Биологические методы. 
Экологический мониторинг

Биологический метод анализа основан на том, что для жизнедеятельности — роста, размножения и вообще нормального функционирования — живых существ необходима среда строго определенного химического состава. При изменении этого состава, например при исключении из среды какого-либо компонента или введении дополнительного (определяемого) соединения, организм через какое-то время выдает ответный сигнал. Установление характера связи или интенсивности ответного сигнала организма с количеством введенного в среду или исключенного из нее компонента служит для его обнаружения и определения.

В биологическом методе аналитическими индикаторами служат различные живые организмы, их органы и ткани, физиологические функции и т. д. В роли индикаторного организма выступают микроорганизмы, беспозвоночные, позвоночные, растения.

Все вещества по отношению к живым организмам разделяют на следующие:

• • жизненно необходимые;
• • токсичные;
• • физиологически неактивные.

Очевидно, что только в двух первых случаях можно ожидать сравнительно быструю ответную реакцию организма.

От характера определяемого вещества зависит выбор того или иного индикаторного организма. Его ответный сигнал на изменение химического состава твердой, жидкой или воздушной среды может быть самым разнообразным: изменение характера поведения, интенсивности роста, скорости метаморфоз, состава крови, биоэлектрической активности органов и тканей, нарушение функций органов пищеварения, дыхания, размножения. Обобщенным показателем эффективности действия определяемого соединения на индикаторный механизм являются либо выживаемость, либо летальный исход.

Чем сложнее организм, тем большее число его жизненных функций можно использовать в качестве аналитических индикаторов, тем выше информативность биологического метода анализа. Диапазон определяемых содержаний, предел обнаружения соединений биологическим методом зависит от направленности и продолжительности воздействия химического соединения на организм, температуры и pH среды, уровня организации индикаторного организма, его индивидуальных, возрастных и половых особенностей.

Микроорганизмы. При использовании микроорганизмов (бактерий (рис. 9.2), дрожжей, водорослей, плесневых грибов) наблюдают, как с изменением химического состава питательной среды меняется динамика роста отдельной клетки и популяции в целом, и сравнивают с контрольным опытом. Интенсивность роста (размножения, угнетения) популяций оценивают чаще всего оптическими или электрохимическими методами.

Рис. 9.2. Микроорганизмы:

а — бактерии; 6 — водоросли Грибы как аналитические индикаторы широко используют при анализе почв на содержание таких элементов, как цинк, медь, марганец, железо, молибден, фосфор, углерод, азот, сера и др.

Ростовые реакции микроорганизмов, изменяющихся под действием различных химических соединений, применяют при анализе природных и сточных вод. С использованием бактерий и дрожжей разработан диффузионный метод обнаружения в сточных водах фенолов, нефтепродуктов, фосфорорганических соединений.

Беспозвоночные. Ответными сигналами беспозвоночных на изменение химического состава среды являются раздражение, приводящее к изменениям двигательных реакций, скорость размножения, характер питания, другие биохимические и физиологические изменения организма.

Наиболее изученными для использования в аналитических целях являются инфузории. С их помощью можно определять ТМ.

Водных беспозвоночных — ракообразных (чаще всего рачков, дафний, рис. 9.3) — широко применяют для оценки санитарно-гигиенического состава воды. В качестве выходного сигнала в этом случае используют некоторые физиологические показатели: выживаемость, частоту движения ножек, период сокращения сердца (у дафний), окраску тела погибших организмов и т. д.

Рис. 9.3. Беспозвоночные:

а — дафния; б — рачок Позвоночные. Классическими индикаторными организмами, широко используемыми для решения многих медико-биологических проблем, являются амфибии. На изолированных органах и тканях лягушки (рис. 9.4) либо на всем организме проверяют физиологическую активность многих фармацевтических препаратов. Биопотенциал нервной ткани можно использовать в качестве индикатора для определения концентрации кислот и щелочей, некоторых ТМ.

