Создание трансгенных растений

С давних времен человек методом искусственного отбора создавал сорта культурных растений для питания и других хозяйственных нужд. Такая селекция проводилась для увеличения продуктивности, плодовитости и урожайности, устойчивости к вредителям и заболеваниям, неблагоприятным условиям среды, для улучшения вкуса, внешнего вида, лежкости плодов и овощей, для повышения содержания белка в зерне и многого другого.

Современные методы генетики и селекции позволили многократно ускорить этот процесс, однако основой таких работ был геном только того вида, который использовался в селекционной работе, и все возможности всегда были ограничены этими рамками. В последние десятилетия XX века был предложен способ перешагнуть через этот барьер и придать культурным растениям и сельскохозяйственным животным свойства и признаки, которыми они не обладали ранее. Этот способ — создание трансгенных или генно-модифицированных организмов. Генно-модифицированные организмы (или организм) — это любые неклеточные, одноклеточные или многоклеточные образования, способные к воспроизводству или к передаче наследственного генетического материала, отличные от природных организмов, полученные с применением методов генной инженерии, и содержащие генно-инженерный материал, в том числе гены, их фрагменты или комбинации генов.

Возможность получать трансгенные растения существует в связи с тем, что растительные клетки обладают тотипотентностью, т. е. возможностью регенерации in vitro нормальных, фертильных растений из недифференцированных соматических тканей.

Для создания трансгенных растений необходимо иметь:

• 1) средства внедрения чужеродных генов в реципиентные растительные клетки (векторные молекулы);
• 2) гены, которые необходимо ввести в растение;
• 3) способы внедрения чужеродных генов;
• 4) методы доказательства трансгенности трансформированных растений (наличие в их геноме трансгена);
• 5) методы доказательства экспрессии трансгенов в природной селектируемой системе.

Векторные молекулы для трансформации растений. Для того чтобы донести рекомбинантную ДНК в клетку-рецепиент, встроить ее в геном, позволить идентификацию трансформированных клеток, обеспечить стабильную экспрессию введенного гена, служат векторные молекулы или векторы.

Вектор — молекула ДНК или РНК, состоящая из двух компонентов: векторной части (носителя) и клонируемого чужеродного гена. К векторам предъявляют определенные требования.

• 1. Векторы должны иметь область, чувствительную к определенной эндонуклеазе рестрикции, которая расщепляет вектор, как правило, в одном участке, превращая его кольцевую форму в линейную. К линейной ДНК с помощью ферментов лигаз «пришивают» ген или гены и затем снова замыкают ее в кольцо, и рекомбинантную ДНК вводят в клетки.
• 2. Вектор может реплицироваться в определенных клетках. Репликация осуществляется посредством специфического участка ДНК.
• 3. В составе векторной молекулы должен быть маркерный ген, который после проникновения вектора в клетку придает ей фенотип, свидетельствующий о присутствии вектора.
• 4. Гены, которые переносятся векторной молекулой, экспрессируются в трансформированных (трансфецированных) клетках, т. е. в векторную молекулу надо встроить также регуляторные и терминаторные последовательности.

Строение агробактерий. Удобный способ доставки чужих генов в растительные клетки был подсказан самой природой. Трансформация растений осуществляется с помощью почвенных бактерий Agrobacterium tumefaciens (вызывающих образование опухолей в виде тератом или «корончатых галлов») и Agrobacterium rhizogenes (образующих опухоли в виде пучка корней — «hairy root» или, так называемые, «бородатые корни). Как и у большинства других бактерий, часть их генома находится не в основной хромосоме, а в плазмидах. Например, A. tumefaciens штамм с58 имеет следующую хромосомную организацию: 2 м.п.н. линейной, 2.8 м.п.н. кольцевой хромосомы и 206.479 п.н. плазмиды). Ti-плазмиды (tumor-inducing, опухолеобразующие), найденные в Agrobacterium tumefaciens или Ri-плазмиды (rootinducing, корнеобразующие) в Agrobacterium rhizogenes, оказались подходящим инструментом для генной инженерии.

Агробактерии являются мезофильными обитателями почвы, среди них встречаются как сапрофитные (A. radiobacter), так и фитопатогенные (A. tumefaciens, A. rubi, A. rhizogenes, A. virus) виды. Это короткие, подвижные грамотрицательные палочки с перитрихиальными жгутиками.

