Фазы потенциала действия и их ионная природа

Форма потенциала действия позволяет разделить процесс его генерации на несколько фаз: предспайк, быстрая деполяризация, реполяризация и следовые потенциалы (рис. 2.3).

Рис. 2.3. Фазы генерации потенциала действия (ПП — потенциал покоя)

Предспайк — это процесс медленной деполяризации мембраны, который начинается с первого отклонения от потенциала покоя и заканчивается достижением КУД. Предспайк включает пассивную деполяризацию мембраны и активный локальный ответ. Активный ответ возникает, когда пассивная деполяризация мембраны достигает 70—80% от значений КУД и является первым проявлением начинающегося активного состояния мембраны — началом ее возбуждения. Благодаря пассивной деполяризации и локальному активному ответу сдвиг потенциала на мембране достигает критического уровня деполяризации, при котором и развивается собственно ПД.

Фаза быстрой (лавинообразной) деполяризации мембраны является первой фазой ПД. На этой стадии мембранный потенциал быстро сдвигается от критического уровня деполяризации до нуля и продолжает смещаться вплоть до пика Г1Д, перезаряжая мембрану. Во время первой фазы ПД потенциал на мембране «извращается», т. е. мембрана разряжается до нуля и перезаряжается с противоположным знаком. Участок ПД со значениями от нуля до пика перезарядки носит название овершут (англ, overshoot) потенциала. Вместо отрицательных значений потенциал на мембране становится положительным. У гигантского аксона кальмара пик ПД достигает значений порядка +50 мВ, а фаза деполяризации с овершутом длится порядка 0,5 мс.

Фаза реполяризации является второй фазой ПД. Во время этой фазы значение потенциала на мембране возвращается к исходному значению, т. е. к потенциалу покоя. Эта фаза может быть подразделена на быструю реполяризацию от +50 мВ до 0 В и более медленную реполяризацию — от 0 В до КУД и далее до потенциала покоя. Фаза реполяризации занимает 1—2 мс.

Следовые потенциалы могут в ряде случаев развиваться в конце ПД в виде медленной деполяризации или даже медленной гиперполяризации. Следовая гиперполяризация наблюдается, в частности, на мембране гигантского аксона кальмара.

Ионная природа фаз потенциала действия была изучена в ходе экспериментов на гигантских аксонах кальмара Ходжкиным и Хаксли. Выяснилось, что в момент генерации ПД электрическое сопротивление мембраны аксона на период 1—2 мс снижается в 20—30 раз, г. е. резко возрастает проводимость мембраны, и через мембрану начинает протекать ток. Но какой это ток? Оказалось, что если удалить катионы Na⁺ из наружного раствора и заменить их на сахарозу, то амплитуда потенциала действия резко уменьшается либо ПД вообще не возникает. Это позволило сделать заключение, что главной причиной генерации ПД и перезарядки мембраны до положительных значений является возникновение высокой проницаемости мембраны к катионам натрия и быстрый вход этих катионов внутрь клетки.

Движение натрия внутрь происходит под действием двух сил. Первая сила связана с наличием трансмембранного концентрационного градиента катионов натрия. Концентрация натрия в наружном растворе в 20—30 раз больше, чем внутри, т. е. концентрационный градиент для Na⁺ направлен внутрь клетки, и при наличии достаточной проницаемости катионы натрия будут быстро входить в клетку. Вторая сила связана с наличием большого отрицательного заряда на внутренней стороне мембраны (порядка -70 мВ). Отрицательный заряд на внутренней стороне мембраны будет способствовать входу положительно заряженных катионов натрия в клетку. Входя, катионы натрия будут сначала стремительно уменьшать отрицательный заряд мембраны до нуля, а потом перезаряжать мембрану до положительных значений, приближая величину мембранного потенциала к равновесному потенциалу для Na⁺. Напомним, что равновесный потенциал для катионов Na' может быть рассчитан по уравнению Нернста и составляет для гигантского аксона кальмара +55 мВ.

В пользу участия входящего натриевого тока в создании деполяризационной фазы ПД свидетельствуют результаты экспериментов с тетродотоксином — блокатором потенциал-зависимой натриевой проницаемости. Тетродотоксин способен полностью блокировать развитие Г1Д (рис. 2.4, а).

Рис. 2.4. Изменения ПД, возникающие при действии на мембрану избирательных блокаторов натриевой проницаемости — тетродотоксина (я) или калиевой проницаемости — тетраэгиламмония (б).

