Исследование уровня цитокинов у больных с гнойно-воспалительными заболеваниями

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

Пензенский государственный педагогический университет

имени В. Г. Белинского

Факультет Кафедра

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА НА ТЕМУ:

Исследование уровня цитокинов у больных

с гнойно-воспалительными заболеваниями

Студент__________Акишина Ю. В.

Руководитель___ _Фирстова Н. В.

_____________________Дружинина Т. А.

К защите допустить. Протокол №

от «_____» ____________2008 г.

Зав. кафедрой______Генгин М. Т.

Пенза, 2008 год

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Цитокины

1.1.1. Клетки-продуценты цитокинов

1.1.2. Рецепторы цитокинов и механизм действия цитокинов на клетку

1.1.3. Классификация цитокинов по механизму действия

1.1.4. Интерлейкин-4

1.1.5. Гамма-интерферон

1.2. Гнойно-воспалительные заболевания

1.2.1. Фурункулез

1.2.2. Остеомиелит

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы исследования

2.2. Методы исследования

2.2.1. Метод определения уровня интерлейкина-4 в сыворотке крови…

2.2.2. Метод определения уровня гамма-интерферона в сыворотке крови

2.2.3. Статистическая обработка результатов исследования

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Результаты исследования уровня интерлейкина-4 и гамма-интерферона в сыворотке крови больных с различным уровнем иммуноглобулина Е при хроническом рецидивирующем фурункулезе

3.1.1. Результаты исследования уровня интерлейкина-4 в сыворотке крови у больных с хроническим рецидивирующим фурункулезом

3.1.2. Результаты исследования уровня гамма-интерферона в сыворотке крови у больных с хроническим рецидивирующим фурункулезом

3.2. Результаты исследования уровня интерлейкина-4 и гамма-интерферона в сыворотке крови больных с различным уровнем иммуноглобулина Е при хроническом остеомиелите

3.2.1. Результаты исследования уровня интерлейкина-4 в сыворотке крови у больных с хроническим остеомиелитом

3.2.2. Результаты исследования уровня гамма-интерферона в сыворотке крови у больных с хроническим остеомиелитом

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1. Интерлейкин-4 и гамма-интерферон при хроническом рецидивирующем фурункулезе

4.2. Интерлейкин-4 и гамма-интерферон при хроническом остеомиелите…

ВЫВОДЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БПС (STP) — белки-переносчики сигнала

ГВЗ — гнойно-воспалительные заболевания

Г-КСФ — гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

ГМ-КСФ — гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

ГКГ — главный комплекс гистосовместимости

ИЛ, IL — интерлейкин

ИФН, IFN — интерферон

ИФНг — интерферон-гамма

ЛПС — липополисахарид

М-КСФ — макрофагальный колониестимулирующий фактор

О — остеомиелит

ПСАТ (STAT, от англ. Signal transducers and activators of transcription) — переносчики сигнала и активаторы транскрипции

ТМБ — тетраметилбензидин

Тх — Т-хелперы

ФНО — фактор некроза опухоли

Ф — фурункул

ХРФ — хронический рецидивирующий фурункулез

— внести в список: Кетлинский С. А. // Роль Т-хелперов типов 1и 2 в регуляции клеточного и гуморального иммунитета / Иммунология, 2002. — том. 23. — № 2. — С.77 — 79.

— ВНЕСТИ В СПИСОК: Медуницын Н. В. // Цитокины и аллергия, опосредованная IgE / Иммунология, 1993. — № 5. — С.11 — 18.

— ВНЕСТИ В СПИСОК: Акжигитов Г. Н., Галеев М. А., Сахаутдинов В. Г., Юдин Я. Б. Остеомиелит, М., Медицина, 1986, с.23−28

— ВНЕСТИ В СПИСОК: Белохвостикова Т. С., Кирдей Л. Е., Гаврилова Е. Ю., Промтов М. В., Леонова С. Н., Кирдей Е. Г. Коррекция вторичных нарушений иммунной системы при хроническом посттравматическом остеомиелите./Медицинская иммунология, 2002, т.4, № 2, с.228−229.

— выверять литературу‚ затем убрать висячие строки‚ затем выверять страницы содержания и текст диплома

Гнойно-воспалительные заболевания (ГВЗ) остаются одной из актуальных проблем современной медицины. Так 1/3 всех хирургических больных — это больные с гнойно-воспалительными осложнениями. В дерматологической практике на долю гнойно-воспалительных процессов приходится 29% случаев, а у детей 37% всех кожных заболеваний.

Иммунология ушедшего столетия, как известно, была богата новыми основополагающими фактами, благодаря которым она стала одной из центральных медико-биологических наук современности. К числу фактов, которые были положены в основу развития одной из важнейших областей иммунологии — учения о медиаторах иммунитета — относится и комплекс данных, появившихся еще в 60-х годах прошлого столетия и сформировавшихся в настоящее время в учение о цитокинах.

Огромное количество имеющихся и постоянно пополняющихся данных, новые и подчас неожиданные факты, не прекращающий увеличиваться перечень различных цитокинов, идентификация их рецепторов и соответствующих генов, описание каскада молекулярных основ лиганд-рецепторных взаимодействий — далеко не полный перечень фактов, которые иллюстрируют масштабность этого направления исследований.

Параллельно с развитием фундаментальных исследований, практически с такой же стремительностью началось и использование определения цитокинов в клинике при самой разнообразной патологии, и сейчас практически невозможно назвать патологию, которая не была бы предметом изучения цитокинов.

Определение цитокинов в клинике преследует различные цели: оценку тяжести течения процесса, эффективности терапии, прогнозирование и др. К сожалению, предпринимаются и попытки использования определения цитокинов для диагностики, что в настоящее время пока не обосновано.

Цель нашей работы состояла исследовании уровня интерлейкина 4 и гамма-интерферона в сыворотке крови при хроническом рецидивирующем фурункулезе и хроническом остеомиелите у больных с разным уровнем общего иммуноглобулина Е.

В связи с поставленной целью были определены следующие задачи:

1. Освоить методику двухсайтового иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием набора «ИФА-IL-4» и «ИФА-IFN-gamma» для определения интерлейкина 4 и гамма-интерферона соответственно в сыворотке крови.

