Ферменты микроорганизмов. 
Основы микробиологии

Ферменты «есть в полном смысле возбудители жизни», — писал академик И. П. Павлов. Все биохимические реакции в клетках совершаются только при участии этих биологических катализаторов. Ферменты — это белки: простые и сложные, состоящие из белка и небелкового компонента (кофактора). В состав сложных белков могут входить различные металлы: железо, кобальт, медь, цинк и др. и простатическая группа (кофермент), которая может быть представлена органическими соединениями, витаминами или их производными, азотистыми основаниями и др. Простатическая группа обусловливает активность ферментов, а белковая часть — избирательные свойства.

Ферментов огромное множество, что объясняется спецификой их действия: конкретный фермент взаимодействует только с конкретным веществом и, соответственно, катализирует только одно превращение. Например, фермент лактаза катализирует расщепление только молочного сахара (лактозы) на глюкозу и галактозу и не действует на другие углеводы; фермент каталаза расщепляет только пероксид водорода с образованием воды и свободного кислорода и т. д.

Ферменты чрезвычайно активны. Небольшого количества фермента достаточно на огромную массу субстрата. Например, грамм амилазы при благоприятных условиях может превратить в сахар тонну крахмала. Интересно, но сами ферменты в реакции нс расходуются. Характерной особенностью ферментов, отличающей их от неорганических катализаторов, является их специфичность действия: известная фраза: «субстрат и фермент подходят друг к другу, как ключ к замку» характеризует это как нельзя лучше.

Катализируемая ферментом реакция начинается со связывания субстрата с белковой частью фермента в определенном ее участке — активном центре. Образуется комплекс «фермент — субстрат». По окончании реакции образовавшийся комплекс фермента с продуктами реакций распадается с освобождением исходного фермента и конечных продуктов ферментативного процесса. Ферменты отличаются неустойчивостью к воздействию некоторых факторов внешней среды, что объясняется белковой природой ферментов. Потеря ферментами активности называется инактивацией (от лат. in — не + activus — действенный).

Важнейшим фактором, определяющим активность ферментов, является температура. По мере повышения температуры скорость ферментативной реакции растет, но до определенного предела, при достижении которого начинает происходить денатурация ферментного белка. Концентрация активного фермента в субстрате начинает постепенно уменьшаться, и чем выше температура, тем быстрее происходит разрушение фермента, ферментативная реакция замедляется и далее прекращается.

Некоторые ферменты способны после тепловой инактивации восстанавливать свою каталитическую активность. Ход ферментативной реакции при различных значениях температуры можно охарактеризовать следующим образом: с одной стороны — ускорение химической реакции, с другой — повышение скорости инактивации фермента. Оптимальная температура максимальной активности ферментов зависит от условий и продолжительности реакции, вида ферментов и др., например у холодолюбивых микроорганизмов температурный оптимум значительно ниже, чем у теплолюбивых. Уровень температуры, вызывающий денатурацию различных ферментов, также неодинаков. Для одних ферментов это 40—50°С, для других (термоустойчивых) — 70 °C и более. Но температура 100 °C почти для всех ферментов является критической, они инактивируются.

В условиях температур, близких к нулю и ниже, ферментные реакции замедляются, скорость снижается достаточно значительно. Многие реакции совсем останавливаются, хотя при низких температурах ферменты не разрушаются. Некоторые ферменты «работают» даже в замороженных продуктах. Ультрафиолетовые лучи и радиоактивные излучения инактивируют ферменты. Большое влияние на ход ферментативных процессов оказывает pH среды. Для одних ферментов лучшей является среда со слабокислой реакцией, для других — со слабощелочной.

На активность ферментов влияет присутствие в среде химических соединений. Есть вещества, которые ускоряют ферментативную реакцию, они называются активаторы. Другие вещества, способные снижать или полностью останавливать ферментный процесс, называются ингибиторы. Активаторами ферментов служат металлы (Си, Mg, Со и др.), органические вещества, например витамины. Соли тяжелых металлов, антибиотики, сероводород являются ингибиторами ферментов. Одна из версий сущности действия ингибиторов заключается в том, что они могут соединяться активными центрами ферментов и препятствовать тем самым связыванию с ферментом субстрата.