Таким образом, натриевая гипотеза удовлетворительно объясняет развитие деполяризационной фазы ПД, но оставляет открытым вопрос о причинах рсиоляризации, т. е. фазы ПД, приводящей к возврату мембранного потенциала к уровню потенциала покоя. Было высказано предположение, что на мембране развивается еще один процесс — возрастает ее проницаемость к ионам калия. Было ясно, что это — особая активная калиевая проницаемость, отличающаяся от пассивной калиевой проницаемости, существующей у мембраны в покое (пассивной калиевой утечки). Дополнительная калиевая проницаемость мембраны возникает только в ответ на деполяризацию мембраны до критического уровня, причем с небольшим запаздыванием по сравнению с увеличением натриевой проницаемости. В случае возникновения такой дополнительной активной проницаемости к калию катионы К* начинают выходить из клетки под действием концентрационного градиента и заряда на мембране, созданного опережающим входом катионов натрия. Входящие катионы Na⁺ заряжают внутреннюю сторону мембраны положительно, а наружную — отрицательно. Дополнительный выходящий ток катионов калия будет уменьшать созданный натриевым током положительный заряд внутри клетки и возвращать электрический заряд па мембране к исходным значениям, т. е. к потенциалу покоя.

В пользу участия выходящего калиевого тока в создании реполяризационной фазы ПД свидетельствовали результаты экспериментов с использованием блокатора активной калиевой проницаемости — тетраэтиламмония. Тетраэтиламмоний резко замедляет протекание фазы реполяризации ПД (рис. 2.4, б).

Если ПД является результатом появления и развития на мембране двух новых ионных токов, которых не было в покое, а именно токов натрия и калия, то, следовательно, при деполяризации на мембране открываются новые потенциал-активируемые ионные каналы. Эти каналы проводят сначала натрий, а затем — калий. Свойства таких каналов можно понять, анализируя развитие токов, которые возникают при их работе. Но эти токи надо регистрировать «в чистом виде», т. е. не осложненные одновременными изменениями потенциала на мембране и емкостными токами мембраны. Для этого Ходжкиным и Хаксли в их экспериментах на гигантских аксонах кальмара впервые был использован метод фиксации потенциала на мембране (англ, voltage-clamp).

Метод фиксации потенциала на мембране заключается в подключении к мембране аксона системы двух усилителей. Один усилитель предназначен для регистрации сдвигов мембранного потенциала, второй работает по принципу отрицательной обратной связи. В аксон вводятся два проволочных микроэлектрода. Один из них измеряет сдвиги мембранного потенциала и передает их на усилитель с отрицательной обратной связью. Этот усилитель (отслеживающий сдвиги потенциала на мембране и генерирующий токи) на выходе соединяют со вторым внутриклеточным микроэлектродом — токовым. Через этот микроэлектрод будет подаваться ток, который можно измерять во внешней цепи индифферентного электрода, расположенного снаружи аксона.

Если теперь искусственно деполяризовать мембрану до КУД, то в ответ через возбужденную мембрану начинают течь потенциал-активируемые токи: натриевый и калиевый. Создаваемые этими токами сдвиги мембранного потенциала мгновенно отслеживаются при помощи усилителя обратной связи, посылающего через токовый микроэлектрод равные по амплитуде, но противоположно направленные токи, — возникает обратная связь. Такие «токи фиксации» удерживают (фиксируют) мембрану от сдвигов потенциала и являются, по существу, зеркальным отражением Na⁺— и К⁺-токов. Токи фиксации могут быть легко измерены во внешней цепи схемы (рис. 2.5).

Рис. 2.5. Схема установки для фиксации потенциала на мембране

(voltage-clamp):

при помощи усилителя обратной связи токовый электрод пропускает ток фиксации, являющийся зеркальным отражением трансмембранных токов На рис. 2.6 приведены данные, полученные с применением метода фиксации потенциала. При деполяризации мембраны от -65 до -9 мВ мембрана возбуждается, что сопровождается генерацией двухфазного тока. Видно, что сначала возникает быстрый входящий ток, который затухает и сменяется на более медленно развивающийся выходящий ток. Оказалось, что входящий ток можно полностью заблокировать с помощью тетродотоксина — избирательного блокатора потенциал-зависимых натриевых каналов. Из этого следует, что входящий ток — натриевый ток.

Выходящий ток, также возникавший в ответ на деполяризацию, при этом сохраняется и выявляется в чистом виде. Этот ток развивается с небольшой задержкой, нарастает медленнее, но зато не затухает и сохраняется в течение всего времени деполяризации. Он полностью блокируется блокатором потенциал-активируемых калиевых каналов тетраэтиламмонием и, следовательно, представляет собой потенциал-активирусмый К⁺-ток. Таким образом, с помощью метода фиксации потенциала и использования избирательных блокаторов натриевого и калиевого токов удалось разделить и выявить по отдельности два тока, возникающих при генерации ПД, показать их независимость друг от друга и проанализировать каждый из них.

Рис. 2.6. Регистрация трансмембранных токов, текущих при генерации ПД с использованием метода фиксации потенциалов:

а — смещение мембранного потенциала на 56 мВ и фиксация его на уровне -9 мВ;

6 — двухфазный (ранний входящий и поздний выходящий) ток в ответ на фиксацию потенциала на уровне -9 мВ; в — фармакологическое разделение двух токов с помощью блокаторов натриевой (тетродотоксин) и калиевой (тетраэтиламмоний) проводимостей.