2. Провести лабораторный анализ концентрации интерлейкина 4 и гамма-интерферона в сыворотке крови больных хроническим рецидивирующим фурункулёзом на фоне повышенного уровня иммуноглобулина Е.

3. Провести лабораторный анализ концентрации интерлейкина 4 и гамма-интерферона в сыворотке крови больных хроническим рецидивирующим фурункулёзом на фоне нормального уровня иммуноглобулина Е.

4. Провести лабораторный анализ концентрации интерлейкина 4 и гамма-интерферона в сыворотке крови больных хроническим остеомиелитом на фоне повышенного уровня иммуноглобулина Е.

5. Провести лабораторный анализ концентрации интерлейкина 4 и гамма-интерферона в сыворотке крови больных хроническим остеомиелитом на фоне нормального уровня иммуноглобулина Е.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.2. Цитокины: общие сведения

Термин предложен С. Кохеном в 1974 г.

Цитокины — группа гормоноподобных белков и пептидов, с молекулярной массой от 8 до 90 кДа, часто гликозилированных, синтезируемых и секретируемых клетками иммунной системы и другими типами клеток.

От гормонов цитокины отличаются лишь частично: они продуцируются не железами внутренней секреции, а различными типами клеток; кроме того, они контролируют гораздо более широкий спектр клеток-мишеней по сравнению с гормонами.

Разнообразные биологические функции цитокинов подразделяются на группы [Перцева Т.А., Конопкина Л.И. Интерфероны и их индукторы // Український хіміотерапевтичний журнал. — 2001. _ № 2. — С. 62−67.]:

· они управляют развитием и гомеостазом иммунной систем;

· осуществляют контроль за ростом и дифференцировкой клеток крови (системой гемопоэза);

· принимают участие в неспецифических защитных реакциях организма, оказывая влияние на воспалительные процессы, свертывание крови, кровяное давление;

· цитокины принимают участие в регуляции роста, дифференцировки и продолжительности жизни клеток, а также в управлении апоптозом.

По структуре выделяют несколько разновидностей молекул цитокинов, каждый из которых кодируется собственными генами. Состоят цитокины из одной — двух, реже более, полипептидных (гомои гетерологичных) цепей (мономеры, димеры, тримеры)‚ с молекулярной массой от 8 до 90 кДа, в основном 15−35 кДа. Подавляющее большинство из них в качестве характерного структурного элемента содержит 4 б-спирали и лишь для немногих (ИЛ-1, ФНОв, трансформирующий фактор роста) характерно преобладание в-слоистой структуры.

1.1.1. Клетки-продуценты цитокинов

Можно выделить 3 относительно автономные группы клеток — продуцентов цитокинов (табл. 1). Это

· стромальные соединительнотканные клетки, которые вырабатывают цитокины и ответственны преимущественно за гемопоэз;

· моноциты/макрофаги, которые являются продуцентами цитокинов — медиаторов воспаления;

· лимфоциты, вырабатывающие лимфокины, которые обеспечивают развитие антигенспецифической составляющей иммунного ответа.

Таблица 1.

Основные типы клеток — продуцентов цитокинов

Все клетки-продуценты цитокинов характеризуются своим собственным типом ответа на активирующие воздействия и природой активаторов, а также собственным, хотя и значительно перекрывающимся набором продуцируемых ими цитокинов (табл. 1) и теми процессами, реализацию которых они обеспечивают. [Paul W.E., Seder R.A. Lymphocyte responses and cytokines Cell, 76, 241 — 251, 1994 Review ]

В норме уровень продукции цитокинов стромальными клетками невысок. Стимулами для выработки этих цитокинов в отсутствие повреждающих и патогенных факторов служат, по-видимому, контакты с кроветворными клетками. Бактериальные продукты существенно усиливают выработку указанных цитокинов, причем это происходит не только в кроветворных органах, но и в очагах агрессии, что приводит к формированию экстрамедуллярных очагов кроветворения. В условиях активации аналогичную активность проявляют эпителиальные клетки кожи и слизистых оболочек.

Выработка цитокинов (монокинов) клетками миелоидно-моноцитарного происхождения индуцируется главным образом под воздействием бактериальных продуктов. Вызвать ее могут также многие метаболиты, сами цитокины, пептидные факторы, полиэлектролиты, а также контакты с окружающими клетками, процессы адгезии и фагоцитоза. Активация цитокиновых генов происходит в моноцитах и макрофагах в пределах 1ч, и в ближайшие часы цитокин уже можно обнаружить в среде. Среди выделяемых этими клетками цитокинов преобладают факторы, участвующие в развитии воспаления. Их называют монокинами.

Третью группу клеток — продуцентов цитокинов (лимфокинов) составляют лимфоциты. Практически все разновидности лимфоцитов способны выделять цитокины, однако «профессиональными» продуцентами их являются СD4⁺-клетки-хелперы. Покоящиеся лимфоциты не продуцируют гуморальных факторов. Активация клеток осуществляется в результате связывания антигенраспознающих рецепторов и корецепторов. Самый ранний из лимфокинов — ИЛ-2 — появляется в цитоплазме Т-клеток через 2 часа после стимуляции; остальные лимфокины вырабатываются значительно позже и в определенной последовательности: ИЛ-4 через 4 часа, ИЛ-10 через 6 часа, ИЛ-9 через 24 часа. Пик выработки различных лимфокинов варьирует: 12 ч для ИЛ-2, 48 ч для ИЛ-4 и 5, 72 ч для ИЛ-9 и ИФНг. Эта последовательность отражает процессы дифференцировки Т-хелперов.

Цитокины начинают синтезироваться клетками только при наличии чужеродного агента в организме. Это способствует развитию иммунной реакции, охраняющей постоянство внутренней среды организма от всего генетически чужеродного (рис. 1).

Рис. 1. Цитокины, общая схема действия После выделения клетками-продуцентами цитокины имеют короткий период полувыведения из кровотока. До 50% циркулирующих цитокинов интернализуется в течение 30 минут. Выведение катаболизированных цитокинов из организма осуществляется печенью и почками. Секреция цитокинов — краткосрочный процесс. Кодирующая цитокины мРНК нестабильна, что в сочетании с краткосрочностью транскрипции генов цитокинов приводит к краткосрочности их биосинтеза. [Кольман Я., Рём К. — Г., Наглядная биохимия, издательство «Мир», стр.378−379].

