 DNA in benign and malignant genital tumours., J. Gen. Virol., 1985, V. 66, P. 1515−1522.

14. Chook Pan C., Han S., Integration of human papillomavirus type 16 into cellular DNA of cervical carcinoma: preferential deletion of the E2 gene and invariable retention of the long control region and the E6/E7 open reading frames,.

Virology, 1987, V. 161, P. 259−261.

15. Samoylova E., Shaihaev G., Petrov S. Kisseljova N., Kisselov F., HPV infection in cervical-cancer eases in Russia, Int. J. Cancer, 1995, V. 61, P. 337 341.

11 Gloss B., Bernhard H., Seedorf K. Kiock G., The upstream regulatory region of the human papilloma virus-16 contains E2 protein — independent enhancer wihich is specific for cervical carcinoma cells and regulated by glucocorticoid hormones, EMBO J., 1987, V. 6, P. 3735−3743.

17. Cripe T., Alderbom A., Anderson R., Pakkinen S., Bergman 1'., Haugen H., Petterson V'. Turek L. Transcriptional activation of the human papillomavirus -16 P97 promoter by an 88 nucleotide enhancer containing distinct cell-dependent and AP-1 responsive modules. The New Biol., 1990, V. 2, P. 450−463.

18. Garsia-Garanca A., Thierry F., Yaniv M., Interplay of viral and cellular proteins along the long control region of human papillomavirus 18, J. Virol., 1988, V. 62, P. 4321−4330.

19. Gius D., Grossman S., Bedell M., Inducible and constitutive enhancer domain" in the noncoding region of human papillomavirus typl8, J. Virol., 1988, V. 62, P.665−672.

20. Bernard B., Bailly C., Lenoir M., Darmon M., Thierty F., Yaniv M., The human papillomavirus type 18 (HPV18) E2 gene product is a repressor of the HPV 18 regulatory region in human keratiiiocyt.es. J, Virol., 1989, V. 63, P. 43 174 324.

21. Romanczuk H., Howley P., Disruption of either the El or E2 regulatory gene of human papillomavirus type 16 increases viral immortalization capacity, Proc. Nat Acad. Sci. USA, 1992, V. 89, P. 3159−3163.

22. Bouvard V., Storey A., Pim D., and Banks L., Characterisation of the human papillomavirus E2 protein: evidence of trans-activation and trans-repression in cervical keratmocytes, EMBO J., 1994, V. 13, P. 5451- 5459.

23. Offord E., Beard P., A member of the activator protein 1 family found hi keratmocytes but not in fibroblasts required for transcription from a hum an papillomavirus type 18 promoter, J. Virol., 1990, V. 64. P. 4792−4798.

14- Bauknecht T., Angel P., Royer H.D., zur Hansen H., Identification of a nagative regulatory domain in the human papillomavirus type 18 promoter: interaction with the transcriptional! repressior YY1, EMBO J., 1992, V. 11, P. 4607−4617.

IS. May M.5 Dong X-P., Beyer-Finkler E., Stubenrauch F. s Fuchs G.P. Pfister H., The E6/E7 promoter of extrachromosomal HPV 16 DMA in cervical cancers ascapes from cellular repression by mutation of target sequences for YYl, EMBO J., 1994, V. 13, P. 1460−1466.

26. Hoppe-Seyler F, Bute K., Activation of human papillomavirus type 18 ?6-fi? oncogene expression by transcription factor Spl, Nucleic Acid. Res., 1992, V. 20, P. 6701−6706.

27. Bute K., Hoppe-Seyler F., Transcriptional control of human papillomavirus (HPV) omcogene axpression: composition of the HPV type 18 upstream regulatory region, J. Virol., 1993, V. 67, P. 6467−6486.

18, Chan WK., KlockG., Bernard HU., Progesterone and glucocorticoid control elements occur in the long control regions of several human papillomaviruses involved in anogenitai neoplasia. J. Virol., 1989, V. 63, P. 3261−3269.

19. Mittal R., Pater A., Pater M., Multiple human papillomavirus type 16 glucocorticoide reponse elements functional for transformation, transien expression, and DNA — protein interaction, J. Virol., 1993, V. 67, P. 5665−56S9.

30. Medina-Martinez G., Morales-Peza N. Yaniv M. et a! Single element mediates glucocorticoid hormone reponse of HPV 18 with no functional interactions with API or hbbrm, Virology, 1996, V. 217, P. 392−396.

