Гистологическая техника

Гистологические методы исследования применяются для изучения строения и функции клеток и тканей в норме, патологии и эксперименте. Основой гистологического метода исследования является гистологическая техника — комплекс методических приемов, используемых при изготовлении препаратов клеток и тканей для их микроскопического исследования. Микроскопическое изучение клеток и тканей может проводиться двумя основными путями в зависимости от состояния исследуемого объекта: исследование живых клеток и тканей, исследование неживых клеток и тканей, сохраняющих структуру благодаря специальным приемам фиксации[2].

1. Техника приготовления гистологических препаратов для световой микроскопии

Основные этапы приготовления гистологических препаратов:

1. Взятие материала;

2. Фиксация;

3. Промывка в воде;

4. Обезвоживание и уплотнение;

5. Заливка;

6. Приготовление срезов;

7. Окрашивание;

8.

Заключение

срезов.

Краткая характеристика этапов:

1. Взятие материала

Для гистологического исследования берут кусочки органов и тканей величиной не более 1 смі. Материал желательно получать как можно раньше после смерти людей (метод исследования материала трупа человека — аутопсия). С диагностической целью материал для гистологического исследования может забираться у людей прижизненно с помощью специальных инструментов или во время операций. Этот способ получения материала носит название биопсии.

2. Фиксация

Взятый для гистологического исследования материал сразу же должен подвергаться фиксации. Фиксация — метод обработки ткани с целью закрепления ее прижизненной структуры. Это достигается путем воздействия на ткань специальных растворов (фиксаторов). Наиболее существенным изменением, происходящим в тканях под воздействием фиксатора является процесс свертывания (коагуляции) белков. Количество фиксатора следует брать в 20−100 раз больше объема кусочка фиксируемого материала.

Существуют фиксаторы простые и сложные. К простым относятся 10−20% раствор формалина, 96 є спирт, 100 (абсолютный) спирт, 1−2% раствор осмиевой кислоты и др. Сложные фиксаторы: спирт — формол (спирт 70є - 100 мл. и формалин 2−5 мл.) жидкость Ценкера (сулема — 5 г, сернокислый натрий — 1 г., двухромовокиолый калий — 2,5 г, дистиллированная вода — 100 мл., ледяная уксусная кислота 5 мл.) и др. Продолжительность фиксации — от нескольких часов до 1 суток и более в зависимости от свойств фиксатора и характера исследуемого материала.

3. Помывка в воде

После фиксации материал промывают (чаще всего в течение нескольких часов в проточной воде) с тем, чтобы избавить его от избытка фиксатора и различных осадков фиксирующих жидкостей.

Изучить с помощью микроскопа такие фиксированные кусочки органов невозможно, т.к. они не прозрачны. Чтобы кусочек органа можно было микроскопировать, его надо разрезать на очень тонкие пластинки — срезы, толщина которых измеряется в микрометрах. Такие срезы получают с помощью специальных приборов — микротомов. Но для того, чтобы резать на микротоме кусочек ткани, ее надо предварительно уплотнить. Это достигается путем пропитывания застывающими жидкостями — расплавленным парафином. Парафин в воде не растворяется, и поэтому промытый после фиксации кусочек ткани необходимо предварительно обезводить, и только затем пропитывать.

4. Обезвоживание

Обезвоживание ткани производятся постепенно (чтобы не произошло сморщивания) путем проведения ее через спирты возрастающей крепости: 50є, 60є, 70є, 80є, 90є, 96є, 100є. В каждом спирте кусочки находятся от нескольких часов до 1 суток в зависимости от величины кусочка.

5. Уплотнение (заливка)

При заливке кусочки предварительно пропитываются теми жидкостями, которые служат растворителями для парафина (ксилол или толуол).

Заливка в парафин. При заливке в парафин кусочки из абсолютного спирта переносятся в смесь абсолютного спирта с хлороформом или ксилолом, взятых поровну, затем чистый ксилол и, наконец, в расплавленный насыщенный раствор парафина в хлороформе, где они находятся в термостате при температуре 37є до 1 суток и более. Дальнейшая заливка проводится в термостате при температуре 54є -56є в трех порциях парафина. Окончательная заливка проводится в парафин с добавлением воска, который наливают в специальные бумажные коробочки или стеклянные чашки, а затем эти коробочки или чашки после появления на поверхности парафина пленки, погружают в воду.

Происходит полное затвердение парафина. Кусочки с окружающим их парафином извлекают из коробочек и с помощью расплавленного парафина, наклеивают на деревянные кубики, получаются парафиновые блоки.

Уплотнения также можно добиться замораживанием кусочка органа (срочная биопсия).

6. Приготовление срезов

Срезы с блоков изготовляются на микротоме. Наиболее распространены микротомы санный и замораживающий. В специальных устройствах микротома зажимается парафиновый блок и микротомный нож. Существует механизм, поднимающий объектодержатель с блоком на заданное количество микрометров. Это позволяет при каждом скольжении ножа в плоскости параллельной поверхности блока получать срезы толщиной 5−10 микрометров с парафиновых блоков.

7. Окрашивание

Изготовленные на микротоме срезы окрашиваются. Перед окраской из парафиновых срезов обязательно удаляют парафин (растворением в ксилоле).

Окрашивание необходимо производить для того, чтобы отчетливо выявить под микроскопом тонкие структуры объекта. В неокрашенных срезах большинство структур одинаково преломляет свет, поэтому рассмотреть их не удается.

Выявление на срезе гистологических структур основано на неодинаковом их отношении к красителям. Одни структуры среза вступают в реакцию с кислыми красителями и ими окрашиваются (ацидофильные, оксифильные структуры), другие реагируют с основными красителями и окрашиваются преимущественно ими (базофильные структуры). Некоторые структуры окрашиваются и кислыми и основными красителями.