Рис. 9.4. Амфибии: а — лягушка; 6 — тритон При оценке качества среды, которую можно проводить разными способами, наиболее важным является ответ на вопрос, каково состояние популяции живых существ, сообществ и экосистем. Современные аналитические методы позволяют определить концентрацию токсичных соединений. Однако с их помощью нельзя определить степень опасности загрязнения для человека и для экосистемы в целом. Тем более, невозможно предсказать, как будет действовать смесь различных ксенобиотиков. Поэтому при мониторинге ОС в обязательном порядке предусматривается тестирование с использованием чувствительных к ксенобиотикам живых организмов (простейшие, рыбы и др.).

Наряду с биотестированием существуют специальные методы комплексной диагностики состояния среды обитания, которые включают в себя морфогенетические (генный анализ, морфологические и анатомические изменения и др.), биофизические и биохимические (биолюминесценция, фотосинтетическая активность и др.), биоэнергетические и иммунологические, токсикологические и эмбриологические, популяционные и экосистемные методы. Поскольку биодиагностические методы обеспечивают достоверную оценку качества ОС и, главное, ее пригодности для жизни, биодиагностика является обязательным компонентом комплексной оценки состояния среды обитания.

Биологический мониторинг представляет собой слежение за биоразнообразием: наличием видов, их численностью и состоянием, появлением не свойственных для данных экосистем видов и т. д.

При биомониторииге качества ОС используют биоиндикаторы — организмы или сообщества организмов, присутствие, количество или особенности развития которых служат показателями естественных процессов, условий или антропогенных измерений среды обитания. Многие организмы весьма чувствительны и избирательны по отношению к различным факторам среды обитания (химическому составу почвы, вод, атмосферы, присутствию других организмов и т. п.) и могут существовать только в определенных, часто узких границах изменения этих факторов.

Существуют различные методы биотестирования:

• • фитологическое картирование — картирование числа видов и степени проективного покрытия и сравнения с эталоном, в качестве которого обычно используют заповедные территории;
• • экспозиция в загрязненной среде растений или животных-биоиндикаторов и сравнение их с выращенными в нормальных условиях;
• • анализ изменений в составе и численности видов и сообществ;
• • анализ видимых повреждений организмов и др.

В особенно больших масштабах биоиндикаторы наблюдают в водных организмах, где коэффициент накопления загрязнителей по отношению к его содержанию в воде может достигать 10³—10⁴ и более. Многие организмы усваивают загрязнители селективно. Так, некоторые виды съедобных грибов накапливают кадмий, морские многоклеточные организмы асцидии — ванадий, а морские одноклеточные радиолярии и укроп обыкновенный — изотопы стронция.

Рассмотрим методы биологического мониторинга более подробно.

Морфогенетические методы. Флуктуирующая асимметрия — небольшие ненаправленные различия между правой и левой сторонами различных морфологических структур, в норме обладающих билатеральной симметрией. При этом анализе исследуют разницу между количественными признаками (числом шипиков, члеников, пятен и т. п.) на правой и левой половинах тела у животных, взятых с загрязненных и чистых (контрольных) территорий.

Фенодевианты — фенотипы, т. е. варианты проявления признака, отличающиеся от нормального, обычно встречающиеся в природе. Их появление обычно является результатом значительных нарушений развития.

Например, загрязнение ТМ увеличивает число соцветий у поповника обыкновенного с малым числом язычковых цветков.

Фрактал-анализ дает возможность с помощью математического аппарата исследовать нарушения в сложных процессах формообразования, закономерности которых в течение всего периода жизни остаются постоянными, т. е. могут быть описаны одной и той же системой уравнений. Например, расположение колец на чешуе рыб вдоль продольной оси представляет собой сложную волновую структуру, фрактал-коэффициент которой уменьшается при усилении стрессовых воздействий.

Генетические методы. Анализ генетических изменений используют для оценки состояния ОС. Проявление таких изменений характеризует мутагенную активность ОС, а возможность их сохранения в клеточных популяциях отражает эффективность иммунной потенции организма.

В нормальных условиях большая часть генетических аномалий удаляется из популяции посредством иммунной системы организмов. Наличие таких аномалий можно использовать в качестве индикатора стресса, ведущего к продукции аномальных клеток и снижению способности иммунной системы организма их уничтожать. В качестве генетических изменений в соматических (от греч. стара — «тело») клетках обычно рассматривают различные структурные изменения хромосом, а также аномалии в количестве хромосом (анеуплоидию) и появление устойчивых анеуплоидных клонов.