Говоря об особенностях цитокинов, нужно учитывать следующее:

1. Один цитокин может продуцироваться более чем одним типом клеток;

2. Одна клетка может продуцировать более чем один цитокин;

3. Один цитокин может действовать на более чем один тип клеток;

4. Более чем один цитокин может индуцировать одинаковую функцию у конкретно взятого типа клеток. [Дранник Г. Н. Клиническая иммунология и аллергология, МИА, Москва 2003 г. С. 98−99.].

Обладая широким спектром биологической активности, они определяют не только адекватный уровень иммунного ответа, но и регулируют взаимодействия главных биологических интегративных систем организма — нервной, иммунной и эндокринной.

Цитокины взаимосвязаны и образуют цельную систему взаимодействующих элементов — цитокиновую сеть.

1.1.2. Рецепторы цитокинов и механизм действия цитокинов на клетку

Цитокины действуют

· аутокринно (т.е. на клетку, которая их продуцирует);

· паракринно (на клетки, расположенные вблизи, например в очаге воспаления или в лимфоидном органе);

· эндокринно-дистанционно — на клетки любых органов и тканей после попадания цитокина в циркуляцию крови [Симбирцев А.С. // Цитокины и воспаление. 2002. № 1. С. 9−16.].

Образование и высвобождение этих высокоактивных молекул происходит кратковременно и жестко регулируется.

Одна часть цитокинов обладает плюрипотентным действием, т. е. действует на различные клетки-мишени, другая — оказывает специфическое воздействие на определенные клеточные линии. Влияние цитокинов на пролиферацию и дифференцировку клеток-мишеней подчиняется определенной последовательности; немаловажным также является концентрация и комбинация действующих цитокинов.

Цитокины — гидрофильные сигнальные вещества, действие которых опосредовано специфическими высокоаффинными рецепторами на внешней стороне плазматической мембраны, чувствительных к цитокинам клеток.

Рецепторы к цитокинам выделяют в 2 крупных семейства:

· семейство-SWISS характеризуется наличием в составе молекул внеклеточных участков с гомологичной последовательностью длиной примерно в 200 аминокислотных остатков.

SWISSPROT: CRF4_HUMAN

SWISSPROT: CYRB_HUMAN

SWISSPROT: CYRG_HUMAN

SWISSPROT: FLT3_HUMAN

К этому суперсемейству относятся рецепторы к ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-9, ИЛ-12, гранулоцитарному колониестимулирующему фактору (Г-КСФ) и гранулоцитарно-макрофагальному колониестимулирующему фактору (ГМ-КСФ). В него же входят рецепторы для гуморальных факторов (гормона роста и пролактина), действующих преимущественно вне иммунной системы.

· семейство-SITE объединяет рецепторы ко всем интерферонам, а также рецепторы к ИЛ-1б, ИЛ-1 В и макрофагальному колониестимулирующему фактору (М-КСФ):

PROSITE: RECEPTOR_CYTOKINES₁

PROSITE: RECEPTOR_CYTOKINES₁

PROSITE: PROTEIN_KINASE_ATP

PROSITE: PROTEIN_KINASE_TYR

PROSITE: RECEPTOR_TYR_KIN_III

Существуют общие групповые рецепторы, способствующие устранению избытка цитокинов в очаге поражения. [Becker S., Groner B. & Muller C.W. Three-dimentional structure of the Stat3b homodimer bound to DNA Nature, 394, 145 — 151, 1998 ]

Все рецепторы цитокинов представляют собой трансмембранные гликопротеины, у которых внеклеточная часть отвечает за связывание цитокина. Как правило, эти рецепторы состоят более чем из одной субъединицы, причем высокоаффинное связывание является следствием взаимодействия с разными субъединицами, каждая из которых сама способна связывать соответствующий цитокин, но с более низкой аффинностью. Нередко на клетках-мишенях цитокинов обнаруживаются несколько типов центров связывания, различающихся аффинностью к цитокину. В составе клеточных мембран одни цепи реагируют только с определенным цитокином, в то время как другие способны формировать общие рецепторы для разных цитокинов. Наличие общих структур в рецепторах может обусловливать функциональное сходство ряда цитокинов. [Кольман Я., Рём К. — Г., Наглядная биохимия, издательство «Мир»]

Синтез рецепторов протекает более интенсивно и длительно, чем синтез соответствующих цитокинов, что обусловливает их более полную и быструю элиминацию из сосудистого русла и реализацию биологического эффекта в очаге поражения. Растворимый рецептор, связывающийся с цитокином, — это отщепленный ферментом внеклеточный домен мембранного рецептора. Растворимые рецепторы сохраняют высокую аффинность в отношении своих лигандов и благодаря этому способны нейтрализовывать цитокины, препятствуя их доступу к интактным мембранным рецепторам; их можно обнаружить в сыворотке и моче. Растворимые рецепторы могут выполнять функции конкурирующих антагонистов, а также участвовать в транспорте, доставке цитокинов в очаг поражения и выведении их из организма.

Связывание цитокина с соответствующим рецептором обеспечивает трансмембранное проведение сигнала в клетку, что, в свою очередь, обеспечивает активацию цитоплазматических ферментов и, в частности, фосфорилирование тирозинкиназ.

Сами цитокиновые рецепторы не обладают тирозинкиназной активностью (за немногими исключениями). После связывания с цитокином (1) (см. рис. 3) молекулы рецептора ассоциируют, образуя гомодимеры. Кроме того, они могут образовывать гетеродимеры за счет ассоциации с белками-переносчиками сигнала [БПС (STP)] или стимулировать димеризацию самих БПС (2). Цитокиновые рецепторы класса I могут агрегировать с тремя типами БПС: белками GP130, в_с или г_с. Эти вспомогательные белки сами не способны связывать цитокины, но они осуществляют передачу сигнала на тирозинкиназы (3). Одинаковые спектры биологической активности многих цитокинов объясняются тем, что различные цитокин-рецепторные комплексы могут активировать одни и те же БПС. [Brisce J. et al. JAKs and STATs branch out Trends in Cell Biology, 6, 336 — 340, 1996]

Активация (фосфорилирование) тирозин/сериновых киназ приводит к запуску каскада ферментативных процессов, в результате которых в клетках накапливаются фосфорилированные белки (рис. 2). Эти белки из цитоплазмы поступают в ядро клетки и взаимодействуют с определёнными генами в молекуле ДНК, активируя процесс транскрипции этих генов и синтез соответствующих и-РНК или репликацию ДНК. Накопление и-РНК приводит, в свою очередь, к синтезу и накоплению в клетке набора новых белковых молекул, что проявляется в изменении фенотипических свойств и поведения клеток. [Кашкин К.П. Цитокины иммуной системы: основные свойства и иммунобиологическая активность (лекция) // Клиническая лабораторная диагностика. - 1998. _ № 11. — С. 21 — 32.]