Концентрации субстрата и фермента также влияют на скорость процесса. Когда фермент оказывается в недостатке, скорость ферментативной реакции падает, но если фермент взят в избытке, скорость реакции также уменьшается.

Все биохимические процессы, протекающие в микробных клетках, регулируются ферментами, поэтому любой фактор, действующий на активность фермента, будет действовать и на сам микроорганизм. Среди ферментов микроорганизмов много таких, которые встречаются и у растений, и у животных, но существуют и ферменты только «микробиологического происхождения».

Ферменты микроорганизмов делятся на конститутивные и адаптивные. Конститутивные ферменты являются обязательными для данного вида, а адаптивные (индуцируемые) вырабатываются клеткой только в условиях необходимости. Например, микроорганизм, не использующий для питания конкретное соединение, можно приучить его использовать (естественно, при наличии сооответствующих генов в геноме), если только это вещество будет источником какого-либо важного элемента, а других источников не будет. Например, культивируя микроорганизм, не использующий мальтозу, в среде только с этим сахаром (т.е. в качестве единственного источника углерода) можно «научить» синтезировать фермент мальтазу, чего раньше он не делал (это также объясняет уникальные способности микроорганизмов в области питания).

В живой клетке действие ферментов происходит упорядоченно, строго согласованно. Ферменты расположены в различных клеточных структурах (мезосомах, митохондриях, цитоплазматической мембране и др.). Некоторые ферменты выделяются микроорганизмами наружу (в окружающую среду), их называют экзоферменты (от греч. ехо — вне, снаружи). Происходит как бы внеклеточное переваривание — т. е. расщепление сложных веществ, содержащихся в субстрате, па простые, способные проникнуть в клетку. Ферменты, находящиеся внутри клетки и не выделяющиеся ею в окружающую среду, называют эндоферменты (от греч. endon — внутри). Эти ферменты участвуют только во внутриклеточных процессах обмена веществ.

Хотя ферменты вырабатываются клеткой только при жизни, они временно остаются в активном состоянии и после ее гибели. Например, под действием собственных ферментов происходит автолиз (от греч. autos — сам + lysis — растворение) погибших микробных клеток. Процесс саморастворения (самопереваривания) микробных клеток иод влиянием внутриклеточных ферментов — естественный этап в разрушении живого в цепи круговорота веществ в природе. Как уже говорилось о роли микроорганизмов в минерализации всего ушедшего из жизни живого, микроорганизмы — «мусорщики». Процесс автолиза объясняет великую мудрость природы — после гибели микроорганизмов их клетки разлагать некому, поэтому они делают это сами.

На внеклеточной активности ферментов основано использование ферментных препаратов микробного происхождения в различных биохимических производствах. Но эта же активность может приводить и к негативным результатам: например, при отсутствии живых клеток в контаминированном продукте его качество может снижаться за счет действия ферментов погибших микроорганизмов.

С самого начала открытия ферментов их названия носили случайный характер. Например, фермент, расщепляющий крахмал, был назван диастазом, а фермент желудочного сока, расщепляющий белки, — пепсином. Позднее названия ферментов стали составлять из корней слов, обозначающих вещества, на которые действует фермент, добавляя к нему окончание «аза». Фермент, расщепляющий крахмал (амилум), назвали амилазой, фермент, разлагающий мальтозу, — мальтазой и т. п. Наряду с этим ферменты называют, но химическим процессам, которые они катализируют. Например, ферменты, катализирующие отщепление водорода от субстрата (дегидрогенерирование), называют дегидрогеназами, а расщепляющие сложные органические соединения путем гидролиза — гидролазами.

В соответствии с действующей в настоящее время классификацией ферментов (Правила номенклатуры ферментов, принятые в 1972 г.) все ферменты разделены на шесть классов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы и лигазы.

Классы ферментов подразделяют на подклассы и подподклассы. Каждый фермент имеет название и шифр из четырех цифр, в настоящее время известно более 2000 ферментов.