Биофизические и биохимические методы. Биолюминесценция — это видимое свечение живых организмов, связанное с процессами их жизнедеятельности и обусловленное у значительного числа видов ферментативным окислением особых веществ — люциферинов (от лат. lusifer — «светоносный») (см. параграф 6.3). Она широко распространена в природе и известна у бактерий, грибов, представителей разных типов животных — от простейших до хордовых.

У многоклеточных организмов (ракообразных, насекомых, рыб и др.) свечение часто обусловлено симбиотическими бактериями. Свечение могут испускать вся поверхность тела или специальные органы. Чаще всего в качестве биоиндикаторов используют морские люминесцентные бактерии.

Биолюминесцентные методы обладают хорошей чувствительностью к разнообразным химическим соединениям, характерным для промышленных сбросов, загрязнений почвы, воды, воздуха (ТМ, фенолы, формальдегид, пестициды и т. д.).

Фотосинтез — превращение зелеными растениями и фотосинтезирующими микроорганизмами лучистой энергии Солнца в энергию химических связей органических веществ. Интенсивность и характер фотосинтетической активности являются важнейшими показателями физиологического состояния растений и здоровья человека.

Одним из основных способов оценки интенсивности процессов фотосинтеза является флуометрия, основанная на измерении интенсивности люминесценции хлорофилла на длине волны 690 нм. В излучении Солнца эта длина волны представлена с наибольшей интенсивностью, что свидетельствует об адаптации живых организмов в процессе эволюции к солнечному свету.

Флуоресцентный метод позволяет контролировать суммарное количество органических веществ в воде по величине интегральной флуоресценции в области 390—560 нм. С помощью этого метода можно определять содержание нефтепродуктов в воде на длине волны 460—480 нм с пределом обнаружения 10^_6%.

Терпеноиды (изопреноиды) — природные соединения из групп липидов, производные от терпенов (группа преимущественно ненасыщенных углеводородов состава (С₅Н₈)_И, где п > 2), присутствующие во всех организмах, образующихся из мевалоновой кислоты. Эта группа химических соединений характеризуется огромным структурным разнообразием, обусловленным сложными окислительно-восстановительными процессами, изомерными перестройками и др. Они являются активными участниками обменных процессов, протекающих в растениях.

Анализ структурного разнообразия терпеноидов у растений может служить чувствительным неспецифичным тестом на воздействие различных факторов ОС. Увеличение разнообразия терпеноидов в листьях растений свидетельствует о нарушениях и сбоях в протекании важных физиологических процессов, таких как фотосинтетическая активность.

Супероксидные радикалы — продукты одноэлектронного восстановления кислорода, образуются в ходе нормального метаболизма у всех аэробных организмов. Под действием различных факторов — радиации, гинероксии, действия ксенобиотиков и др. — их количество в клетке может увеличиваться. Супероксидантные радикалы и продукты их превращения могут представлять серьезную опасность для жизнедеятельности — вызывать инактивацию ферментов, повреждение нуклеиновых кислот, деградацию полимеров и нарушение проницаемости мембран.

Уровень содержания в клетке супероксидных радикалов контролируется ферментом супероксиддисмутазой (СОД). Ее активность индуцируется повышением уровня образования супероксидных радикалов. По результатам измерения уровня СОД в клетках можно оценить, подвержен ли организм оксидантовому стрессу.

Биоэнергетические методы основаны на том, что любой физиологический процесс требует затрат энергии. Количество энергии, затрачиваемой организмами на все физиологические процессы в единицу времени, является отражением интенсивности энергетического метаболизма, которая может быть измерена методом респирометрии. Такие анализы позволяют установить ранние изменения в физиологическом гомеостазе. Количество энергии, расходуемой на процессы роста особи в стрессовых условиях, всегда выше, чем в оптимальных, из-за дополнительных затрат энергии на компенсацию этих воздействий. Таким образом, количество энергии, расходуемой во время роста, является характеристикой качества ОС.