31. Mack D., Laimins L., A keratinocyte-specific transcription factor, KRE-1, interacts with AP-l to activate expression of human papillomavirus type 18 in squamous epithelial cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1991, V. 88, P. 9102- 9106.

32. Hoppe-Seyler F., Butz K., zur Hansen H. Repression of the human papillomavirus type 18 enhancer by the cellular transcription factor Oct-1, J. Virol., 1991, V. 65, P.5613−5618.

33. Yakawa K.< Butz K., Yasui T. et aL, Regulation of human papillomavirus transcription by the differentiationdependent epithelial factor Epocl/skm-la, a" r: i I i*ii. <�¦ ir J/1 fi l/i I ?

J.Viroi., S'" ?", V. M>, JT. 1U-10.

34. Chong T., Apt D., Gloss B., Isa M, Bernard H.U., The enhancer of human papillomavirus type 16- Binding sites for the ubiquitous trascriptional factors Oct-1, NFA, Tef-2, NF1, and Apl participate in epithelial cell-specific transcription, J. Virol., 1991, V, 65, P. 5933−5943.

35. Ishiji T., Lace M., Parkkinen S., Anderson RD, Haugea TH.(Cripe TP., Xiao.

J-H., Davidson I., Chambon P., Turek LP., Transcriptional enhancer factor (TEF)-l and its cell-specific co-activator activate human papillomavirus- 16 E6 and E7 oncogene transcription in keratinocytes and cervical carcinoma cells., EMBO J., 1992. V. 11. P. 2271 -228 i.

36. Smotkin D., Wettstein F., Transcription of human papillomavirus type 16 early genes in a cervical cancer and a cancer-derived cell line and identification of the E7 protein, Proc. Nat. Acad. Sci USA, 1986, V. 83, P. 4680−4684.

37. Schwartz E., Freese IT. Gissmann L., Mayer W., Roggenbuck B., Stremlau A., zur Hausen H., Structure and transcription of human papillomavirus sequences in cervical carcinoma ceils, Nature, 1985, V. 314, P. 111−114.

38. Smotkin D" Prokoph H. t Wettstein F., Oncogenic and nononcogenic human genital papillomaviruses generate the E7 mRNA by different mechnisms, J. Virol., 1989, V, 63, P. 1441−1447.

39. Grossman S., Mora R., Laimins L, Intracellular localization and DNA-binding properties of human papillomavirus type 18 E6 protein expressed with a baculovirus vector, J. Virol,. 1989, V. 63, P. 366−374.

40. Grossman S., Laimins L., E6 protein of human papillomavirus type 18 binds zinc, Oncogene, 1989, V. 4. P. i089−1093.

41. Hawley-Nelson P., Vousdea K., Hubbert N., Lowy DR., Schiller JT., HPV16.

E6 and E7 proteins cooperate to immortalize human foreskin keratinocytes, EMBO J., 1989, V. 8, P. 3905−3910.

42. Stoppler M., Ching K. Stopler U., //J. Virol. 1996. V. 70. P. 6987−6993.

43= Band V., De Caprio J., Delmolino L, Kulesa V., Sager R., Loss of p53 protein in human papillomavirus type 16 Ed-immortalized human mammary epithelial cells, J. Virol., 1991, V. 65, P.6671−6676.

44. Storey A., Banks L., Human papillomavirus type 16 E6 gene cooperates with EJ-ras to immortalize primary mouse cells, Oncogene, 1993, V. 8, P. 819−824.

45, Lambert P., Pan H" Pilot C., Li em AM Jackson M., and Griep A. B., Epidermalcancer asssociated with expression of human papillomavirus type 16 E6 and E7 oncogenes in the skin of tatisgenie mice., Proc. Nat. Acad, USA, 1993, V. 90, P. 5583 «5587,.

46″ Halbert C., Demers G." Galloway .D, TheEd and E7 genes papillomavirus types have weak, immortalizing activity in human epithelial cells, J, Virol., ?992, V. 66, P. 2125−2134,.

47, Haffher R., Ore" M,. Biochimical properties and biological effects of p53, Curr, Optn. Gevet. Dev., 1995, V. 5, P, 84−90,.

48. ELDelry W., Tokino T, Velculesen V., Levy D., Parsons R., Trent J., Lin IX, Mercer W., KJnzler K., Vogeistein B., WAF1, a potential mediator of p53 tumour suppression. Cell, 1993, V. 75, P. 817−825.

Si/sicn^liji T p at"/! I r>il ! Gt* i V «n P lu i- 'ia».

