Критика частных методов

Метод дифференциального растворения был введен в растительную хроматологию Slokes’oM (64) и Sorby (73). Оба ученые применяли двуфазные системы, состоящие из сероуглерода, этилового спирта и воды. Особенно искусно использован метод Sorby, которому удалось обнаружить главнейшие компоненты хлорофилла.

Более известен так называемый метод Крауса (Kraus et Milliardet, 68, Kraus, 72), в котором применяется двуфазная система, состоящая из этилового спирта, воды и бензина или петролейного эфира (Chautard, 74; Guignet, 85, Monteverde, 93).

Метод Крауса был бы идеален в случаях смесей двух веществ, обладающих заметно различными коэффициентами распределения в данной системе. Однако хлорофилл, равно как и спирторастворимые (липоидные) группы пигментов иных хромофиллов являются весьма сложными смесями, и метод Крауса, в пределах практической применяемости, может в лучшем случае разделить эти смеси на группы гипофазных и эпифазных пигментов.

Остановимся на хлорофилле, представляющем согласно моим исследованиям смесь хлорофиллина <*, хлорофиллина (3 каротина и ксантофиллов а, а', |3.

Типичная реакция Крауса с хлорофиллом наблюдается при пропорции воды к алкоголю, соответствующей 80-процентному спирту, причем бензина или петролейного эфира берется в два раза больше, чем спирта. В такой системе первые три поименованные пигмента хлорофилла в сильной степени эпнфазны, остальные же гипофазны; одни и другие не в одинаковой степени. «Кианофилл» Крауса, т. е. верхняя сине-зеленая бензинная фаза, должен, следовательно, содержать преимущественно оба хлорофиллина и каротин.

Адсорбционный анализ краусовского кианофилла подтверждает этот вывод. Раствор кианофилла в петролейном эфире промывается водой с целью удаления из него спирта (см. выше стр. 139) и встряхивается с порошком СаСО_а. Адсорбент оседает, окрашенный в зеленый цвет, между тем как жидкость всплывает желтой и представляет спектр каротина. При фильтровании же раствора ксантофилла через столб СаС0₃ появляются, кроме адсорбционной зоны хлорофиллина а, узкие зоны хлорофиллина и ксантофилла. Из трубки вытекает раствор каротина.

Присутствие желтого пигмента в кианофилле Крауса было уже доказано Guignet и особенно Monteverde (93), который отожествил этот пигмент с каротином. Монтеверде пользовался следующим способом отделения: кианофилловый раствор смешивается с абсолютным алкоголем, и к однородной жидкости прибавляется по каплям вода. Наступает момент образования двух фаз, и выделяющийся петролейный эфир увлекает с собой преимущественно каротин, между тем. как хлорофиллины остаются почти целиком в спиртовой фазе. Взбалтывая последнюю с небольшим количеством петролейного эфира, мы достигаем дальнейшего очищения ее от каротина. Этот прием сводится к тому, что создается двуфазная система, где пропорция воды меньше, чем в нормальной краусовской, т. е. применяется спирт большей концентрации (около 95%). В таком случае хлорофиллины являются гипофазными, а каротин остается эпифазным, хотя и в меньшей степени. Повторяя опыты Монтеверде с вытяжкой из Aspidistra elatior, я не достиг вышеупомянутым способом (после двух взбалтываний) полного удаления каротина из кианофилла. Хроматографический анализ очищенного кианофилла показал присутствие следов каротина. Кроме того, имелись налицо следы хлорофиллина р и ксантофилла. В спектре поглощения очищенного по Монтеверде кианофилла¹ характерные полосы поглощения хлорофиллина р (I и VI), впрочем, не обнаруживались;^[1][2] пропорция последнего пигмента, очевидно, слишком незначительна, чтобы его спектральные поглощения могли проявиться при слабой концентрации (толщине слоя) смешанного раствора, а при больших концентрациях расширенные полосы поглощения хлорофилла, а налегают на полосы хлорофиллина Р или сливаются с ними.