Опухолевый рост у растений, индуцированный патогенными штаммами Agrobacterium, представляет собой особый случай паразитизма: паразит (агробактерия) изменяет обмен веществ у хозяина, вводя свою генетическую информацию в его геном. Такое явление получило название «генетическая колонизация». Этот процесс является уникальным примером горизонтального переноса ДНК между царствами — бактерий и высших растений. Ферментативный механизм растения, отвечающий за транскрипцию собственной ДНК и синтез белка, распознает чужеродную ДНК из бактерии как свою собственную и транскрибирует ее вместе с обычными растительными генами, синтезируя опины, вещества которые служат бактериям в качестве источника углерода и азота. Это создаёт селективные преимущества для агробактерий, так как только они имеют гены, ответственные за деградацию этих соединений. Опины являются не только субстратом катаболизма агробактерий, но и индуктором трансмиссивности Ti-плазмид, участвуя в индукции конъюгативного обмена плазмидами между агробактериями и в их переносе в близкородственные бактерии рода Rhizobium, т. е. способствуют распространению этих плазмид в популяции. В зависимости от типа синтезируемых опинов штаммы агробактерий подразделяются: A. tumefaciens на октопиновые и нопалиновые, a A. rhizogenes на маннопиновые, агропиновые и кукумопиновые.

В природе образование опухоли начинается с повреждения стебля растения у самой земли. От пораненных растительных клеток отделяются различные компоненты клеточной стенки (глюкоза, глюкуроновая кислота, галактоза, галактуроновая кислота, арабиноза, манноза, фукоза, целлобиоза и ксилоза), а также начинают синтезироваться специальные вещества — предшественники лигнина — ацетосирингон и гидроацетосирингон, способствующие залечиванию раны. Патогены чувствительны ко всем этим веществам и начинают двигаться к поврежденному участку ткани по градиенту концентрации этих веществ со скоростью 60 мкм/сек, а затем прикрепляются к клеткам растения в местах повреждений. Бактериальные сайты связывания и рецепторы растений являются конститутивными, т. е. оба партнера обладают ими еще до момента взаимодействия. После прикрепления к поверхности клеток растения бактерии начинают образовывать целлюлозные фибриллы, которые видны при микроскопировании через 90 минут после добавления бактерий и к 10 часам инкубации формируют сеть, покрывающую поверхность растительных клеток. Фибриллы служат более прочному закреплению бактерий на поверхности хозяина. За целлюлозные фибриллы могут зацепиться свободно плавающие клетки бактерий, за счет чего увеличивается множественность заражения. Скопления бактерий на поверхности растения возрастают также в результате размножения.

Плотный контакт бактерий с плазмалеммой растительной клетки обеспечивается вследствие повреждения клеточных стенок пектолитическими ферментами, выделяемыми бактериями. Этот контакт необходим для передачи ДНК от бактерий в растительную клетку. Передача ДНК происходит без нарушения целостности мембраны растительной клетки, но требует определенного её состояния — компетентности. Она возникает вследствие связывания имеющихся в экссудатах углеводов с периплазматическим доменом бактериального рецептора, который представляет комплекс с белком-продуктом бактериального хромосомного вирулентного гена ChvE.

В геноме A. tumefaciens находится три генетических локуса, необходимых для трансформации растительной клетки. Один локализован на агробактериальной хромосоме, а другие два на Ti-плазмиде. Первый компонент системы трансформации — это Т-ДНК (от англ, transferred DNA, т. е. «переносимая ДНК») переносимая в растение часть Ti-плазмиды, на которой локализованы гены синтеза ферментов, вызывающие формирование опухолей на растении, а также гены синтеза опинов. В отличие от транспозонов, Т-ДНК после встраивания не может переноситься вторично, так как не несет генов, ответственных за перенос.

Вторая — это vir-система (vir — virulence inducing region, область регулирующая вирулентность), кодирующая гены, контролирующие синтез и перенос Т-ДНК в растение. Она находится за пределами Т-ДНК и не переносится в растительную клетку. Vir-гены экспрессируются под воздействием сигнальных молекул. Кластер vir-генов состоит из 6—7 генов в зависимости от штамма агробактерии. Например, в Ti-плазмиде нопалинового типа в области vir локализовано шесть различных групп комплементации virA, virB, virC, virG, и virD, virE, организованных в единый регулон. Октопиновая Ti-плазмида Arh 5 имеет дополнительный локус virF, расположенный справа от локуса virE.

Белки этих генов обеспечивают отделение Т-ДНК от Ti-плазмиды. Регуляторная система, контролирующая экспрессию генов vir, работает следующим образом — экспрессируемый конститутивно ген vir А выполняет функцию рецепции комплекса белка ChvE и передает этот сигнал в бактериальную клетку. Этот мембранный хеморецептор после принятия внешнего сигнала активирует продукт гена virG, который в свою очередь выступает в качестве позитивного регулятора собственной транскрипции и транскрипции остальных генов vir. Индукция vir генов обратимая, и каскад реакций может быть прерван, что очень важно для патогена: в случае, если хозяин больной и нежизнеспособный организм, то перенос Т-ДНК в его клетки не осуществляется.

После активации vir-генов в оболочке бактерии образуется разрыв, через который Т-ДНК переносится в растительную клетку. (Похожим образом у бактерий происходит половой процесс, когда микробы просто обмениваются копиями плазмид.).