I/" L^xiCUOltiL X Ku&tiJsj V-Vli" 1 J J > V «5JV 5 1 1 J ' ^ .

50. Kastaa M., Zhan Q., Ei-Deiry W., Carrier F., Jacks T., Walsh W., Plunkett B., Vogeistein B., Fornanee A, A mammalian cell cycle checkpoint pathway utilizing p53 and GADD4S is defective in ataxia-telangiectasia, Cell, 1992, V. 71,.

P. 587−59?,.

51. Fritsche M. Haessler C., Brandner G., Induction of nuclear accumulat ion of the tumor — suppressor protein p53 by DNA — damaging agents. Oncogene, 1993, V. 8, P. 307−318.

52. Moll U. s Riou G., Levine A.< Two distinct mechanisms alter p53 in breast cancer: Mutation and nuclear exclusion, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1992, V. 89,.

P. 7262−7266.

53. Lane D., Crawford L., T antigen is bound to a host protein in SV40-lransformed cells, Nature, 1979, V. 278, P. 261−263.

54. Sarnow P., Ho Y., Williams J., and Levine A, Adenovirus Elb — 58 kd tumor antigen and SV40 large tumor antigen are physically associated with the same 54 kd cellular protein transformed cells, Cell., 1982, V. 28, P. 387−394.

55. Hubbert N., Sedman S., Schiller J., Human papillomavirus type 16 E6 increases the degradation rate ofp53 in human keratinoeytes, J. Virol., 1992, V. 66, P.6237−6241.

56. Scheffiier M., Wemess B., Huibregste J., Levine A J'., Howley P.M., The E6 oncoprotein encoded by human papillomavirus types 16 and 18 promoters the degradation of p53, Cell, 1990, V. 63, P. i 129−1.136.

57. Ciechanover A., The ubiquitin — proteasome proteolytic path way, Cell, 1994. V.79.P. 13−21.

58. Scheffiier M., Huibregste J., Vierstra RM Howley P.M., The HPV 16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-proteiu ligase in the ubiquitination of p53, Cell, 1993, V. 75, P. 455−505.

White A., Livaaos E., llsty i.5 Oiflerential dpflOii of genomic integrite and cell cycle regulation in normal human fibroblasts by the HPV oncoproteins,.

Genes Dev., 1994, V. 8, P. 666−67?.

Heliand A., Holm R., Kristensen G., Kaern J., Karlsen F., Trope €, et al., Genetic alterations of the TP53 gene, p53 proteinexpression and HPV infection in primary cervical carcinpmas, J.Pathol. 1993. V. 171. P. 105−114.

61. Desaintes C., Hallez S., VanAiphen P., Buray A., Transcriptional activation of several heterologous promoters by the B6 protein of human papillomavirus type 16, J. Virol., 1992, V. 66, P. 325−333.

62. Pan EL Griep A., Temporally distinct patterns of p53-dependent and p53 independent apoptosis during mouse lens development, Genes. Dev., i')95, V, 9, P. 2157−2169.

63. Klingelhutz A., Foster S., McBougall J., Telomerase activation by the E6 gene product of human papillomavirus type 16, Nature, 1996, V. 380, P. 529−531.

64. Chen J., Reid €., Band V., Androphy J., Interaction of papillomavirus E6 oncoproteins with a putative calcium binding protein, Science, 1995,.

V. 269 (P. 529−531.

65. Keen N., Elston R.-, Crawford L., Interaction of the E6 protein of human papillomavirus with cellular proteins, Oncogene, 1994, V. 9, P. 1493−1499.

66. Kinoshita T., Shirasawa H., Shino Y., Moriya H., Desbarats L., Eiler M., Simiz B., Transactivation of prothymosin a and ornyc promoters by human papillomavirus type 16 E6 protein, Virology, 1997, V. 232, P. 53−61.

1. Armstrong D., Roman A, The anomalous eiectrophoretic behavior of the human papillomavirus type 16 E7 protein is due to the high content of acidic amino acid residues, Biochim. Biophys. Res. Commua, 1993, V. 192, P. 13 801 1 <>1.

1361 .

68. Vousden K, Yat P., Function similarity between HPV 16 E7, SV40 large T and adenovirus El a proteins, Oncogene, 1989, V. 4, P. 153−158.

69. Phelps W., Manger K., Yee €., Barnes JA., Howley PM., Sructure-function analysis of the human papillomavirus E7 oncoprotein, J. Virol., 1992, V. 66, P. 2418−2427.