Рис. 2. Упрощенная схема передачи сигнала от рецептора гамма-интерферона с использованием Jak-STAT пути В качестве примера передачи сигнала от цитокинов на рис. 3 показано, как рецептор ИЛ-6 (IL-6) после связывания с лигандом (1) стимулирует димеризацию GP130 (2). Димер мембранного белка GP130 связывает и активирует цитоплазматическую тирозинкиназу ЯК-семейства (Янус-киназы, имеющие два активных центра) (3). Янус-киназы фосфорилируют цитокиновые рецепторы, БПС и различные цитоплазматические белки, которые осуществляют дальнейшую передачу сигнала; они также фосфорилируют факторы транскрипции — переносчики сигнала и активаторы транскрипции [ПСАТ (STAT, от англ. Signal transducers and activators of transcription)]. Эти белки относятся к семейству БПС, имеющих в структуре SH2-домен, узнающий остатки фосфотирозина. Поэтому они обладают свойством ассоциировать с фосфорилированным цитокиновым рецептором. Если затем происходит фосфорилирование молекулы ПСАТ (4), фактор переходит в активную форму и образует димер (5). После транслокации в ядро димер в качестве фактора транскрипции связывается с промотором инициируемого гена и индуцирует его транскрипцию (6). [Brisce J. et al. JAKs and STATs branch out Trends in Cell Biology, 6, 336 — 340, 1996] [Кольман Я., Рём К. - Г., Наглядная биохимия, издательство «Мир»]

Рис. 3. Механизм действия цитокинов на примере ИЛ-6

Некоторые цитокиновые рецепторы могут за счет протеолиза утрачивать экстрацеллюлярный лигандсвязывающий домен (на рис. 3 не приведен). Домен поступает в кровь, где конкурирует за связывание с цитокином, что снижает концентрацию цитокина в крови. [Кольман Я., Рём К. — Г., Наглядная биохимия, издательство «Мир»].

1.1.3. Классификация цитокинов по механизму действия

К системе цитокинов в настоящее время относят около 200 индивидуальных полипептидных веществ, которые по структурным особенностям и биологическому действию делятся на несколько самостоятельных групп. Группировка цитокинов по механизму действия позволяет разделить их на следующие группы:

1 группа. Провоспалительные, обеспечивающие мобилизацию воспалительного ответа;

2 группа. Противовоспалительные, ограничивающие развитие воспаления;

3 группа. Регуляторы клеточного и гуморального иммунитета — естественного или специфического, обладающие собственными эффекторными функциями (противовирусными, цитотоксическими).

Согласно одной из принятых классификаций к цитокинам относят:

· интерфероны, представляющие собой большую группу противовирусных пептидов (IF-б, IF-в, IF-г, IF-щ, IF-ф);

· колониестимулирующие факторы, активирующие размножение и дифференцировку клеток-предшественников различных ростков гемопоэза на различных этапах их созревания (G-CSF, M-CSF, GM-CSF);

· хемокины, или хемотаксические цитокины, обеспечивающие активацию миграции разных типов лейкоцитов и некоторых других _лееток (PF-4, MIP-2, MCP-1);

· трансформирующие ростовые факторы (PD-GF, TGF-в);

· группа факторов некроза опухолей — ФНО (TNF-б, TNF-в);

· интерлейкины ИЛ 1−29 (IL 1−29). ИЛ с номерами 1−29 нельзя объединить в одну подгруппу цитокинов, связанных общностью функций, и они могут быть разделены на провоспалительные цитокины, ростовые и дифференцировочные факторы лимфоцитов и отдельные регуляторные цитокины. [Завьялов В.П. Структурно-функциональная классификация и эволюция цитокинов // Вестник РАМН. - 1993. _ №2. — С. 8 — 10.].

1.1.1.4. Интерлейкин-4

Иммунная система представляет собой комплекс клеток, взаимодействующих на основе принципов и механизмов саморегуляции, которые реализуются в значительной мере через медиаторы — цитокины.

Интерлейкины — белки, продуцируемые макрофагами и Т-лимфоцитами и обеспечивающие рост лимфоидных и, вероятно, других клеток. Эти белки различаются по физико-химическим свойствам, строению и функциональной активности. [Agui T. Stimulation of interleukin-6 production by endothelin in rat bone marrow-derived stromal cells. // Blood 1994, Vol. 84, P. 2531]

ИЛ-4 (В-клеточный стимулирующий фактор). Продуцируется активированными Т-хелперами 2-го типа.

Интерлейкин-4 впервые описан в 1982 г. Паулем, обнаружившим, что супернатант стимулированных митогеном лаконоса EL-4 клеток способен поддерживать рост B-клеток после воздействия иммуноглобулина, заставляя их вступать в S-фазу [Paul W. //Blood. 1991. V. 77. P. 1859.].

Обнаруженный цитокин, как и ИЛ-2 и ИЛ-3, относится к группе гемопоэтинов. Раньше его называли BCGFI (от англ. B-cell growth factor), т. е. фактор роста B-клеток. Он представляет собой мономер, включающий 129 аминокислотных остатков. В силу разной степени гликозилирования этого цитокина молекулярная масса колеблется от 18 кДа до 22 кДа.

Особенность ИЛ-4, отличающая его от других цитокинов, состоит в наличии видовой специфичности. ИЛ-4 человека оказывает биологическое действие на клетки человека и обезьян, но не мышей. В свою очередь ИЛ-4 мыши действует только на клетки мышей. Источником ИЛ-4 являются T-хелперы, стимулированные митогеном, тучные клетки, неидентифицированные клетки стромы костного мозга (см. рис. 4). ИЛ-4 — продукт субпопуляции активированных T-клеток — действует через специфический рецептор.