Иммунологические методы анализа основаны на специфическом связывании определяемого соединения — антигена соответствующими антителами (специфическими белками крови, образующимися в результате иммунологических процессов, направленных на удаление из организма антигенов — генетически чужеродных тел). Иммунохимическая реакция в растворе между антителами и антигенами — это сложный процесс, протекающий в несколько стадий. В иммунохимическом анализе принципиально возможно использование только первой стадии, которой является обратимое образование комплексов состава 1:1.

Классические методы иммунохимического анализа основаны на образовании осадка антителами в присутствии антигена. При этом за протеканием этого процесса обычно наблюдают визуально и обнаруживают или полуколичественно определяют относительно высокие концентрации антигена. Эти методы длительны и трудоемки.

Определение малых концентраций комплекса «антиген — антитело», образовавшихся в растворе, становится возможным, если в один из исходных компонентов реакционной системы (антиген или антитело) ввести метку, которую легко детектировать СИ. Поскольку комплекс между определяемым соединением (антигеном) и специфическим антителом образуется строго стехиометрически, экспериментально устанавливаемая концентрация метки, входящей в состав образующегося иммунохимического комплекса, непосредственно связана с концентрацией антигена.

Чаще всего в иммунохимическом анализе используют изотопные, флуоресцентные, ферментные, парамагнитные метки, которые повышают чувствительность иммунохимических методов в миллионы раз и сокращают время анализа.

Иммунохимические методы анализа все активнее внедряют в аналитическую практику и применяют в различных областях медицины, сельского хозяйства, микробиологической и пищевой промышленности, при анализе объектов ОС.

Паталого-анатомические и гистологические методы. Гистологическое исследование внутренних органов является методом обнаружения влияния сильных токсикантов. При их воздействии происходят серьезные перестройки в структуре и функции клеток, которые могут быть зарегистрированы на тканевом уровне. Наиболее опасными последствиями подобных перестроек являются злокачественный рост клеток, их дегенеративные изменения или появление некротических очагов — отмирание клеток.

Отдельно следует отметить важность изучения репродуктивной системы, любые изменения которой непосредственно связаны с жизненно важными параметрами популяций. Репродуктивная система очень чувствительна к стрессовым воздействиям, и любое нарушение развития половых клеток и гонад можно рассматривать как сигнал о наличии неблагоприятных изменений ОС.

Токсикологические методы подразумевают оценку токсичных свойств веществ с использованием модельных живых систем. Оценку токсичности проводят в лабораторных условиях для нормирования, токсикологического контроля, анализа общих закономерностей действий токсичных веществ и т. п.

При использовании этих методов к основным показателям относят общие показатели роста, выживаемости, плодовитости и качества потомства.

В качестве тест-систем обычно используют культуры водных организмов: ракообразных (дафнии), водорослей и бактерий.

Эмбриологические методы базируются на том, что наиболее уязвимыми к воздействию внешних факторов являются ранние стадии развития многоклеточных организмов. На стадиях деления и формирования зародышевых органов и тканей даже незначительные воздействия, как правило, приводят к видимым уродствам на более поздних стадиях развития или даже гибели зародыша. В качестве тест-объектов обычно используют быстроразвивающихся и дающих многочисленное потомство животных (рыбы, моллюски, земноводные, насекомые).

Эмбриологические методы служат очень тонким индикатором для диагностики, в том числе и для количественных оценок состояния ОС.

Популяционные и экосистемные методы. Для мониторинга среды обитания в качестве популяционных и экосистемных методов используют анализ состояния таких показателей, как численность и биомасса отдельных видов, возрастной и половой состав популяций, пространственное размещение отдельных компонентов биологических сообществ, видовой состав и видовое разнообразие сообществ, соотношение в сообществах различных видов и их распределение по обилию или биомассе, соотношение численностей и биомасс видов в экосистемах.

Видовое разнообразие — одна из важнейших характеристик сообщества, отражающая сложность его видовой структуры. Видовое разнообразие включает в себя два компонента:

• 1) видовое богатство (насыщенность сообщества видами);
• 2) выравненное™ видовой структуры (степень равномерности распределения видов по обилию). Количественными мерами видового разнообразия являются различные (более 30) индексы.