70″ Watanabe S., Kanda T., Sato H., Furuno A., Yoshiike K., Mutational analysis of human papillomavirus type 16 E7 functions, J. Virol., 1990, V, 64, P. 207−214.

71. Dyson N. Howley P., Munger K., Harlow E. The human papillomavirus-16 E? oncoprotein is able to bind to the retinoblastoma gene product, Science, 1989, V. 243., P. 934−937.

72. Heck DM Yee C" Howley P., Munger K., Efficiency of binding to the retinoblastoma protein correlates with the transforming capacity of the E7 oncoproteins of the human papillomaviruses, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, V. 89, P. 4442−4446.

73. Patrick D., Oliflf A., Heimbrook D., Identification of a novel retinoblastoma gene product binding site on human papillomavirus type 16 E7 protein, J. Biol. Chem., 1994, V. 269, P. 6842−6850.

74. Firzlaff J., Luscher B., Eisenmann R.N., Negative charge at the casein kinase II, Proe. Nat, Acad. Sci. USA, 1991, V. 88, P. 5187−5191.

75. Massimi P., Pirn D. Storey A., and Banks L. HPV-16 E7 and adenovirus Ela complex formation with TATA box binding protein is enhanced by casein kinase II phosphorylation, Oncogene, 1996, V. 12, P. 2325−2330.

H. Barbosa M" Low D., Schiller Y, Papillomavirus polypeptides E6 and E? are zinc-binding proteins, J. Virol., 1989, V. 63, P. 1404−1407.

77= Mc Intyre M., Frattini M., Grossman S., Laimins L., Human papillomavirus type 18 E7 protein requeres intact Cys-x-x-Cys motifs for zink binding, dimeriztion, and transformation but not for Rb binding, J. Virol., 1993, V. 67- P. 3432−3450.

78. Kanda T., Zanma S. f Watanabe S., Furuno A., and Yoshiike K., Two Immunodominant regions of the human papillomavirus type 16 E7 protein are aiasked in the nuclei of monkey COS-1 cells. Virology, 1991, V. 182, P. 723−731,.

19. Zatsepina O., Braspenning Y., Robberson D., Hajibagheri N., Blight K, Ely S., Hibma M., Spitkovsky D., et at., The human papillomavirus type 16 E7 protein is associated with the nucleolus in mammalian and yeast, cells, Oncogene, 1997, V. 14, P. 1137−1145.

80. Bedell M., Jones K., Grossman S., and Laimins L., Identification of human papillomavirus type 18 transforming genes in immortalized and primary cells, J. i OOfs fT O T> t’JAI i «iiui, s -'¦:>.:•'•, s. Uj, i. L-Z4 — I.

81. Kanda. T., Watanabe S, Yoshiiki K, Immortalization of primary rat cells by human papillomavirus type 16 subgenomic DNA fragments eontroied by SV40 promoter, Virology, 1988, V. 165, P. 321−325.

82. Barbosa M., Vass W., Lowy D., Schiller J, In vivo biological activities of ?6 and E7 genes vary among human papillomaviruses of different oncogenic potential, J. Virol., 1991, V. 65, P. 292−298.

83. Yutsudo M., Okamoto J., Hakura A., Functinal dissociation of transforming genes of human papillomavirus type 16, Virology, 1988, V, 166. P. 594−597.

84. Matlashewski G., Schneider J., Banks L., Jones M, Murray A., Crawford L., Human papiilomavirus type 16 DNA cooperates with activated ras un transf’oming primary cells, EMBO J., 1987, V. 6, P. 1741−1746.

85. Munger K., Phelps W., Bubb V., Howley P., Schlegel R., TheE6 and fi? genes of the human papillomavirus type 16 together are necessary and sufficient for transformation of primary human keratinocyt. es, J. Virol., 1989, V. 63, P. 44 174 421.

86. Wazer D., Liu X, Chu Q., Gao Q., and Band V., Immortalization of distinct human mammary epithelial cell types by human papilloma virus 16E6 or E7, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1995, V. 92, P. 3687−3691.

87. Tsao S., Mok S., Fey E. et a!., Characterization oa human ovarian surface epithelial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes (HPV — E6 E? ORFs), Exp. Cell. Res., 1995, V. 218, P. 499−507.

88= Halbert Demsrs '-~>.? C alio way D=, flie Eg ami B/ scenes ot human papillomavirus type 6 have weak immortalizing activity in human epithelial cells, J. Virol., 1992, V. 66, P. 2125−2134.

