Методы экологии микроорганизмов

Выделение микроорганизмов из экониш и проблемы, связанные с некультивируемыми формами

Большинство микроорганизмов, растущих в природных образцах, еще ждут своей очереди быть выделенными в чистые культуры. По некоторым оценкам, мы можем культивировать меньше 0,1% всего микробного разнообразия.

Десятки тысяч видов микроорганизмов, живущих как симбионты животных и растений, нуждаются в выделении и идентификации. Хотя многие из таких микроорганизмов относят к так называемым «некультивируемым» и, таким образом, остающимся недоступными классическим микробиологическим методам идентификации, существует несколько способов, позволяющих оценить их разнообразие и распространение. Такие методы включают прямые микроскопические наблюдения и различные приемы на основе молекулярной диагностики, включая амплификацию диагностирующих последовательностей генома, кодирующих синтез молекулы 16S рРНК, для последующей их расшифровки.

Методы прямого прижизненного окрашивания различных проб воды, почвы и осадков позволяют с уверенностью считать, что этот метод выделяет гораздо больше живых клеток, чем высевы на различные среды (см. подразд. 5.4 и 2.5.4). Другими словами, результаты прямого счета живых клеток микроорганизмов показывают, что пока мы нс можем вырастить и идентифицировать более 99% видов микроорганизмов из таких проб. Такое большое расхождение в результатах прямого счета в сравнении с высевом на среды поставило вопрос: являются ли прижизненно окрашенные микроорганизмы живыми или мертвыми? При применении в качестве прижизненного красителя акридинового оранжевого было замечено, что часть клеток окрашивается с последующей зеленой флуоресценцией, часть остается оранжевой. Это привело вначале к неверному выводу, что зеленые клетки — живые, а оранжевые — мертвые. Впоследствии было, однако, выяснено, что цвет флуоресценции зависит от отношения ДНК/белок в клетке: активно делящиеся клетки выглядят зелеными, а растущие более медленно или покоящиеся клетки дают оранжевую флуоресценцию, оставаясь при этом живыми.

В дальнейшем были разработаны более прямые методы, основанные на оценке метаболитической активности клеток (клеточное дыхание), позволяющие отличить живые клетки от неживых в природных пробах. Методы основаны на применении различных солей тетразолия, которые при восстановлении в клетке дегидрогеназами (дыхательная активность) превращаются в нерастворимый формазан красного цвета, что можно обнаружить визуально под микроскопом. Есть способ различать живые, мертвые и поврежденные (умирающие) клетки при измерении состояния мембранного потенциала с помощью флуорохромов. Предлагают также добавление к пробам живых клеток ингибитора клеточного деления (налидиксовой кислоты), при этом активно растущие клетки будут удлиняться без вступления в фазу бинарного деления.

Возможно, многие микроорганизмы, наблюдаемые при прямом микроскопировании как живые, вступили в состояние «некультивируемой формы бактерий (НФБ)» (см. подразд. 2.5). Эта концепция была предложена американским микробиологом Р. Колвелл в 1987 г. Вначале концепция была встречена с критикой, однако к настоящему времени получила повсеместную поддержку. Показано, что часть клеток из природных образцов не дает колоний на лабораторных средах, хотя в природе они ведут активный образ жизни и патогенные формы удерживают свою вирулентность по отношению к животным. Эксперименты четко показали, что такие патогены человека, как Legionella pneumophila, Salmonella enter it id is, Vibrio cholerae и V. vulnificus, постоянно образуют НФБ формы в природных эконишах. Таким образом, становится понятной важность прямых микроскопических наблюдений природных образцов для обнаружения НФБ патогенов.

Для наблюдения за некультивируемыми формами микроорганизмов в природных образцах применяют методы молекулярного анализа. Разработано несколько десятков диагностических пробпоследовательностей ДНК/РНК для специфического обнаружения определенных видов, родов, семейств или таксонов более высокого порядка непосредственно в природных образцах. С использованием таких последовательностей было обнаружено, что морские воды содержат многие виды архей и бактерий, которые не поддаются культивированию в лаборатории. Наиболее подходящие для такой диагностики олигонуклеотидные пробы длиной 18 — 20 нуклеотидов, так как они легко гибридизируются со специфическим участком ДНК искомого организма. Даже небольшие количества не культивируемых форм могут быть обнаружены в популяциях природных образцов с помощью ПЦР-амплификации диагностических последовательностей ДНК (см. гл. 6). Жизнеспособные клетки микроорганизмов могут быть идентифицированы также с помощью специфических и PH К методом обратной транскрипции, при этом следует помнить, что время полужизни некоторых бактериальных иРНК может составлять меньше минуты.