• 1. Оксидоредуктазы — это ферменты, которые катализируют окислительно-восстановительные реакции, протекающие в ходе дыхания и брожения микроорганизмов. К ним относятся:
  • • дегидрогеназа, катализирующая реакцию дегидрогенерирования органических соединений: происходит отщепление водорода, который передается дегидрогеназой какому-либо другому веществу (акцептору водорода), одновременно одно вещество окисляется, а другое восстанавливается. Дегидрогеназы делят на анаэробные и аэробные. Аэробные дегидрогеназы, передающие водород субстрата только непосредственно кислороду, называют оксидазами;
  • • пероксидаза, катализирующая окисление органических веществ с помощью пероксида водорода или каких-либо органических пероксидов;
  • • каталаза — фермент, расщепляющий пероксид водорода на воду и молекулярный кислород. В процессе дыхания нередко образуется пероксид водорода — вещество, ядовитое для самой клетки.
• 2. Трансферазы — ферменты переноса, катализирующие перенос атомных группировок, радикалов, частей молекул от одного соединения к другому. Примерами являются:
  • • фосфотрапсферазы — ферменты, катализирующие перенос остатков фосфорной кислоты с одного вещества па другое вещество. Большинство реакций переноса фосфатных групп протекает с участием аденозин три фосфата (АТФ) и аденозиндифосфата (АДФ). Эти реакции имеют большое значение, благодаря им осуществляется перенос энергии с одного вещества на другое. АТФ имеет макроэнергитические (богатые энергией) связи;
  • • аминотрансферазы — ферменты, осуществляющие реакции переаминирования, т. е. межмолекулярный перенос аминогруппы NH₂ с аминокислот на кетокислоты. В состав кофермента входит витамин В₆.
• 3. Гидролизы — ферменты, катализирующие реакции расщепления и синтеза сложных органических веществ (белков, липидов, полисахаридов) по типу гидролитических реакций с участием воды. Примером являются карбогидразы — ферменты, катализирующие гидролиз и синтез гликозидов, ди-, трии полисахаридов. Например, мальтаза катализирует расщепление мальтозы на две молекулы глюкозы, сахараза катализирует расщепление сахарозы на глюкозу и фруктозу, лактаза катализирует расщепление лактозы (молочный сахар) на галактозу и глюкозу. Из гидролаз, действующих на полисахариды, наибольшее значение имеют следующие:
  • • амилаза — фермент, катализирующий гидролиз крахмала. Амилазы находятся в плесневых грибах и многих бактериях. Дрожжи не содержат амилаз, поэтому расщеплять крахмал «не умеют»;
  • • глюкоамилаза — фермент, расщепляющий крахмал, образуя преимущественно глюкозу и небольшое количество декстринов;
  • • целлюлоза — фермент, гидролизующий целлюлозу (клетчатку) с образованием дисахарида целлобиозы, который при участии фермента целлобиазы расщепляется на две молекулы глюкозы. Целлюлаза встречается в грибах и некоторых бактериях;
  • • пептидазы — протеолитические ферменты, которые катализируют гидролиз белков (пептидов). Каждая пептидаза разрывает пептидные связи между конкретными аминокислотами;
  • • дезаминазы и амидазы — ферменты, катализирующие гидролитическое расщепление аминокислот, которое идет с отщеплением азота в виде аммиака: аспарагииаза катализирует гидролиз аспарагина на аспарагиновую кислоту и аммиак, глутаминаза вызывает гидролиз глутамина с образованием аммиака и глутаминовой кислоты;
  • • эстеразы — ферменты, катализирующие реакции синтеза и расщепления эстеров (сложных эфиров). Эстеразы встречаются у многих микроорганизмов. Важную роль в обмене веществ микроорганизмов играют следующие эстеразы: липазы — ферменты, вызывающие гидролиз жиров на глицерин и высокомолекулярные жирные кислоты; фосфатазы — многочисленные ферменты, расщепляющие фосфорсодержащие органические соединения, что сопровождается высвобождением фосфорной кислоты.