На Ti-плазмиде находятся также гены, кодирующие ферменты катаболизма опина и сайт инициации репликации (ori), который обеспечивает стабильное поддержание плазмиды в агробактериях и запускается путем самозапуска (quorum sensing system) при достижении концентрации клеток в бактериальной популяции определенного порога.

У агробактерий, кроме того, имеются бактериальные хромосомные гены, продукты которых также участвуют в процессе трансформации. Это третий компонент vir-системы переноса Т-ДНК в растения. К нему относятся chrv-гены (chromosomal virulence): chvA, chvB, chvE, chvD, chvG, chvl, а также несколько других хромосомных генов — miaA, ros, pscA, ivr. В отличие от плазмидных, хромосомные гены экспрессируются конститутивно.

Продукты первых трех хромосомных генов влияют на поверхностные свойства агробактерий и определяют способность агробактерий прикрепляться к поверхности растительной клетки.

Т-ДНК, являясь фрагментом Ti-плазмиды, ограничена двумя прямыми повторами из 25 нуклеотидов, которые «обманывают» ферменты растительной клетки, заставляя их принять Т-ДНК за родную и встраивать ее в собственный геном. Правый конец обозначается П (RB — right border), левый соответственно Л (LB — left border). В этой области сайт-специфические эндонуклеазы, кодируемые vir-областью, производят одноцепочечный разрыв, служащий началом репликации по типу разматывающегося рулона, происходящей в процессе транспорта плазмиды. Репликация обеспечивает сохранение плазмиды в материнской клетке и появление ее копии в дочерней. Для нормального процессинга Т-ДНК и переноса в растительную клетку особенно важна ее правая граница, которая одна может определять полярность переноса Т-ДНК. Удаление правой границы из Ti-плазмид делает агробактерии полностью авирулентными. Замена ее на искусственно синтезированную, так же как и на левую, восстанавливает вирулентность бактерии. ДНК, помещенная между этими границами, может быть перенесена и встроена в ядро растительной клетки. Максимальный размер фрагмента ДНК, который может быть перенесен, пока не определен.

После переноса в ядро растительной клетки, Т-ДНК встраивается в геном в виде одной или нескольких копий. При этом одна из нитей плазмидной ДНК деградирует, а другая за счет рекомбинации с гомологичным участком ДНК клетки-хозяина может включиться в хромосому или внехромосомную единицу.

Как уже упоминалось ранее, в Т-ДНК в зависимости от типа Ti-плазмиды находится от семи до тринадцати генов, ответственных за опухолевый фенотип. Гены 1 и 2 (iaaMn и iaaH [tmsl и tms2]) кодируют ферменты, принимающие участие в синтезе растительного гормона ауксина (индолилуксусной кислоты), в то время как ген 4 (fmr известный также как ген ipt), кодирует изопентенилтрансферазу, синтезирующую цитокинин изопентенила аденозин 5'-монофосфат. Эти ферменты начинают синтезироваться за счет клеточных механизмов синтеза белков. Одновременная транскрипция генов 1, 2 и 4 приводит к повышению уровня фитогормонов внутри трансформированных клеток. Результатом этого является повышение митотической активности и образование опухоли. Другие гены Т-ДНК кодируют синтез опинов, представляющих собой производные аминокислот и сахаров.

У Ri-плазмид имеются общие черты с Ti-плазмидой, в том числе гомологичная vir-область. На ее Т-ДНК имеются гены, кодирующие опины и два гена синтеза ауксина, которые в значительной мере гомологичны ауксиновым генам tmsl и tms2. Однако эти гены в индукции корнеобразования «hairy root» играют вспомогательную роль, а основную роль играют гены rolA, rolB, rolC, rolD, не имеющие гомологии ни с одним из генов Т-ДНК A. tumefaciens.

В начале 80-х годов различными группами исследователей Tiи Riплазмиды были модифицированы путем удаления онкогенов (генов синтеза фитогормонов и опинов) из области Т-ДНК. Из агробактериальных плазмид была также удалена вся лишняя ДНК, не нужная при клонировании и был добавлен сайт инициации репликации, вырезанный из плазмиды кишечной палочки Е. coli, чтобы можно было в ней клонировать плазмиды. Такие модифицированные плазмиды назвали «обезоруженными». После переноса с их помощью ДНК в ядро растительной клетки нормальный рост растения не нарушался. На место удалённых онкогенов в Т-ДНК встраивают нужные гены: один или несколько целевых и не менее двух маркерных, которые позволяют отобрать сначала клетки кишечной палочки, а потом растительные, в которых перенос генов прошел удачно — ген устойчивости к определенному антибиотику или кодирующий светящийся белок, и т. п.

Все такие работы по конструированию векторных плазмид проводят с помощью специальных ферментов.