Ранговое распределение — распределение видов (или других групп) по обилию, где виды ранжированы по мере убывания их обилия. В любом сообществе есть виды более обильные и более редкие, причем обильных обычно меньше, чем редких. Вид рангового распределения описывается эмпирическим законом, отвечающим природе данного экологического объекта.

СИ, используемые при биологическом мониторинге, весьма обширны и во многом аналогичны используемым в аналитических методах контроля.

В биохимических тест-методах на матрице иммобилизируют различные ферменты, антигены или антитела. Биотесты позволяют контролировать содержание болезнетворных микроорганизмов в природных, питьевых водах и др.

Одним из таких биотестов является система быстрой индикации патогенов, которая предназначена для выявления подвижных бактерий рода Salmonella в образцах пищевых продуктов и пробах из производственных помещений.

Система состоит из прозрачной полимерной емкости и помещенных в нее двух пробирок, каждая из которых содержит свой набор из двух сред: селективной (в нижней части) и индикаторной (в верхней части), разделенных пористой перегородкой. Жидкая избирательная среда в полимерной емкости инокулируегся (от лат. inoculation — «прививка») культурой обогащения. В результате этого подвижные сальмонеллы мигрируют через селективную среду в индикаторную, которая при этом изменяет свой цвет. Результат индикации появляется после 43 ч вместо 3—5 сут. при стандартном бактериологическом анализе.

Наибольшее развитие получили ферментные и клеточные биосенсоры.

Развитие методов включения живых клеток в полимеры и твердые носители привело к созданию соответствующих биосеисоров с использованием живых иммобилизированных клеток, обладающих уникальными свойствами.

Применение биосенсоров весьма разнообразно, например, известны биосенсоры для определения фенолов, пролина, тирозина и других аминокислот, глюкозы, молочной и аскорбиновой кислот и т. д. Определение ВПК воды и сточных вод с помощью биосснсора с иммобилизированными клетками занимает несколько минут, а традиционный метод — несколько дней.

Применение биосенсоров в качестве биологического компоненте ДНК может радикально изменить диагностику заболеваний, особенно на ранней стадии, в частности, в настоящее время интенсивно ведут работы, но ранней диагностике сердечно-сосудистых заболеваний, предрасположенности к раку и т. п.

Биочип (от греч. рюс — «жизнь» и англ, chip — «обломок», «осколок», «кусочек») — это устройство для проведения автоматического многофункционального биологического анализа. Он представляет собой пластину с нанесенным на нее гелем (рис. 9.5), на 99% состоящим из воды, в котором в результате облучения через специальное сито УФ-светом и последующей полимеризации получают ячейки размером 100×100×20 мкм. На биочипе их может быть от 600 до нескольких тысяч. Размер самого биочипа в зависимости от его назначения может меняться от размера марки до размера открытки.

Рис. 9.5. Внешний вид биочипа.

Автомат под контролем компьютера заполняет ячейки различными растворами, каждый из которых содержит молекулы-зонды биологических объектов — фрагментов ДНК, бактерий, вирусов и т. д., причем к каждой из молекул присоединено флуоресцирующее вещество.

При нанесении на биочин капли крови, плазмы и т. п. молекулы-зонды соединяются с «родственными» структурами, при этом вещество элементарной ячейки начинает флуоресцировать. Так можно опознавать бактерии, вирусы, дефектные гены — любое молекулярное вещество. Поскольку ячеек много, то анализ проводят сразу по множеству параметров, и по внешнему виду биочипа, совокупности его темных и светящихся областей можно судить о его результатах. Портрет биочипа можно рассмотреть в микроскоп, сфотографировать, сразу ввести в компьютер, запомнить и проанализировать, переслать по сети Интернет для консультации в любую точку планеты и т. д.

Использование биочипов позволяет уменьшить время анализов в несколько сотен и тысяч раз, повысить их достоверность, автоматизировать процесс обработки результатов и многократно уменьшить их стоимость, проводить раннюю диагностику и т. п.