Рис. 4. Клетки-продуценты и клетки-мишени интерлейкина-4.

Основной клеткой-продуцентом интерлейкина-4 (ИЛ-4) является хелперная Т-клетка. Клетками-мишенями является широкий набор как зрелых клеток, так и клеток, находящихся на наиболее ранних стадиях гемопоэза.

Рецепторы ИЛ-4, с молекулярной массой 139 кДа, выявлен на покоящихся T-клетках, B-клетках, макрофагах, тучных клетках, на стромальных клетках костного мозга, клетках печени, мышцах, фибробластах. [http://humbio.ru/humbio/apop_cyt/00001e1d.htmKeegan A., Nelms K., Wang L., Pierce J., Paul W. // Immunol. Today. 1994. V. 15. P. 423].

Известно что ИЛ-4 усиливает экспрессию антигенов гистосовместимости II класса (MHC II) в покоящихся В-клетках, а также синтез иммуноглобулинов IgG и IgЕ после стимуляции липополисахаридом (ЛПС), поддерживает жизнеспособность и рост интактных Т-клеток, повышает активность цитотоксических Т-лимфоцитов, усиливает пролиферацию предшественников гемопоэза при ответе на ростовые факторы. Терапевтический потенциал цитокина связан с его возможностью восстанавливать клеточный и гуморальный иммунитет [Anliytsky W., Schuler M, Peschel C. // Drugs. 1994. V. 48. 5. P. 667.].

По отношению к В-клеткам ИЛ-4 выступает в качестве костимулятора пролиферации. Так, он не оказывает какого-либо влияния на покоящиеся B-клетки, однако достаточно подействовать на них одним из специфических для данных клеток индуктором активации, чтобы проявилось биологическое действие ИЛ-4: резкое повышении пролиферации данного типа клеток.

Известна также способность ИЛ-4 повышать уровень продукции IgE. Предположительно это происходит за счет усиления пролиферации клона клеток, продуцирующих данный класс иммуноглобулинов. При этом, чтобы такой клон ответил усилением продукции иммуноглобулинов, во всех случаях необходима предварительная специфическая (антигеном) или неспецифическая (митогеном) стимуляция отвечающих клеток.

Выяснилось, что ИЛ-4 способен усиливать пролиферацию и Т-клеток, относящихся к различным субпопуляциям. Его действие на Т-клетки, как и на В-клетки проявляется только после предварительной их активации антигеном или митогеном.

По своей природе ИЛ-4 выступает в качестве плейотропного регулятора, так как взаимодействует с самыми разнообразными типами клеток. Так, его действие на макрофаги проявляется в усилении экспрессии молекул II класса МНС и Fc-рецептора для IgG, приобретении противоопухолевой активности по отношению к фибросаркоме, усилении антигенпредставляющей функции. [Anliytsky W., Schuler M, Peschel C. // Drugs. 1994. V. 48. * 5. P. 667.]

Участвует ИЛ-4 и в развитии костномозговых клеток-предшественников. Один ИЛ-4 не изменяет интенсивность пролиферации этих клеток, но усиливает митотические процессы в сочетании с другими ростовыми факторами. Тандем ИЛ-4 с гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (Г-КСФ) обеспечивает более активное размножение клеток гранулоцитарного и моноцитарного ростков дифференцировки, тандем с эритропоэтином — эритроидных предшественников, с ИЛ-1 — размножение клеток-предшественников мегакариоцитарного пути развития.

Таким образом основная функция ИЛ-4 состоит в переключении синтеза IgG1 на синтез IgG4 и IgE. Совместно с другими цитокинами способствует пролиферации тканевых базофилов. Усиливает пролиферацию В-клеток, повышает экспрессию рецептора к Fc-фрагменту IgE на базофилах обоих типов, усиливает экспрессию молекул ГКГ класса II на В-клетках и макрофагах. Является антагонистом гамма-интерферона. Подавляет продукцию ИЛ-1, ФНО, ИЛ-6, ИЛ-8, ингибирует цитотоксическую активность Т-лимфоцитов, макрофагов. Относится к антивоспалительным цитокинам. [Дранник Г. Н. Клиническая иммунология и аллергология, МИА, Москва 2003 г. С. 100].

1.1.1.5. Гамма-интерферон

Интерфероны представляют собой семейство гликопептидов, которые делятся на два типа. [Дранник Г. Н. Клиническая иммунология и аллергология, МИА, Москва 2003 г. С. 107−109].

Тип 1 в свою очередь подразделяется на альфа — и бета-интерфероны, продуцируемые лейкоцитами и фибробластами соответственно.

Тип 2 интерферонов получил название гамма-интерферона. продуцируется активированными Т-лимфоцитами хелперами 1-го типа и ЕК-клетками.

Различают следующие биологические эффекты итерферонов:

а) противовирусный;

б) антипролиферативный (противоопухолевый);

в) иммуномодулирующий;

г) антибактериальный.

Противовирусный эффект интерферонов представлен на схеме 1. Как видно из схемы, связывание интерферона с рецептором индуцирует в клетке три одновременно протекающих процесса, которые заканчиваются:

1) Активацией латентной эндорибунуклеазы, приводящей к разрушению вирусной РНК;

2) Подавлением синтеза вирусной матричной РНК;

3) Подавлением синтеза белков вирусной оболочки.

Эти механизмы интегрально реализуют противовирусный эффект, приводя к подавлению репликации вируса.

Схема 1. Противовирусный эффект интерферона.

Антипролиферативный (противоопухолевый) эффект интерферонов объясняется следующими механизмами:

1. Активацией цитотоксических клеток;

2. Усилением экспрессии опухольассоциированных антигенов;

3. Модуляцией продукции антител;

4. Ингибицией действия опухолевых ростовых факторов;

5. Ингибицией синтеза РНК и белков опухолевой клетки;

6. Замедлением клеточного цикла с переходом в фазу «покоя» ;

7. Стимуляцией опухолевых клеток к созреванию;

8. Восстановлением сдерживающего контроля за пролиферацией;

9. Торможением образования новых сосудов в опухоли;

10. Ингибицией метастазирования;

11. Биомодуляцией активности цитостатиков: а) изменением метаболизма; б) снижением клиренса.