89. Sherr C., Cancer cell cycles, Science, 1996, V. 274, P. 1672=1677.

90. Zerfass-Thome K., Zwuschke W., Mannhardt B., Tindle R., Botz J., and Jansen-Durr P., Inactivation of the edk inhibitor p27KIPl by the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein, Oncogene, 1996, V. 13, P. 2323−2330.

91. Boyer S., Wazer D., Band V., E7 protein papillomavirus-16 induces degradation of retinoblastoma protein through the ubiquitm-proteasome pathway, Cancer. Res., 1996, V. 56, P. 46 204 624.

92. Wu E., Clemens K., Heck D., Munger K., The human papillomavirus E7 oncoprotein and the cellular trascription factor E2 °F bind to separates! tes on the retinoblastoma tumor suppressor protein, J. Virol., 1993, V. 67. P. 2402−2407.

93. Dyson N., Gnida Pi" Munger K., and Harlow E" Homologous sequences in adenovirus El A and human papillomavirus E7 proteins mediate interactions with the same set of cellular proteins, J. Virol., 1992, V. 66, P. 6893−6902.

94. Zerfass K,. Levy L., Cremonesi C., Ciccolini F. Jansen-Durr P., Crawford L., Ralston R." and Tommasino M., Cell cycle dependent distruption of 'E2F/pl07 complexes by human papillomavirus type 16 E7 J. Gen. Virol., 1995, V, 76, P.

1815−1820.

95. Phelps W., Bagchi S., Barnes J., Raychaudhuri P., Kraus V., Munger K., Howley P.M., and Nevins J.R., Analysis of trans activation by human papillomavirus type 16 E7 and adenovirus 12S El A suggests a common mechanism, J. Virol., 1991, V. 65, P. 6922−6930.

H. Lain E., Morris J., Davies R., Crook T., Watson R., Vousden K., HPV-16 E7 oncoprotein deregulates B-myb expression: correlation with targeting of p!07/E2 °F complexes, EMBO J., 1994, V. 13, P. 871 «878.

97. Schulze A., Zerfass K., Spitkovsky D., Berges J., Middendorp S., Jansen.

Durr P., and Henglein B., Cell cycle regulation of cyclin A gene transcription is mediated by a variant E2 °F binding site, Proc, Nat. Acad. Sei. USA., 1995, V. 92, P. 11 264−11 268.

98. Antinore M., Birrer M., Patel D., Nader L., and McCance D., The human papillomavirus type 16 E7 gene product interacts with and trans-activates the API family of transcription factors, EMBO J., 1996, V. 15, P. 1950 1960.

99. Mazzarelli J., Atkins G., Geisberg J., Ricciardi R. The viral oncoproteins Ad 5 El A, HPV 16 and SV 40 Tag bind a common region of the TBP — associated factor — 110, Oncogene, 1995, V. 11, P. 1859−1864.

100. Tommasino MM Adamczewsld J., Carlotti F., Barth C.F., Manetti R." Con. tonii M., Cavalieri F., Hunt T. s Crawford LM Protein associates with the protein kinase p33CDK2and cyclin A., Oncogene, 1993, V. 8, P. 195−202,.

101. Mclntyre M., Ruesch M., Laimins L., Human papillomavirus E7 oncoproteins bind a single form of cyclin E in a complex with cdk2 and pi07, Virology, 1996, V. 215, P. 73−83.

102. Shirodkar S., Even M., DeCaprio J., et al., The transcription factor E2 °F interacts with the retinoblastoma product and a pi 07 — cyclin A complex in a cell cycle — regulated manner, Cell, 1992, V. 62, P. 157−166. ivi^.: liv’jiiuiti, f^s-jwiofc-njiLr ii IvimiiliiaiUL ., luiul^- J-V.i i. i: J., cum.

Jansen-Durr P., Inactivation of the cdk inhibitor p27KIPl by the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein. Oncogene, 1996, V. 13, P, 2323−2330.

1(14. White A., Livanos E., Tlsty T. Differential distruption of genomic integrity and cell cycle regulation in normal human fibroblasts by the HPV oncoproteins, Genes and Dev., 1994, V. 8, P. 667−677.

105. Pan H, Griep A., Temporally distinct patterns of p53-dependeat and p53-independent apoptosis during mouse lens development, Genes, and Dev., 1995, ?.9, P. 2157−2169.