В целях выделения из хлорофилла каротина по методу дифференциального растворения (а также для удаления каротина из «кианофилла**) удобно пользоваться, как найдено мною, метиловым спиртом, который, от прибавления к нему уже самого незначительного количества воды, теряет способность смешиваться во всех пропорциях с петролейным эфиром.

Приготовляем петролейно-эфирный раствор хлорофилла; взбалтывая 15 см^[3][4][5] его с 5 см^[3] метанола (препарат Schering’a, содержащий следы воды), получаем две фазы. Нижняя (7 см^[7]) зеленого, верхняя (13 см⁸) зеленовато-желтого цвета. Взбалтывая верхнюю фазу несколько раз с новыми небольшими порциями метанола, мы получаем ее, наконец, чисто желтой и обнаруживаем в ней полосы поглощения каротина. Много каротина, однако, остается в метаноловых фракциях.

Если взбалтывать петролейно-эфирный раствор каротина с метанолом, то значительная часть пигмента переходит в метаноловую фазу, так что концентрация каротина в последней равняется (по колориметрическому сравнению) приблизительно четвертой части равновесной концентрации в петролейно-эфирной фазе. Водному 85%-ному раствору метанола петролейно-эфирный раствор каротина пигмента практически совсем не отдает.

Итак, бензинная (петролейно-эфирная) фаза Краусовской реакции (кианофилл) содержит, кроме каротина, хлорофиллины, а и р и немного ксантофиллов. Последние, так как они сильно гипофазны, легко удалить путем последовательного промывания петролейно-эфирного раствора 80-процентным спиртом. Хлорофиллины же эпифазны, хотя и не в одинаковой степени: первый более, чем второй. Этой разницей можно воспользоваться для относительного очищения пигмента, а и р (см. выше стр. 146). Действительно, путем повторяемых взбалтываний раствора с 80-процентным спиртом^[8] достигается изменение относительных пропорций обоих пигментов, и характерные полосы хлорофиллина Р (1 и VI) постепенно бледнеют и, наконец, становятся неуловимыми. Разумеется, при этом теряется большое количество хлорофиллина а, и относительная концентрация каротина постоянно возрастает, благодаря его совершенной эпифазности.

Вследствие того что хлорофиллин р менее эпифазен, чем хлорофиллин а, спиртовые фракции, служащие для промывания кианофилла, увлекают сравнительно больше пигмента р, чем пигмента а. Собирая эти фракции и методически обрабатывая их петролейным эфиром, можно было бы, следовательно, получить в конце концов раствор, в котором пигмент р преобладал бы в любой степени над пигментом ос.

Если этот результат практически и недостижим, то все же, получая растворы, сравнительно обогащенные хлорофиллином р, мы заставляем выступать его специфические спектральные поглощения, что имеет как эвристическое, так и контрольное значение. Во второй части настоящей книги мы увидим, что рационально использованный метод Крауса позволяет контролировать спектроскопические наблюдения, произведенные над хлорофиллами, отделенными по адсорбционному методу.

Обратимся теперь к ксантофиллу Крауса. По способу получения он должен содержать в себе все гипофазные (в данной системе растворителей) пигменты хлорофилла. Адсорбционный анализ обнаруживает таковых не менее трех: ксантофилл а, а' и р. Наиболее гипофазен ксантофилл р, наименее — ксантофилл <*.

На этом основании легко обнаружить спектроскопическим путем неоднородность «ксантофилла» Крауса. Прибавляя к спиртовому раствору названного «ксантофилла» постепенно воды и встряхивая каждый раз с петролейным эфиром, получаем петролейно-эфирные фракции, спектральные свойства которых не одинаковы, а именно: оси обеих полос поглощения между линиями F и G перемещаются в последующих фракциях постепенно слева направо.

Метод Стокляса. Из описания «реакции Крауса», данного самим автором, явствует, что он применял петролейный бензин. Wiesner (74) и некоторые другие показали, что можно пользоваться и бензолом, а также толуолом и ксилолом. Konrad (72), работая с бензолом, отметил, что для удачного разделения хлорофилла на ксантофилл и кианофилл, спиртовой раствор пигмента должен быть разбавлен водою до крепости ниже 65%. Действительно, при употреблении более концентрированного спирта последний образует с бензолом трудно разрешающуюся эмульсию или же единственную жидкую фазу. Тот же бензол, применительно к реакции Крауса, употреблялся в новейшее время Stoklasa (96, 08) с целью получать мифический «чистый хлорофилл» для химического анализа. Пражский ученый думает именно, что «кианофилл» Крауса есть определенный пигмент: легендарный зеленый «хлорофилл» .