К гидролазам относятся пектолитические ферменты, которые гидролизуют пектиновые вещества. Например, пектиновые вещества находятся в растениях в виде нерастворимого протопектина, входящего в состав клеточных стенок. При участии протопектиназы, пектинэстеразы, полигалактуроназы происходит гидролиз протопектина и растворимого пектина. При этом образуются метиловый спирт, галактуроновые кислоты и др. Пектолитические ферменты имеются у многих плесеней и у некоторых бактерий. Развитие микроорганизмов, содержащих пектолитические ферменты, приводит к мацерации тканей плодов и овощей, их размягчению, вплоть до растворения.

• 4. Лиазы — ферменты, которые катализируют негидролитическое расщепление органических веществ с образованием двойных связей, а также реакции присоединения атомов и групп атомов по двойным связям: они сопровождаются отщеплением от субстрата углекислого газа, воды, аммиака. Например, пируватдекарбоксилаза — фермент, катализирующий отщепление С0₂ от пировиноградной кислоты с образованием уксусного альдегида.
• 5. Изомеразы — ферменты, катализирующие превращение органических соединений в их изомеры: триозофосфатизомераза, глюкозофосфатизомераза. Оба фермента участвуют в первых стадиях превращения глюкозы в процессах дыхания и брожения.
• 6. Лигазы — ферменты, катализирующие реакции синтеза из простых соединений более сложных. Эти реакции требуют больших затрат энергии и обычно протекают одновременно с расщеплением пирофосфатной (макроэргической) связи в АТФ: карбоксилазы катализируют при участии

АТФ присоединение С0₂ к органическим кислотам, глутаминсинтетаза и аспарагинсинтетаза — ферменты синтеза глутамина и аспарагина из NH-. и соответствующих аминокислот. Лигазы чрезвычайно важны в обмене веществ микроорганизмов.

Широкое применение микроорганизмов в различных производствах, в основном пищевых, основано на использовании их ферментативной деятельности в перерабатываемом сырье. Культуры микроорганизмов можно заменить ферментами, выделив их в виде препаратов из клеток или культуральной среды. Применение ферментов в промышленности позволяет интенсифицировать технологические процессы, повышать выход продукции, улучшить ее качество. Использование микроорганизмов для получения ферментов имеет ряд преимуществ по сравнению с растительным и животным сырьем:

• • микроорганизмы обладают богатым ассортиментом ферментов. Среди микробных ферментов есть такие, которые отсутствуют у животных и растений;
• • микроорганизмы очень быстро размножаются и в течение короткого времени позволяют получить огромное количество клеток, из которых (или из культуральной среды) можно выделить большое количество фермента;
• • микроорганизмы растут на относительно дешевых субстратах, например на отходах различных промышленных производств;
• • управлять развитием микроорганизмов при современном аппаратурном оформлении таких производств значительно легче и проще, чем выращивать растения и животных.

В настоящее время во многих отраслях промышленности ферменты микробного происхождения вытесняют ферменты растительного и животного происхождения. Десятки различных ферментов в виде индивидуальных ферментных белков и технических препаратов разной степени очистки производятся в промышленном масштабе с использованием культур плесневых грибов, бактерий, дрожжей.

Примером использования ферментов микробного происхождения является производство этилового спирта, когда в сырье, содержащее крахмал, вместо зернового солода добавляют амилолитические ферменты из грибов. При производстве хлеба солод заменяют ферментами микробного происхождения, при этом повышаются качество изделий, их органолептические показатели. При производстве пива использование ферментов позволяет заменить солод.

Использование глюкоамилазы из грибов позволяет из крахмала получать глюкозу и патоку. При производстве соков и вин пектолитические грибные ферменты используются для разрушения пектинов, что ускоряет процесс выделения сока и повышает его выход. При производстве сыра вместо сычужного фермента используются ферменты микробного происхождения. Имеется опыт использования пептидаз микробного происхождения для размягчения мяса, ускорения его созревания, в различных технологических процессах при переработке сырья.