Putenveett.il J., Frederickson S., Reznikoff C., Apoptosis in human ri. l I I A f rt .1 i f i f 1 i C i ti UninAIt-i'A * t^'i «Tk i i.

Oncogene, 1996, V. 13, P. 1123−1131.

107. Weinberg R., The retinoblastoma protein and ceil cycle control, Cell. 1995. V. 81. P. 323−330.

108. Sam brook J., Fritsch E. F., Mania tis T., Molecular Cloning." A Laboratory ManualCold Spring Harbor laboratory Press, New York, 1989,.

109. McBride L, J., Carutilers M.H., An investigation of several deoxynucleoside phosphoamidites useful for synthesizing deoxyoligoimcleotides, Tetrahedron Jetteres, 1983, V. 24, P. 245−248.

1.16.

110. Jones RA, Oligonucleotide synthesis: a practical approach, Ed. By M.J. Gait. Oxford. Washington DC, IRL Press, 1984, P. 23−24.

111. Maxam A., Gilbert W., Sequencing end-labeled DNA with base specific chemical cleavage, Meth. Eazymol., 1980, V. 65, P. 499−560 ,.

112. Sanger F., Coulson A.R., A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase, J. Mol. Biol., 1975, V. 94, P. 441 446.

113. Suggs S.V., Hi rose T., Miyake J., Kawashima E.< Jonson M., Itakura K., et ai, Use of synthetic oligonucleotides for the isolation of specific cloned DNA sequences using Purified Genes. In: Developmental Biology. / ed. Brown D.D.N .Y.: Acad. Press, 1981, P. 683−693 .

114. Higuchi R. Krummel B., Saiki R., A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions, Nucl. Acids Res., 1988, V. 16, P. 7351−7367.

115. Komissarova E.V., Soyfer M.V., Pavlova L.S., Kisselojov F.L., The state of immortalized, transforming and suppressor genes in rat. ceils, transfected by Polyomavirus large T and HPV 18 E6 + E7 genes, Oncol. Rep., 1995, V. 2, P. 1169−1174.

116. Wigler M., H!.!icer A., Silverctein S., Alex R, Biochimical Transfer of single-copy eucatyotic genes using total cellular DNA as donor, Cell, 1978, V. 14, P. 725−731.

117. Chirgwin J.M., Przybvla A.E., McDonald R.J., Rutter WJ., Isolation of Biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease,.

Biochemistry, 1979, V. 18, P. 5294−5299.

118. Спитковскии Д. Д., Зборовская И. Б, Киселев 1 ранскрипция клеточных онкогенов, а опухолях человека, Молекулярная Биология,. 1986, V. 20, Р. 1409−1422.

119. Пол Д. Культура клеток и ткани. — М.: Медгиз, 1963. — 346 е.

120. Stoker М., O’Neill См Венугпап S., Waxmami ?., Anchorage and growth regulation in normal and virus transformed cells. Int. J. Cancer, 1968, V. 3, P. 683−693.

121. Oltersdorf Т., Roewekamp W., Schneider-Gaedicke A., Seedorf K, Duerst M., Schwartz E., «Expression products of human papilloma virus type 18, antibodies specific for these proteins, and diagnostic reagents containing these antibodies or the corresponding DNA. Patent number EP0256321-АЛ, 1988.

TT.-iТч л тт,". «D — - .» % «... '(.->' T3"[, t,». f c-. .":.. j-J.. ш. neck jJ., i ее с., nowiey г., ниа munger К., riiucienoy ol bmumg ine retinoblastoma protein correlates with the transforming capacity of the E? oncoprpteins of the human papillomaviruses, Proc. Nat. Acad. Sci, USA., of America, V. 89, P. 4442−4446.

123. Sang В., and Barbosa M., Single amino acid substitutions in «Low-risk» human papillomavirus (HPV) type 6 E7 protein enhance features characteristic of the «high-risk» HPV E7 oncoproteins, Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 1992, V. 89,.

P.8063−8067.

124. Banks L, Edmonds C., and Vousden K., Ability of the HPV 16 E7 protein to bind RB and induce DNA synthesis is not sufficient for efficient transforming nfiwh," KirwiTt ««л!ic Ац. члллпл | вол v ^ P лев.

125. Brofcaw J., Yee €, and Manger K., A mutational analysis of the amino terminal domain of the human papillomavirus type 16 B7 oncoprotein. Virology, 1994, V. 205, P. 603−607.

Показать весь текст

Заполнить форму текущей работой