12. Преодоление лекарственной резистентности за счет ингибиции генов множественной лекарственной резистентности.

В настоящее время с помощью генной инженерии получено большое количество интерферонов, которые широко используются для лечения при вирусных и онкологических заболеваниях.

Одним из важнейших биологических эффектов интерферонов является иммуномодулирующий эффект. Установлено, что он опосредуется следующими механизмами:

1. Усилением экспрессии антигенов гистосовместимости классов I и II;

2. Регуляцией чувствительности к цитокинам;

3. Активацией цитотоксических эффекторных клеток.

В последние годы показано, что интерфероны обладают также антибактериальным эффектом, в основе которого лежит способность интерферонов индуцировать активность некоторых ферментов в пораженной клетке:

1. Индукция индоламин-2,3-дезоксигеназы приводит к снижению внутриклеточного содержания L-триптофана, что, в свою очередь, является причиной гибели бактериальной клетки в связи с нарушением метаболизма;

2. Индукция NO-синтетазы приводит к продукции N0 — мощного бактерицидного фактора, способствующего разрушению бактериальной клетки. [Дранник Г. Н. Клиническая иммунология и аллергология, МИА, Москва 2003 г. С. 107−109].

IFN типа II (иммунный IFN, ИНФ-гамма), представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 20−25 кДа и известен как иммунный интерферон, кислотолабильный, продуцируется Т-клетками и натуральными киллерами в ответ на чужеродные антигены или митогены, причем, его продукция сопряжена с бласттрансформацией этих клеток. Хорошими индукторами ИФН-гамма являются антигены таких микроорганизмов, как микобактерии туберкулеза, стафилококки, вирусы гриппа и вирусы герпеса и др., так как все они вызывают бласттрансформацию Т-лимфоцитов. [Young H.A. // Seminars in Virology. 1995. V. 6. P. 175−180.]

Хотя гамма-интерферон был открыт по способности оказывать противовирусный эффект, в дальнейшем выяснилось, что он представляет собой плейотропный лимфокин, обладающий множественным действием на рост и дифференцировку клеток самых разных типов. Например, гамма-интерферон индуцирует дифференцировку миелоидных клеток из костного мозга и клеток хронического миелолейкоза, в результате чего они приобретают Fc-гамма — рецепторы, ферменты, а также функциональные свойства более зрелых моноцитов. Важное и специфичное для интерферона свойство — способность индуцировать экспрессию антигенов MHC класса II на эндотелиальных и разнообразных эпителиальных клетках, а также клетках опухолевых линий. Гамма-интерферон стимулирует и экспрессию антигенов MHC класса I. Подобные эффекты приводят к усилению взаимодействия между иммунными Tлимфоцитами и нелимфоидными клетками, что необходимо, например, для борьбы с вирусной инфекцией.

Гамма-интерферон представляет собой и важнейший фактор, активирующий макрофаги; он способствует более эффективному уничтожению макрофагами внутриклеточных микроорганизмов, запуская поврежденные ранее микробицидные механизмы макрофагов и вызывая гибель внутриклеточных микроорганизмов (рис. 5). [Holter W., Grunow R., Stockinger H., et al.//J.Immunol.-1986.- V.136.-N.6.-P.2171.]

Рис. 5. Активация макрофагов Т — хелперами (кружки — поверхностный микробный антиген; красные квадраты — молекулы MHC класса II, волнистые линии — внутриклеточные паразиты.).

Кроме того, гамма-интерферон действует синергично с клеточным ядом, лимфотоксином, индуцируя экспрессию рецепторов лимфотоксина на клетках мишенях.

Интерферон гамма способен подавить пролиферацию клеток эритроидного ростка, выработку эритропоэтина почками и высвобождение железа из макрофагов.

Противовирусная активность гамма-ИНФ проявляется при его взаимодействии с соответствующими рецепторами на поверхности зараженных клеток, вследствие чего в этих клетках включаются гены, ответственные за синтез белков и ферментов, препятствующих самовоспроизведению вируса. Тем самым интерферон блокирует биосинтез вирусных частиц в зараженной клетке. На этом свойстве интерферона основано использование его препаратов в качестве лечебных при вирусных инфекциях.

1.2. Гнойно-воспалительных заболеваниях

1.2.1. Фурункулез

Фурункул (лат. furunculus) — острое гнойно-некротическое воспаление волосяного фолликула и окружающей его соединительной ткани. Вызывает развитие Ф золотистый, реже белый стафилококк. Важную роль в возникновении Ф играют экзогенные и эндогенные предрасполагающие факторы. Экзогенными факторами являются повреждения кожи (расчесы, ссадины, дерматит и др.), загрязнение ее частицами пыли, угля и т. д., пиодермия. Эндогенными — эндокринные нарушения (сахарный диабет, ожирение), нарушение обмена (гиповитаминоз, анемия), алкоголизм, переохлаждение и др. О фурункулезе говорят при множественном и рецидивирующем появлении и развитии Ф. Часто фурункулез возникает на фоне сопутствующего сахарного диабета. [Сетдикова Н.Х., Латышева Т. В. Комплексные механизмы развития хронического рецидивирующего фурункулеза и пути их коррекции//Иммунология. — 2000. № 3. — С.48−50.]

Фурункул может развиться на любом участке кожи, где имеются волосяные фолликулы. Наиболее частая локализации — лицо, кожа шеи, тыла кистей, поясницы. Вначале появляется плотный ярко-красного цвета воспалительный инфильтрат, возвышающийся над уровнем кожи небольшим конусом. Больные отмечают легкий зуд, умеренные боли. По мере развития Ф. инфильтрат увеличивается, нарастает гиперемия, присоединяется периферический отек. На 3−4-й день в центре инфильтрата появляются некроз и размягчение тканей, которые приобретают зеленоватый цвет, формируется некротический стержень фурункула. В этот период боли резко усиливаются, особенно при локализации в физиологически активной области (например, в области сустава), возможны повышение температуры тела, головная боль, недомогание. При благоприятном течении через 2−3дня гнойно-некротический стержень самостоятельно отторгается с образованием глубокой умеренно кровоточащей раны. Еще спустя 2−3дня рана заживает. При стертом течении процесса образуется болезненный инфильтрат без нагноения и некроза. При абсцедирующем Ф. гнойно-некротический процесс распространяется за пределы волосяного фолликула с развитием гнойной полости или флегмоны. Одиночные Ф. обычно не вызывают общей реакции и не дают осложнений, однако у больных сахарным диабетом возможно тяжелое течение процесса. Ф. может осложниться лимфангиитом, регионарным лимфаденитом, тромбофлебитом. [Кожные болезни//Под ред. Кубанова А. А. — М.:ГЭОТАР Медицина. — 1999 г. — 175−184с.]