Очевидно, прежде всего, что бензольная фаза в системе, употребляемой Стокляса, должна содержать весь каротин; что же касается распределения остальных пигментов, то мною предпринят был следующий опыт.

Растертые с наждаком листья шпината были быстро извлечены на холоду алкоголем. Профильтрованный темнозеленый раствор был смешан с бензолом, прибавлялось затем к нему воды до тех пор, пока, после встряхивания, мутная эмульсия не разрешалась с заметной быстротой на нижнюю — желтую и верхнюю — темнозеленую фазы. Первая затем удалялась, а вторая, разбавленная бензолом, еще два раза промывалась водным спиртом. Затем бензольная фаза была сильно разбавлена петролейным эфиром, и смесь промыта водою с целью удаления спирта (стр. 139). Хроматографическое разложение раствора в столбе СаСО дало следующие зоны:

A. Бесцветная.

B. Желто-зеленая (хлорофиллин fJ).

C. Зеленовато-синяя (хлорофиллин а).

D. Желтая (ксантофиллы).

Кроме того, внизу была замечена слабоокрашенная зона серого стального цвета (хлорофиллин а), а из трубки вытекала желтая жидкость (раствор каротина); зона А была приблизительно так же высока, как В, ив два, три раза ниже С. По пропускании тока чистого бензола все зоны расширились, и желтая раздвоилась. Как видно, реакция Крауса, произведенная с бензолом, не в состоянии выделить в бензольной фазе какой бы то ни было пигмент хлорофилла. Последняя содержит не только оба хлорофиллина, ксантофиллы и каротин, но еще бесцветные примеси (зона А вышеупомянутого хроматограмма). Следует упомянуть, что в дважды промытом спиртом «кианофилле» Крауса эти примеси отсутствуют.

Метод Стокса и Сорди. Экспериментального исследования метода Stokes’a и Sorby (73) я не предпринимал. Из подробного исследования последнего автора видно, что сероуглерод играет в его методе ту же роль, что бензин в методе Крауса: хлорофиллины, а и р («синий и желтый хлофиллины» Sorby) скопляются преимущественно в сероуглеродной фазе (которая является нижней), равно как каротин («оранжевый ксантофилл» Sorby), между тем как ксантофиллы остаются в спиртовой фазе. Для отделения каротина от хлорофиллинов Sorby встряхивает сероуглеродную фазу многократно со свежими порциями спирта, который уносит мало-помалу хлорофиллины, оставляя в сероуглероде каротин. Получить в чистом виде хлорофиллин (J Sorby не удалось; он получал лишь обогащенные этим пигментом смеси с хлорофиллином а. Что касается желтой спиртовой фазы, получаемой при встряхивании раствора хлорофилла с сероуглеродом, то Sorby мог убедиться на основании приема, аналогичного описанному мною выше (стр. 151), что она не содержит однородного пигмента. Он предположил существование в ней двух ксантофиллов («ксантофилл» и «желтый ксантофилл»).

• [1] Монтеверде называет его. аморфным хлорофиллом®,
• [2] То же самое наблюдал Монтеверде. В оригинальном же киано-
• [3] филле Крауса, согласно его наблюдениям, выступают между линиями
• [4] Fug две полосы поглощения, первая из которых, более слабая, принад
• [5] лежит хлорофиллину р. Полосы поглощения каротина не выступают
• [6] филле Крауса, согласно его наблюдениям, выступают между линиями
• [7] вследствие слабой относительной пропорции этого пигмента.
• [8] Этот спирт нужно предварительно насытить петролейным эфиром, если нежелательно уменьшение объема промываемого раствора. Или же можно к последнему прибавлять немного петролейного эфирапостепенно.