По происхождению различают краски естественные, к которым относятся краски растительного и животного происхождения, и краски искусственные. Краской растительного происхождения является гематоксилин, который добывается из кампешевого дерева, растущего в Америке и в Армении.

К краскам животного происхождения относится кармин, который добывается из насекомых кошенили, живущих на кактусовых деревьях в Мексике, Армении и др. В настоящее время большинство красок готовят синтетически (искусственные краски).

По окрашиванию определенных гистологических структур различают краски ядерные (окрашивание ядра), цитоплазматические (окрашивающие цитоплазму), и специальные, окрашивающие избирательно определенные структуры.

Ядерные краски — гематоксилин, кармин, сафранин, метиленовая синь, азур, тионин.

Цитоплазматические краски — эозин, пикрофуксин.

Существуют специальные краски и реактивы: судан Ш (окрашивает жир в оранжевый цвет), осмиевая кислота (импрегнируемый ею жир окрашиватся в черный цвет), резорцинфуксин Вейгерта (дает темно-синюю окраску эластических волокон), орсеин (окрашивает эластические волокна в бурый цвет). Метиленовый синий окрашивает нервные элементы в синий цвет, а при импрегнации серебром они приобретают коричневый цвет.

Чаще всего для окрашивания гистологических срезов применяется окрашивание раствором гематоксилина (приготовленным по методу Бемера) и 1−2% эозином.

8.

Заключение

среза

Окрашенные и промытые в воде срезы во избежание помутнения обезвоживают в спиртах (70є, 96є), просветляют в карбол-ксилоле, ксилоле, а затем на предметное стекло, где находится срез, помещают каплю бальзама и срез накрывают покровным стеклом. Бальзам представляет собой растворенную в ксилоле смолу одного из видов сосны, растущей в Канаде (канадский бальзам), смолу пихты (сибирский бальзам) или специальную синтетическую среду.

При исследовании биопсий с целью уточнения диагноза в гистологических лабораториях прибегают к ускоренной обработке материала. Кусочки тканей и органов при этом проходят те же этапы обработки, но за 5−7 дней. Иногда производится так называемая срочная биопсия, когда в течение 15−80 мин. материал фиксирует, получают срезы, окрашивают их и заключают. Быструю фиксацию производят в 10% формалине, подогреваемом пламенем горелки или с использованием СВЧ-печи. Уплотнения добиваются замораживанием (хлорэтилом, углекислотой или с помощью замораживающего микротома).

2. Примерная схема окраски препаратов гематоксилин — эозином

1. Парафиновые или замороженные срезы доводят до воды.

2. Окраска гематоксилином — в течении 3−5 минут.

3. Промывка в воде — 2 минуты.

4. Дифференцировка в спирте, подкисленном соляной кислотой (1% раствор соляной кислоты в 70% спирте), несколько секунд с последующим восстановлением подщелоченной водой (около 1 минуты). Этот этап желателен, но не обязателен.

5. Промывка в проточной воде.

6. Ополаскивание дистиллированной водой.

7. Окраска 1% эозином — 1−2 минуты.

8. Ополаскивание дистиллированной водой.

9. Обезвоживание в спирте — 2 мин.

10. Просветление в ксилоле — 2 мин

11. Заключение среза — капля бальзама, покровное стекло.

3. Методы исследования в гистологии и цитологии

Методы исследования в гистологии включают приготовление гистологических препаратов и их изучение с помощью микроскопа.

Основным методом гистологического исследования является световая микроскопия, разновидностями которой являются:

— фазово-контрастная микроскопия — основана на смещении фаз световых волн при прохождении лучей через разные по плотности структуры изучаемого объекта, что приводит к повышению контрастности этих структур и позволяет рассматривать неокрашенные и живые клетки;

— интерференционная микроскопия — основана на разном ходе световых лучей, дающих такое изображение объекта, по которому можно судить о концентрации различных веществ в клетке;

— поляризационная микроскопия — основана на двойном лучепреломлении клеточных структур, что позволяет изучать спиральные или не видимые при других методах исследования структуры (например, миофибриллы);

— люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия — основана на явлении свечения некоторых веществ при действии на них коротковолновых лучей, что даёт возможность исследовать содержание в клетках нуклеиновых кислот, некоторых белков, при этом препараты предварительно окрашивают специальными красителями — флюорохромами;

— ультрафиолетовая микроскопия — основана на использовании ультрафиолетовой части спектра для просвечивания объекта.

Для изучения тонкого внутреннего строения клеток и межклеточных структур (ультраструктур) используют электронную микроскопию.

Для выявления в клетках различных химических соединений (аминокислот, белков, жиров, углеводов, минеральных веществ и т. д.) используют гистохимические методы исследования, основанные на использовании красителей, которые избирательно связываются только с теми химическими соединениями клетки, которые необходимо изучить, и окрашивают их, делая видимыми.

Метод радиоавтографии, основанный на введении в клетку изотопов, которые включаются в соответствующие структуры (например, меченый тимидин встраивается в ядра клеток, синтезирующих ДНК), используется для изучения течения синтетических процессов в тканях.

Для изучения механизмов пролиферации и дифференцировки клеток, их реакции на различные воздействия используют метод культуры клеток и тканей, который основан на выращивании вне организма в искусственных питательных средах различных клеток.

Одним из современных методов, используемых в гистологии, является конфокальная микроскопия, которая позволяет получать трёхмерное изображение исследуемого объекта с помощью специальных компьютерных программ[1].

гистологический цитология гематоксилин эозин

[1]. http://do.teleclinica.ru/443 753/

[2]. http://survincity.ru/2010/12/gistologicheskaya-texnika-2/

[3]. http://medencped.ru/gistologicheskaya-texnika/