Ведущими изменениями иммунной системы при ХРФ являются дефекты фагоцитарного и гуморального звеньев иммунитета.[А.С. Манько, Н. Х. Сетдикова, Т. В. Латышева, Ю. А. Горностаева, О. М. Котова, Н.М. Голубева «Клинико-иммунологическая эффективность серамида у больных хроническим рецидивирующим фурункулезом» //Российский Аллергологический Журнал, № 5, 2005г]

1.2.2. Остеомиелит

Остеомиелит - воспаление костного мозга, обычно распространяющееся на компактное и губчатое вещество кости и надкостницу. [Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. М.:Медицина 1994 г. С. 485−487]

По этиологическому признаку различают неспецифический О., вызываемый гноеродными микроорганизмами, и специфический, вызываемый специфической микрофлорой. В зависимости от путей проникновения возбудителей инфекции в кость выделяют гематогенный (эндогенный) и негематогенный (экзогенный) остеомиелит. Гематогенный О. возникает в результате заноса по кровеносному руслу возбудителей гнойной инфекции из отдаленного очага (острый гематогенный и первично-хронический О.). Экзогенный О. вызывается инфекцией, проникающей в кость при ранениях, операциях или за счет непосредственного перехода гнойного воспаления на кость с окружающих органов и тканей. В зависимости от механизма возникновения различают огнестрельный, посттравматический, послеоперационный и контактный остеомиелит. Огнестрельный О. является следствием огнестрельных ранений с повреждением кости. Посттравматический О. развивается при открытых переломах. Послеоперационный О. может возникнуть при оперативном лечении закрытых переломов, других операциях на костях и чаще связан с нарушением правил асептики.

По клиническому течению О. может быть острым и хроническим (вторичным), развивающимся после любого острого неспецифического О. Кроме того, различают первично-хронический О., к которому относят атипичные формы О. (склерозирующий остеомиелит Гарре, альбуминозный остеомиелит Оллье, абсцесс Броди), а также О. при некоторых инфекционных болезнях (туберкулез, сифилис и др.).

Ряд авторов выделяет антибиотический О., возникающий у ослабленных больных в процессе длительного лечения массивными дозами антибиотиков, и пострадиационный О., связанный с длительным воздействием ионизирующего излучения.

Возбудителем неспецифического О. могут быть любые микроорганизмы, но наиболее часто — аэробные гноеродные микроорганизмы стафилококковой и стрептококковой группы. Более чем в 90% случаев при остром гематогенном О. из гноя выделяют золотистый стафилококк. Отмечается увеличение числа остеомиелитов, обусловленных неклостридиальной анаэробной и грамотрицательной флорой. В редких случаях гематогенный О. имеет грибковую этиологию. [Белохвостикова Т.С., Кирдей Л. Е., Гаврилова Е. Ю., Промтов М. В., Леонова С. Н., Кирдей Е. Г. Коррекция вторичных нарушений иммунной системы при хроническом посттравматическом остеомиелите.//Медицинская иммунология, 2002, т.4, № 2, с.228−229.].

При остром гематогенном О. микрофлора из явного или скрытого первичного очага заносится током крови (бактериемия) в длинные трубчатые кости, где в широкой сети сосудов, особенно в области метафиза, замедляется скорость кровотока и микроорганизмы фиксируются в синусах губчатого вещества. При определенных условиях эти очаги могут дать вспышку гнойного О. Хронический гематогенный О. является следствием острого процесса.

Воспалительный процесс в кости может ограничиться краевой зоной — образующиеся грануляции предотвращают дальнейшее инфицирование костного мозга. При нарушении регенераторных процессов острый О. переходит в хронический. В инфицированной ране осколки костей подвергаются некрозу, становятся источниками нагноения, вокруг них образуются гнойные полости, формируются свищи, что препятствует развитию костной мозоли.

Первично-хронические (атипичные) формы О. развиваются в основном в результате воздействия слабовирулентной стафилококковой микрофлоры.

В начальной стадии острого гематогенного О. развиваются диффузный отек костного мозга и серозное воспаление, которое в дальнейшем сменяется его гнойной инфильтрацией. Процесс, имеющий характер флегмоны, распространяется вдоль кости и по направлению к надкостнице. Повышение внутрикостного давления усугубляет нарушения кровообращения кости, в результате чего происходят некроз и аутолиз костных перекладин, кортикального слоя кости, стенок каналов остеонов. Резорбция кости сопровождается появлением в ней мелких дефектов, заполненных гноем, которые сливаются в более крупные фокусы, содержащие секвестры. Тромбофлебит и тромбартериит мелких сосудов кости полностью лишают питания пораженный ее участок, в результате чего зона некроза кости увеличивается. Надкостница вначале утолщается, а затем отслаивается гноем, который проникает из костномозгового канала по костным каналам.

Если поднадкостничная флегмона кости своевременно не вскрыта, то гной прорывается в межмышечное пространство (межмышечная флегмона), переходит на подкожную клетчатку и самопроизвольно вскрывается наружу с образованием свища. Омертвевшие участки кости, находящиеся в полости гнойника, подвергаются отторжению (секвестрации). При ограниченном процессе вблизи компактного вещества кости образуются кортикальные секвестры. Они могут находиться поднадкостнично, проникать в мягкие ткани или выходить через свищевой ход наружу. Секвестры, отторгающиеся со стороны эндоста, называют центральными, или внутриполостными. Отторжение их происходит в просвет костномозгового канала. При некрозе всей толщи кости, но на ограниченном участке, образуются так называемые проникающие (перфорирующие) секвестры — один конец такого секвестра находится в костномозговом канале, а другой — в мягких тканях. В редких случаях при поражении кости по окружности может сформироваться тотальный секвестр. Секвестры препятствуют заживлению очага О. и поддерживают воспаление, т.к. сохраняющаяся в них инфекция, несмотря на применение антибиотиков широкого спектра, подавляет активность тканевых ферментов. Возможность «вживления» или рассасывания секвестра, по мнению большинства исследователей, мало вероятна.

Одновременно с воспалительно-некротическими изменениями в костной ткани происходят репаративные процессы. Участки некроза замещаются молодой костной тканью. При ограниченных некрозах кости, своевременном и комплексном лечении, преимущественно у больных молодого возраста заболевание может закончиться выздоровлением с восстановлением костной структуры. Но приблизительно у ¹/₃ больных острый остеомиелитический процесс переходит в хронический.

Атипичные формы О. характеризуются вялотекущим воспалительным поражением костей с преобладанием склеротических процессов, что приводит к сужению или полному закрытию костномозгового канала, веретенообразному утолщению диафиза кости, меньшей выраженности некроза кости и редкому образованию секвестров. Одной из таких форм является склерозирующий остеомиелит Гарре, при котором отмечают выраженное утолщение кости, отсутствие свищей и секвестров. Преобладают гиперостоз и остеосклероз с концентрическим сужением костномозгового канала. При альбуминозном остеомиелите Оллье морфологическую основу составляет небольшой деструктивный очаг в кортикальном слое кости, содержащий серозный или слизисто-белковый экссудат. Иногда имеются небольшие секвестры.

Остеомиелит как осложнение некоторых инфекционных болезней — сепсиса, брюшного тифа, бруцеллеза, туберкулеза, сифилиса — обладает специфическими для каждого из этих заболеваний морфологическими признаками. [Керко О.В., Гусева В. Н., Потапенко Е. И., Якунова О. А. и др. Роль иммунологических показателей при туберкулезе и остеомиелите позвоночника//Медицинская иммунология. — 2005. — № 2−3. С.243−244]

В доступной нам литературе не обнаружено данных об исследовании уровня цитокинов ИЛ-4, гИФН при хроническом остеомиелите и хроническом рецидивирующем фурункулезе.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы исследования

Обследовано 49 больных в возрасте от 20 до 55 лет с ГВЗ различной локализации: из них 34 — с хроническим рецидивирующим фурункулезом и 15 — с хроническим остеомиелитом в стадии обострения. Клиническое обследование больных включало тщательный сбор аллергоанамнеза.

Контрольную группу составили 10 доноров без гнойно-воспалительных заболеваний, сопоставимые по полу и возрасту.

Объектом исследования служила сыворотка крови. Забор крови производился с 8.00 до 10.00 часов.

Кровь центрифугировали при 1500 об/мин в течении 15 мин. Из эксперимента исключалась гемолизированная и хилёзная (содержащая жировые включения) сыворотка.

Полученную сыворотку использовали в качестве источника ИЛ-4 и г-интерферона.

2.2. Методы исследования

Исследование проводилось на базе лаборатории иммунологии и аллергологии ГОУ ДПО Пензенский институт усовершенствования врачей Росздрава.

2.2.1. Метод определения уровня интерлейкина-4 в сыворотке крови

Для определения уровня ИЛ-4 использовался метод твердофазного иммуноферментного анализа‚ с использованием набора реактивов «ИФА-IL-4» фирмы ВЕКТОР-БЕСТ. Набор «ИФА-IL-4» предназначен для определения концентрации ИЛ-4 в сыворотке крови в клинических, диагностических и научно-исследовательских лабораториях.

Состав набора:

¦ комплект из двенадцати восьмилуночных стрипов с рамкой с иммобилизованными на внутренней поверхности лунок моноклональными антителами к интерлейкину-4, маркирован «Стрипы с моноклональными антителами» ;

¦ 7 калибровочных проб, содержащих известные количества интерлейкина-4 — 0; 12,5; 25; 50; 100; 200 и 400пгмл, лиофилизованные препараты;

¦ аналитический буферный раствор, маркирован «Буфер А», 1 флакон;

¦ концентрированный раствор антител анти-IL-4-биотин, маркирован «Антитела», 1 флакон;

¦ концентрированный раствор конъюгата авидин-пероксидаза, маркирован «Конъюгат Е», 1 флакон;

¦ концентрированный буферный раствор для промывок лунок, маркирован «Буфер Р», 1 флакон;

¦ субстратный буфер, маркирован «Буфер С», 1 флакон;

¦ 10% кислота, маркирована «Стоп-реагент», 1 флакон;

¦ раствор тетраметилбензидина, маркирован «ТМБ» ;

Дополнительные материалы и оборудование:

¦ автоматические одноканальные пипетки с изменяемым объемом отбора жидкостей: от 0,005 до 0,01 мл; от 0,05 до 0,25 мл; от 0,2 до 1 мл; от 1 до 5 мл;

¦ одноканальная полуавтоматическая пипетка, позволяющая отбирать объемы жидкости до 0,3 мл.

¦ прибор для встряхивания рамки со стрипами (шейкер), позволяющий производить встряхивание с амплитудой колебания 3−4мм и частотой 4−6 Гц при комнатной температуре (+16−25°С), либо статируемый шейкер, позволяющий производить встряхивание в том же режиме при температуре +37°С;

¦ спектрофотометр, позволяющий измерить оптическую плотность раствора в стрипах при длине волны 450нм;

¦ цилиндры, позволяющие отмерять 10 и 100 мл;

¦ два стеклянных стакана емкостью 20 мл и один — 150 мл;

¦ дистиллированная вода.

Принцип работы набора.

В наборе «ИФА-IL-4» использован «сэндвич» вариант твердофазного иммуноферментного анализа. Для реализации этого варианта использованы два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к интерлейкину-4. Одно из них иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок), второе конъюгировано с биотином. На первой стадии анализа IL-4, содержащийся в калибровочных и исследуемых пробах связывается с антителами, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок. На второй стадии анализа иммобилизованный IL-4 взаимодействует с конъюгатом вторых антител — биотин. Количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству IL-4 в исследуемом образце. На последней стадии анализа в лунки вносят авидин-пероксидазу.